摘要：柑橘黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)中最具毀滅性的病害，通過田間小區(qū)試驗，評估了葉面噴施和灌根施用聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG）、2，2-二溴-3-次氮基丙酰胺（DBNPA）、0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）和枯草芽孢桿菌M23菌株對柑橘黃龍病的防治效果。結(jié)果表明：在黃龍病初侵染時，使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施處理可有效抑制其病情的發(fā)展；在黃龍病侵染后期，使用DBNPA、NK或M23灌根處理可有效降低感病植株的病情級別，并減少柑橘葉片內(nèi)亞洲韌皮部桿菌（CLas）的濃度。研究結(jié)果為柑橘黃龍病的田間防控提供了可供選擇的新藥劑。

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍病；防治效果；化學(xué)防控；生防菌

中圖分類號：S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）11-0055-05

Control Effect of Three Fungicides and One Biocontrol Bacteria on Citrus Huanglongbing

HAN Shi-qi1，SUN Zi-xiang1，LI Jing1，TANG Tao2，ZHAO Ming-ping3，QIU Fa-jin3，YI Tu-yong1

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 3. Jianghua County Agriculture and Rural Bureau， Yongzhou 425500， PRC）

Abstract： Citrus Huanglongbing is the most devastating disease in the citrus industry. In this study， a field plot experiment was conducted to evaluate the control effects of leaf spraying and root irrigation with polyhexamethylene guanidine （PHMG）， 2，2-dibromo-3-nitrilopropionamide （DBNPA）， 0.2% bacteriostatic soluble polysaccharide （NK）， and Bacillus subtilis M23 on citrus Huanglongbing. The results show that leaf spraying with PHMG or DBNPA can effectively inhibit the development of the disease during the early stage of Huanglongbing. At the later stage of Huanglongbing， root irrigation treatments with DBNPA， NK， or M23 are effective in reducing the disease level of susceptible plants and the concentration of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas） in citrus leaves. The results provide a new drug for field control of citrus Huanglongbing.

Key words： citrus Huanglongbing; control effect; chemical prevention and control; biocontrol bacteria

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是一種嚴(yán)重危害柑橘產(chǎn)業(yè)的病害，被稱為柑橘“癌癥”。其病原菌為革蘭氏陰性細(xì)菌[1]，分為3個亞種，即亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas）、美洲種（Candidatus Liberibacter americanus，CLam）和非洲種（Candidatus Liberibacter africanus，CLaf）[2-4]，

中國境內(nèi)發(fā)生的柑橘黃龍病病原菌屬亞洲種。目前，仍無有效根治黃龍病的方法，在生產(chǎn)上常使用“種植無毒苗木、防控柑橘木虱和清除病樹”的“三板斧”防治手段來控制黃龍病的危害。筆者通過評估3種殺菌劑及1種生防菌在葉面噴施和灌根2種不同施藥方式下對柑橘黃龍病的田間防治效果，觀察其病情級別的變化，并通過熒光定量PCR的方法檢測其葉片內(nèi)菌濃度的變化，旨在為柑橘黃龍病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2023年9月到2024年3月在湖南省永州市江華縣白芒營鎮(zhèn)柑橘園進(jìn)行。供試品種為愛媛38號（果凍橙），樹齡5 a。

供試藥劑有25%液體聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG–25）（廣州云麗生物科技有限公司）和2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）（山東優(yōu)索化工科技有限公司），以上藥劑均市場購買；0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）（南開大學(xué)徐鳳波研究員提供），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）M23（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院園藝作物病害研究室分離獲得，施用前活化）。

供試儀器主要有常規(guī)PCR儀、實時熒光定量PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、離心機(jī)等。

1.2 試驗設(shè)計

通過常規(guī)PCR檢測確定其陽性植株，對其進(jìn)行掛牌標(biāo)記，以供后續(xù)施藥試驗、樣品采集和外觀分級調(diào)查。植株編號及施用藥劑等信息見表1。

葉面噴施第1～4次施藥時間為9月11日、10月2日、10月23日、11月13日。每次施藥前進(jìn)行上一次施藥后的取樣工作，最后一次葉面噴施取樣時間為12月4日。灌根第1～4次施藥時間為10月23日、11月13日、12月4日、12月25日。每次施藥前進(jìn)行上一次施藥后的取樣工作，最后一次灌根取樣時間為翌年3月19日。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃龍病檢測 將采集的葉片取中脈，剪碎研磨，取適量樣本使用CTAB法提取DNA。使用常規(guī)PCR方法檢測黃龍病。HLB檢測引物使用黃霖霄等[5]改良的OI1/OI2c–gj特異性引物，OI1：5'–GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA–3'；OI2c–gj：5'–TCGCGACTTCGCAACCCAT–3'，產(chǎn)物長度為1 167 bp。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min，（95℃，45 s；55℃，30 s；72℃，60 s）35個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，確定陽性樣本。

1.3.2 病情級別調(diào)查 柑橘黃龍病病情分級調(diào)查的標(biāo)準(zhǔn)參考袁亦文等[6]的方法，病情級別共分為6級，0級：全樹無病；1級：1～2個梢有斑駁黃化葉片出現(xiàn)；2級：部分側(cè)枝或主枝有斑駁黃化癥狀，癥狀枝占全樹的1/3以下；3級：癥狀側(cè)枝或主枝占全樹的1/3以上和2/3以下；4級：癥狀枝在2/3以上；5級：全樹死亡。在每次施藥前及最后一次取樣前，對植株黃龍病病情級別調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

1.3.3 黃龍病菌表達(dá)量變化分析 通過實時熒光定量PCR的方法進(jìn)行CLas相對表達(dá)量變化分析，使用的特異性引物為HLBas（5'–TCGAGCGCGTATGCAATACG–3'）/HLBr（5'–GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG–3'）[7]，使用的柑橘內(nèi)參基因引物為CsCOX–F（5'–GTATGCCACGTCGCATTCCAGA–3'）/CsCOX–R（5'–GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC–3'）[8]，每個DNA樣品進(jìn)行3次重復(fù)。實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃延伸10 s，60℃退火30 s，延伸和退火40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將生成標(biāo)準(zhǔn)曲線圖、擴(kuò)增曲線圖、濃度和樣品Ct值。

使用2-△△Ct法計算CLas相對表達(dá)量的變化程度，使用樣本的CLas產(chǎn)物Cq值–樣本的內(nèi)參基因產(chǎn)物Cq值得到樣本的△Ct值，再使用施藥后樣本的△Ct值–未施藥樣本的△Ct值得到△△Ct值，通過公式2-△△Ct計算得到CLas相對表達(dá)量。結(jié)果大于1說明樣本內(nèi)CLas表達(dá)量上調(diào)，結(jié)果小于1則說明樣本內(nèi)CLas表達(dá)量下調(diào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理柑橘黃龍病病情級別變化

葉面噴施處理組病情級別調(diào)查結(jié)果見表2，該處理組中存在4株初始病情級別為1的患病植株（2號、8號、9號和12號植株），其中2號、8號和9號植株在每次施藥后并無病情加重的趨勢，而陽性對照（CK+）12號植株病情級別隨時間變化加重。在初始病情級別為4的各處理中除3號和7號植株病情級別略有下降，其余均無明顯變化。結(jié)果表明葉面噴施PHMG或DBNPA在HLB初始病情級別較低時對其有一定的抑制效果，可在短期內(nèi)減緩病情的發(fā)展，但在HLB初始病情級別較高時，葉面噴施PHMG、DBNPA或NK均無法有效抑制黃龍病的發(fā)展。

灌根處理組病情級別調(diào)查結(jié)果見表3，灌根處理組中所有植株的初始病情級別均為4級，經(jīng)過4次施藥處理后，DBNPA處理的病情級別降低較為明顯，分別降至1級和2級；NK處理的效果稍差，病情級別分別降至2級和3級；M23處理中2株降低至2級，2株降低至3級；陽性對照中均無病情級別的降低。

綜合上述結(jié)果表明，灌根處理的效果要優(yōu)于葉面噴施處理，特別是2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）和0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）通過灌根處理表現(xiàn)出更好的效果，枯草芽孢桿菌（M23）在不同重癥植株中均發(fā)揮效果，有效降低了植株的病情級別，但其效果不穩(wěn)定，可能由于其受土壤環(huán)境影響較大。

2.2 不同處理植株CLas相對表達(dá)量變化

葉面噴施處理組的CLas相對表達(dá)量見表4，所有處理在4次施藥后的CLas相對表達(dá)量均有不同程度的提升，說明葉面噴施各處理均不能完全抑制黃龍病菌的增殖擴(kuò)散。結(jié)合病情級別調(diào)查結(jié)果，初始病情級別為1級的陽性對照12號植株CLas相對表達(dá)量呈現(xiàn)逐步大幅度上升，第4次施藥后較施藥前的CLas基因表達(dá)量提升至45.53倍，與病情級別提升的變化一致。而初始病情級別同為1級的2號、8號和9號植株在4次施藥后的CLas相對表達(dá)量分別為1.64、3.69和4.09，顯著低于陽性對照12號植株的CLas相對表達(dá)量，說明以上3個處理均有效抑制了CLas在初侵染植株中的增殖擴(kuò)散，但不能使其濃度降低。綜合上述，葉面噴施的5種處理雖不能降低病株帶菌量，但對處于初侵染階段的柑橘苗木使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施處理可有效抑制CLas的增殖擴(kuò)散，使其在葉片中的濃度增長緩慢，其中PHMG的效果要優(yōu)于DBNPA。

灌根處理組的CLas相對表達(dá)量見表5，在4次施藥后NK處理、DBNPA處理以及M23處理的19、20號植株CLas相對表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，其中M23處理的19號植株CLas相對表達(dá)量在第4次施藥后有一定程度的回升，說明以上3種處理的6棵植株在施藥后CLas濃度降低。其中枯草芽孢桿菌M23處理的21、22號植株在4次施藥后的CLas相對表達(dá)量上調(diào)，與該處理的19、20號植株結(jié)果不同，說明該菌可能受土壤環(huán)境影響較大。結(jié)合灌根處理組的病情級別調(diào)查結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在4次施藥后DBNPA處理的CLas相對表達(dá)量和病情級別均下降最多，說明該處理的灌根治療效果最優(yōu)，NK處理次之，M23處理對HLB的治療效果受環(huán)境影響較大。

綜合上述，對于HLB初侵染的植株，使用PHMG或DBNPA進(jìn)行葉面噴施可在一定程度上減緩HLB的發(fā)展，但不能降低植株中CLas的濃度；對于HLB侵染后期的植株，葉面噴施處理無法有效緩解HLB病情，使用NK、DBNPA或M23灌根處理可有效緩解HLB病情，且可降低植株中CLas的濃度，其中M23的效果受環(huán)境影響較大。

3 討論與結(jié)論

感染黃龍病的柑橘植株會逐年減產(chǎn)，果實品質(zhì)下降，直至植株死亡，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[9]。該病可由柑橘木虱傳播[10]，在柑橘抽梢期柑橘木虱活動旺盛，此期間如果防控柑橘木虱不及時，則很可能大范圍感染黃龍病[11-12]。目前沒有可以根治黃龍病的方法，且由于其致病菌在實驗室內(nèi)尚無建立純培養(yǎng)的成熟體系，因此該病的防治藥劑篩選工作進(jìn)展緩慢。研究通過在田間使用葉面噴施和灌根2種施藥方式，評估了3種殺菌劑和1種生防菌對柑橘黃龍病陽性植株的防治效果，篩選出可以有效降低黃龍病陽性植株內(nèi)CLas濃度的藥劑（DBNPA和NK）及生防菌（M23），并明確了灌根處理對于柑橘黃龍病的治療效果更優(yōu)。

柑橘植株感染黃龍病后，一方面，韌皮部發(fā)生堵塞導(dǎo)致光合產(chǎn)物難以運輸，造成淀粉和可溶性糖在葉片中積累[13]，其田間癥狀與缺鐵、缺鋅等缺素癥狀極其相似[14]，難以在田間做出準(zhǔn)確診斷；另一方面，該病原主要寄生在韌皮部細(xì)胞內(nèi)，可通過維管束到達(dá)根部，在根中定殖并引發(fā)根部腐敗[15]。目前，黃龍病常用的診斷方法為常規(guī)PCR檢測[16]。Zhang等[17]認(rèn)為土壤農(nóng)殘含量高、pH酸化或堿化、鹽漬化、有機(jī)質(zhì)含量低等原因是導(dǎo)致柑橘黃龍病加重的原因，提出了基于土壤修復(fù)改良為主的黃龍病綜合防治技術(shù)，并通過實踐證明了土壤修復(fù)改良對感染黃龍病的柑橘植株可以較為明顯地提高產(chǎn)量并改良了品質(zhì)。這側(cè)面說明了柑橘黃龍病植株通過根部治愈的可能性，由于葉片中有較多淀粉與胼胝質(zhì)的積累，藥劑難以從葉片吸收并傳導(dǎo)到根部，而從根部直接施藥則更容易被植株吸收，與研究中灌根處理較葉面噴施處理效果更好的結(jié)果一致。Ma等[18]提出黃龍病是一種免疫介導(dǎo)疾病，黃龍病菌觸發(fā)的活性氧產(chǎn)生位于富含韌皮部的樹皮組織中，隨后伴隨細(xì)胞和篩細(xì)胞的全身細(xì)胞死亡，這也是黃龍病導(dǎo)致柑橘死亡的主要原因。研究中通過添加赤霉素可上調(diào)編碼過氧化氫的清除酶基因和下調(diào)NADPH氧化酶。最為重要的是，用赤霉素或抗氧化劑（尿酸、蘆丁）噴灑受黃龍病影響的柑橘葉片可降低韌皮部組織中的過氧化氫濃度和細(xì)胞死亡，并減輕黃龍病癥狀。

研究結(jié)果表明，使用0.2%抑菌性可溶性多糖（NK）或2，2–二溴–3–次氮基丙酰胺（DBNPA）對黃龍病樹灌根處理可降低其葉片內(nèi)CLas相對表達(dá)量，并降低其病情級別。使用枯草芽孢桿菌M23菌株活化后的菌液對柑橘黃龍病樹灌根處理亦存在一定的治療效果，但其效果或受環(huán)境影響較大。使用25%液體聚六亞甲基胍鹽酸（PHMG–25）或DBNPA進(jìn)行葉面噴施，能在一定程度上減緩病情級別較低的黃龍病樹的病情發(fā)展，并延緩CLas的增值速度。研究結(jié)果為柑橘黃龍病防治藥劑的篩選提供了參考，但仍需擴(kuò)大試驗范圍，并探究其抑制CLas的原理，從而實現(xiàn)其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）