摘要：植物CAX（Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和CCS（銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白）分別是重要的液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和銅伴侶蛋白，通過(guò)不同機(jī)制在緩解重金屬脅迫中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)滇水金鳳（Impatiens uligino.sa）對(duì)銅脅迫具有很好的耐受性，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出耐銅相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，本研究以野生滇水金鳳為材料，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆獲得耐銅相關(guān)基因CAX3和CCS，分別命名為丸CAX3和IuCCS，其cDNA序列長(zhǎng)度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439個(gè)和324個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，IuCAX3為不穩(wěn)定蛋白，具有。aca2超家族的保守結(jié)構(gòu)域，定位在質(zhì)膜、液泡上：luCCS為穩(wěn)定蛋白，具有PLN02957超家族的保守結(jié)構(gòu)域，定位在葉綠體上。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，IuCAX3和IuCCS均與喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)基因聚為一支，相似性分別為98.18%和89.81%。通過(guò)設(shè)置不同的銅處理濃度（0、5、10、15、20、25 mg·L-L）研究了IuCAX3和IuCCS基因在滇水金鳳葉片中的表達(dá)情況，qRT-PCR分析結(jié)果表明，銅處理能誘導(dǎo)兩個(gè)基因大幅上調(diào)表達(dá)，且銅濃度為15 mg·L-1時(shí)的上調(diào)幅度最大，并均在處理12 d達(dá)到最高水平；隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，IuCAX3的表達(dá)量先升高后降低，IuCCS的表達(dá)量在銅濃度不高于15 mg·L-1時(shí)呈先升后降再升的趨勢(shì)，但當(dāng)銅濃度高于15 mg·L-1后則呈先升后降的趨勢(shì)，而且銅處理下IuCCS的表達(dá)水平明顯高于Iu-CAX3，因此推測(cè)IuCAX3基因主要在銅脅迫前期起作用，而IuCCS基因在銅脅迫后期仍發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果可為深入研究滇水金鳳耐銅分子機(jī)制提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滇水金鳳：CAX3基因：CCS基因：銅脅迫：基因克隆；生物信息學(xué)分析：表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S681.1： Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 10-0010-08

銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，在葉綠素形成、光合作用、呼吸作用中的電子傳遞、氧化脅迫保護(hù)以及蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。然而，吸收過(guò)多的銅也會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，超過(guò)一定閾值甚至?xí)?dǎo)致植株死亡。研究發(fā)現(xiàn)，部分植物在長(zhǎng)期適應(yīng)銅脅迫的過(guò)程中形成了規(guī)避或耐受銅離子毒害的防御機(jī)制，包括利用液泡的隔離和區(qū)室化作用以及啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)等途徑來(lái)緩解銅離子毒害。植物細(xì)胞通過(guò)將細(xì)胞質(zhì)中過(guò)量的離子區(qū)域化至液泡中來(lái)維持其正常的膨壓，從而提高植物的抗逆性，液泡膜上的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ca2+/H+exchanger，CAX）即在此過(guò)程中發(fā)揮作用，能夠?qū)|(zhì)中的Ca2+區(qū)域化至液泡內(nèi)，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，以維持植物體內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)平衡。另外，CAX對(duì)植物抵御重金屬脅迫也是至關(guān)重要的。研究表明，鎘（Cd）處理下，水稻6個(gè)CAX基因在葉和莖中均強(qiáng)烈表達(dá)，且在根中的表達(dá)量隨Cd濃度的增加而增加，其中，OsCAXla和Os-CAXlc促進(jìn)而OsCAX4抑制酵母中Cd的積累，推測(cè)這三個(gè)基因很可能參與了水稻對(duì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。另一種有效應(yīng)對(duì)銅離子毒害的策略是啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)來(lái)清除多余的活性氧（ROS）以抵御氧化脅迫。擬南芥的AtCAX3通過(guò)提高Ca離子濃度來(lái)降低ROS，從而提高對(duì)Cd的耐受性。銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）是一個(gè)包含Cu/Zn二聚體的蛋白質(zhì)，在結(jié)合銅離子時(shí)催化O-2·發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，在清除ROS抵御重金屬脅迫過(guò)程中起著非常重要的作用。銅對(duì)Cu/Zn-SOD的作用發(fā)揮是不可或缺的，但在正常生理?xiàng)l件下植物需要通過(guò)銅伴侶蛋白獲得銅。銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白（copper chaperone for Cu/Zn - SOD，CCS）是一類(lèi)可溶性金屬結(jié)合蛋白，其功能是將銅傳遞給脫輔基的Cu/Zn-SOD并激活此酶。研究表明，銅濃度超過(guò)一定值時(shí)擬南芥莖和根中AtCCS的表達(dá)量升高，推測(cè)CCS蛋白在調(diào)控植物體內(nèi)銅離子平衡過(guò)程中發(fā)揮作用。

滇水金鳳（Impatiens uliginosa）是鳳仙花科鳳仙花屬一年生或多年生草本植物，生長(zhǎng)于云南、貴州和廣西等地的潮濕林下、水溝邊及溪流旁，具有花色鮮艷、花期長(zhǎng)、生物量大、根系發(fā)達(dá)且抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是集觀(guān)賞和生態(tài)價(jià)值于一體的重要花卉材料。滇池是我國(guó)典型的淺水型高原湖泊，水體中的銅平均濃度遠(yuǎn)超非污染自然水體中的銅平均濃度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，作為滇池流域的鄉(xiāng)土植物，滇水金鳳對(duì)銅有很好的耐性，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到其耐銅相關(guān)基因。鑒于目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)滇水金鳳耐銅基因研究的相關(guān)報(bào)道，本研究基于前期研究，克隆出滇水金鳳CAX3和CCS基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行分析，同時(shí)采用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同濃度銅脅迫下的滇水金鳳葉片中的表達(dá)模式，以探討兩基因在滇水金鳳響應(yīng)銅脅迫中的功能，從而為深入探究滇水金鳳耐銅分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為利用鄉(xiāng)土植物修復(fù)銅污染水體提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及銅脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì)

野生滇水金鳳采自云南省昆明市撈魚(yú)河濕地公園。2022年6月在西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園大棚對(duì)滇水金鳳進(jìn)行扦插擴(kuò)繁，60 d后挑選生長(zhǎng)一致的植株，清水培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液再培養(yǎng)7d，然后對(duì)其進(jìn)行銅脅迫處理，即在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中分別添加0、5、10、15、20、25mg·L-1

CuSO4·SH2O，并分別在處理第0、6、12、18、24天采集葉片，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 滇水金鳳總RNA的提取與CAX3、CCS基因的克隆

利用植物總RNA提取試劑盒（Omega）提取滇水金鳳葉片的總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen）合成cDNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基于前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的滇水金鳳耐銅基因CAX3和CCS的CDS序列設(shè)計(jì)正、反向引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，然后以滇水金鳳的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：10 μmol/L正向和反向引物各0.4 μL，2x Taq PCR StarMix（Dye） 10 μL， cDNA模板lμL，ddHCO補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min;變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)：72℃10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 .5%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收目的條帶，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，最后挑選陽(yáng)性菌液送生工生物下程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 滇水金鳳CAX3和CCS基因的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用ExPASy在線(xiàn)軟件對(duì)CAX3和CCS蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析：運(yùn)用SMART在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域：采用TMHMM 2.0在線(xiàn)軟件進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)：采用WoLF PSORT在線(xiàn)軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)：利用SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：借助SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其三維空間結(jié)構(gòu)：利用BLAST、DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，并用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.4 銅脅迫下滇水金鳳CAX3和CCS基因的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)滇水金鳳CAX3和CCS基因在不同濃度銅脅迫處理下的表達(dá)情況。根據(jù)CAX3、CCS和內(nèi)參基因Actin的cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表2），利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）進(jìn)行基因表達(dá)分析。反應(yīng)體系：10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL， Hieff@ qPCR SYBR Green Master Mix（NoRox） 10 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min；變性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量，采用Microsoft Excel 2019和SPSS27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin 26.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇水金鳳CAX3和CCS基因的克隆

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得滇水金鳳CAX3和CCS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別為1 320 bp和975bp（圖1），分別編碼439 aa和324 aa。將兩個(gè)基因分別命名為IuCAX3和IuCCS。

2.2 IuCAX和IuCCS蛋白的理化性質(zhì)及序列分析

由表3可見(jiàn)，IuCAX3蛋白分子量為48 503.55Da，屬于不穩(wěn)定的酸性蛋白，定位在質(zhì)膜和液泡上：IuCCS蛋白的分子量為34 536.12 Da，屬于穩(wěn)定的偏酸性蛋白，定位在葉綠體上。TMHMM 2.0分析結(jié)果表明，IuCAX3蛋白序列具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而IuCCS蛋白序列無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。運(yùn)用NCBI CDD對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，IuCAX3具有caca2超家族的保守結(jié)構(gòu)域，IuCCS具有PLN02957超家族的保守結(jié)構(gòu)域。兩蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲組成，在IuCAX3中的占比分別為53 .99%、2.73%、13.67%、29.61%，在IuCCS中的占比分別為32.72%、6.17%、20.06%、41.05%（圖4）。運(yùn)用SWISS-MODEL對(duì)IuCAX3和IuCCS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.3 IuCAX3和IuCCS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)來(lái)自不同物種的CAX3和CCS蛋白分別進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)IuCAX3和IuCCS分別與喜馬拉雅鳳仙花（I.glandulifera）的CAX3和CCS同源性最高，相似性分別為98.18%和89.81%。通過(guò)MECA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖6），分析表明Iu-CAX3和IuCCS均分別與喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)蛋白聚為一支，親緣關(guān)系最近：同時(shí)還發(fā)現(xiàn)滇水金鳳兩個(gè)蛋白均與杜鵑花科杜鵑花屬和越橘屬部分植物的相應(yīng)蛋白親緣關(guān)系較近，如IuCAX3與圓葉杜鵑（Rhododendron williamszanum）、朱紅大杜鵑（R．griersonianum）、杜鵑（R．simsii）、常綠越橘（Vaccinium darrowii）、高叢越橘（V.corymbosum）等的CAX3蛋白親緣關(guān)系較近，IuCCS與羊躑躅（R．molle）、圓葉杜鵑、常綠越橘等的CCS蛋白親緣關(guān)系較近。

2.4 銅脅迫下IuCAX3和IuCCS基因的表達(dá)分析

qRT-PCR分析結(jié)果（圖7）顯示，銅處理能大幅上調(diào)滇水金鳳葉片中IuCAX3和IuCCS基因的表達(dá)，且均以15mg·L-1處理的表達(dá)水平顯著高于其他濃度處理：兩基因間比較，IuCCS的表達(dá)水平明顯高于IuCAX3。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，IuCAX3的表達(dá)量先升高后降低，當(dāng)銅濃度不高于15 mg·L-1時(shí)在處理第12天達(dá)到峰值，而當(dāng)銅濃度超過(guò)15mg·L-1時(shí)則推遲至第18天達(dá)到峰值，處理第24天的表達(dá)量均明顯下降：而IuCCS的表達(dá)量在不高于15 mg·L-1的銅處理下呈先升后降再升的變化趨勢(shì)，在高于15 mg·L-1的銅處理下則先升后降，但各處理第24天的表達(dá)量均較高。綜上推測(cè)，兩基因在滇水金鳳抵御銅脅迫過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用，但I(xiàn)uCAX3主要在銅脅迫前期發(fā)揮作用，而Iu-CCS則在銅脅迫后期發(fā)揮的作用更為顯著。序列號(hào)前字母組合代表物種。RW：圓葉杜鵑（Rhododendron wil-liamsianum）；RC：朱紅大杜鵑（Rhododendron griersonianum）；RS：杜鵑（Rhododendron simsii）；VD：常綠越橘（Vaccinium darrowii）；vc：高叢越橘（Vaccinium corymbosum）；IG：腺柄鳳仙花（Impatierzsglandulifera）；AC：變色耬斗菜（Aquilegia coerulea）；CC：黃連（Cop-tis chinensis）；AO：石刁柏（Asparagus officinalis）；EG：油棕（Elaeisguineensis）；AS：深圳擬蘭（卻ostasia shenzhenica）；DC：黃石斛（Dendrobium catenatum）；PE：小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis eques-tris）；PM：稷（Panicum miliaceum）；ZP：沼生菰（Zizania palustris）；JE：燈芯草（Juncus effusus）；CL：康藏嵩草（Carex littledalei）；RP：刺子莞屬植物Rhynchospora pubera；AF：卷毛馬兜鈴（Aristolochiafimbriata）；RM：羊躑躅（Rhododendron molle）；JR：胡桃（Juglarzs re-gia）；QS：歐洲栓皮櫟（Quercus suber）；QR：夏櫟（Quercus robur）；DA：參薯（Dioscorea alata）；DZ：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）：PD：海棗（Phoenix dactylifera）；PH：黍?qū)僦参铮≒anicum halllii）；PV：柳枝稷（Panicum virgatum）；SB：高粱（Sorghum bicolor）；LP：黑麥草（Lolium perenne）；TD：野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）；PP：小立碗蘚（Physcomitrium patens）；SM：江南卷柏（Selaginella moellendorffii）；NC：蜂猴（Nycticebus coucang）。

3 討論與結(jié)論

CAX和CCS基因在植物非生物脅迫如重金屬脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。本研究從野生滇水金鳳中克隆得到IuCAX3和IuCCS基因，cDNA序列長(zhǎng)度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439 aa和324 aa。IuCAX3屬于不穩(wěn)定蛋白，這與張國(guó)香等在紫花苜宿中的研究結(jié)果一致：IuCCS屬于穩(wěn)定蛋白，這與唐欣等在牡丹中的研究結(jié)果一致。IuCAX3蛋白序列具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與紫花苜蓿和甘藍(lán)型油菜的部分CAXs -致，而IuCCS蛋白序列中無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。IuCAX3定位在質(zhì)膜、液泡上，這可能與其通過(guò)水解ATP供能可將細(xì)胞質(zhì)中的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中的功能相關(guān)：而IuCCS與結(jié)縷草ZjCCS、水稻OsCCS等一樣，均定位在葉綠體上，推測(cè)CCS是葉綠體的靶向蛋白。

系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，滇水金鳳的IuCAX3和IuCCS均與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)蛋白聚為一支，相似性分別為98. 18%和89. 81%。除此之外，杜鵑花科杜鵑花屬植物的CAX3和CCS也分別與IuCAX3和IuCCS聚在同一個(gè)大支上，親緣關(guān)系也較近，這可能與滇水金鳳所屬的鳳仙花科與杜鵑花科同屬于杜鵑花目有關(guān)。

CCS和CAX3基因在不同植物中的表達(dá)特征具有較大差異，大部分與重金屬脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，參與了植物抗重金屬脅迫的應(yīng)答機(jī)制。CAX家族基因在不同植物如小花南芥、長(zhǎng)夜紅砂、越橘等中都參與鎘脅迫響應(yīng)。CCS基因在模式植物擬南芥中的研究較深入，表明在受銅脅迫后其表達(dá)量有增加趨勢(shì)：芭蕉MaCCS啟動(dòng)子區(qū)存在大量非生物脅迫響應(yīng)元件，且其在Cu處理下上調(diào)表達(dá)，表明MaCCS參與Cu脅迫響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，滇水金鳳的丸CAX3和Iu-CCS基因在銅處理下均大幅上調(diào)表達(dá)，且IuCCS的表達(dá)量明顯高于IuCAX3：隨著銅濃度的增加，兩基因的表達(dá)量均先顯著升高后顯著降低，15mg·L-1銅處理下的表達(dá)量顯著高于其他濃度處理。液泡吸收重金屬離子是植物緩解重金屬脅迫的主要機(jī)制，質(zhì)膜上含有較多CAXs有助于提高植物在高濃度重金屬脅迫下的存活率。本研究中銅處理下丸CAX3上調(diào)表達(dá)，可使滇水金鳳更好地抵御銅脅迫。據(jù)報(bào)道，滇水金鳳在銅脅迫下的SOD活性隨銅濃度的增加呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，這與本研究中IuCCS的表達(dá)趨勢(shì)一致。但隨著銅處理時(shí)間的延長(zhǎng)，IuCAX3和丸CCS表達(dá)水平的變化趨勢(shì)存在差異，IuCAX3的表達(dá)量均先升高后降低，第24天的表達(dá)量明顯降低：而Iu-CCS的表達(dá)量在銅濃度不高于15 mg·L-1時(shí)呈先升后降再升的變化趨勢(shì)，在銅濃度超過(guò)15 mg·L-1時(shí)則先升高后降低，但處理第24天的表達(dá)量仍較高。推測(cè)IuCAX3主要在銅脅迫前期起作用，Iu-CCS則在銅脅迫后期發(fā)揮主要作用。

綜上，本研究從滇水金鳳中克隆了耐銅基因IuCAX3和丸CCS基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和銅脅迫下的表達(dá)分析，初步證明了兩者在滇水金鳳耐銅過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但其具體的作用機(jī)制以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待深入研究。本研究結(jié)果可為探究滇水金鳳耐銅分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為利用鄉(xiāng)土植物修復(fù)銅污染水體提供新的理論依據(jù)。

基金項(xiàng)目：云南省農(nóng)業(yè)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（202IOIBD070001-018）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060364，32060366）；云南省園林 植物遺傳改良與高效繁育博士生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（503210103）