摘要：百香果（Passiflora edulis Sims）雖原產(chǎn)熱帶地區(qū)，但高溫也會(huì)影響其開花坐果，進(jìn)而影響產(chǎn)量。果實(shí)糖含量不僅影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)，還可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與高溫、干旱、鹽害等逆境脅迫。蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，在植物糖積累及非生物脅迫響應(yīng)中具有重要功能。對(duì)百香果SUS基因家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，并分析其在低溫脅迫下的表達(dá)變化。運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)百香果蔗糖合成酶基因進(jìn)行全基因組鑒定與基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、蛋白質(zhì)保守功能域、染色體定位分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)分析其在高溫處理下的表達(dá)。結(jié)果顯示，百香果中包含5個(gè)SUS基因，分布在4條染色體上，外顯子數(shù)量為13～15個(gè)。5個(gè)SUS基因家族成員可分為三大類，即SUSⅠ、SUSⅡ、SUSⅢ，百香果SUS基因家族成員啟動(dòng)子中含有激素響應(yīng)、逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。表達(dá)模式分析表明，PeSUS3基因在百香果葉片和果皮中的表達(dá)量均較高。qRT-PCR分析表明，PeSUS1、PeSUS2基因在高溫處理后表達(dá)量顯著下降，PeSUS5基因表達(dá)量顯著性上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因可能在百香果高溫脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：百香果；蔗糖合酶；高溫脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S667.901文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）11-0045-06

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，別名雞蛋果、洋石榴等，原產(chǎn)于大、小安的列斯群島，目前廣泛種植于我國廣東、海南、福建、云南、臺(tái)灣等省份［1］。百香果具有很高的食用、觀賞和藥用價(jià)值，近年來在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)得到廣泛推廣［2-3］。

可溶性糖含量是果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)形成的主要因素，果實(shí)中的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等［4-5］。高等植物在進(jìn)行光合作用的過程中會(huì)產(chǎn)生大量蔗糖，蔗糖合成酶（sucrose Synthase，SUS）則在植物蔗糖代謝生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累有著重要影響［6］。蔗糖合成酶最早是在小麥胚芽中被發(fā)現(xiàn)的［7］，主要起分解蔗糖的作用，參與植物生長發(fā)育的多個(gè)過程，如源、庫組織之間蔗糖的分配［8］、淀粉的生物合成［9］、植物纖維素的合成［10］、非生物脅迫響應(yīng)［11］等。

近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，許多植物的基因組信息被破譯，為SUS基因家族成員的鑒定奠定了基礎(chǔ)。陳成等從海沃德獼猴桃基因組中鑒定出7個(gè)SUS成員，發(fā)現(xiàn)AdSUS2.2與果實(shí)中蔗糖、果糖、葡萄糖含量的相關(guān)性最高，說明其是調(diào)控獼猴桃果實(shí)蔗糖合成積累的重要基因［12］。王亞娜等鑒定了6個(gè)檸檬蔗糖代謝關(guān)鍵酶ClSUS基因家族成員，qRT-PCR分析表明，ClSUS4基因?qū)幟使麑?shí)可溶性糖積累可能具有重要作用［13］。呂佳紅等從梨中鑒定出17份SUS基因家族成員，qRT-PCR分析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，PbrSUS2、PbrSUS15可能參與調(diào)控梨果實(shí)的蔗糖合成與積累［14］。

百香果基因組測(cè)序在2021 年完成［1］，這表明在全基因組水平上進(jìn)行百香果相關(guān)基因家族分析成為可能。何銳杰等從百香果基因組中鑒定出11個(gè)CHS基因家族成員，發(fā)現(xiàn)PeCHS基因在果皮顏色的形成及逆境脅迫條件下發(fā)揮重要作用［15］。Liang等研究鑒定了138個(gè)百香果bHLH基因家族成員，篩選出可能調(diào)控不同花器官和果實(shí)發(fā)育的PebHLHs基因，其中許多基因在不同脅迫處理下存在表達(dá)差異［16］。百香果SUS基因家族成員的鑒定與分析迄今未見報(bào)道。本研究基于基因組信息對(duì)百香果SUS基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析其在高溫脅迫下的表達(dá)變化，以期為百香果SUS基因功能的進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年4—5月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物細(xì)胞與分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 百香果SUS基因家族成員的鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取擬南芥SUS蛋白序列，從國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）獲取百香果基因組序列［1］。選用模式植物擬南芥的SUS基因成員蛋白序列為query，在百香果的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源對(duì)比，條件設(shè)定為E值lt;1×10-5，篩選出百香果SUS基因家族候選序列，進(jìn)一步利用NCBI-CCD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/#table）對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，將僅含有蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域（sucrose-synth，PF00862）和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（glycos-transf-1，PF00534） 的蛋白序列作為百香果SUS基因家族候選序列［17］。

1.3 百香果SUS基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

運(yùn)用TBtools軟件進(jìn)行百香果蔗糖合成酶（SUS）蛋白理化性質(zhì)分析。通過DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）、SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 在線軟件，分別預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位情況。

1.4 百香果SUS基因的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和保守motif分析

運(yùn)用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）網(wǎng)站在線分析預(yù)測(cè)百香果SUS家族成員的染色體定位；運(yùn)用TBtools軟件分析百香果SUS家族成員的基因結(jié)構(gòu)；運(yùn)用MEME Suite在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預(yù)測(cè)百香果SUS蛋白保守Motif圖，Motif 數(shù)量設(shè)置為8，其余參數(shù)默認(rèn)不作設(shè)置。將擬南芥、水稻的SUS基因家族成員與百香果的進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用 MEGA 11軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)1 000次，其余參數(shù)默認(rèn)不作設(shè)置。

1.5 百香果SUS基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

利用Tbtools 提取基因成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 的序列，利用 P1antCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 進(jìn)行PeSUS基因順式作用元件預(yù)測(cè)，并進(jìn)一步利用Tbtools進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.6 百香果SUS基因家族成員的表達(dá)模式分析

基于從NCBI獲得的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA634206）和筆者所在課題組保存的百香果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析百香果SUS基因家族成員在不同品種果皮和葉片中的表達(dá)模式?；贔PKM（每 1 000 個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片）定量分析各基因表達(dá)水平，并利用TBtools軟件繪制表達(dá)熱圖。

1.7 百香果SUS基因在高溫處理下的表達(dá)分析

對(duì)苗齡為2個(gè)月的欽蜜9號(hào)百香果幼苗進(jìn)行40 ℃高溫脅迫處理6 h，以28 ℃生長的植株為對(duì)照，處理、對(duì)照各設(shè)3株。處理完成后，取相同部位的百香果葉片樣品并立即用液氮冷凍，在-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA；cDNA合成按照TransGen的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行［15］。選用Pe60S基因作為內(nèi)參基因［18］，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)各基因的表達(dá)量水平，所用引物序列見表1。所用試劑為SYBR GreenⅠ Master Mix （TaKaRa），所用儀器為LightCycler 96 Real-Time PCR Systems（Roche）。使用2-ΔΔCT方法［19］計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，并利用SPSS軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。利用Prism 9軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果SUS基因家族成員的鑒定

由表2可知，從百香果基因組中鑒定出5個(gè)SUS成員，命名為PeSUS1～PeSUS5。其中PeSUSs基因長度為3 968～6 765 bp；但其編碼區(qū)長度變化較小，為2 391～2 520 bp。G+C含量為0.40～042，A+T含量為0.58～0.60。

2.2 百香果SUS蛋白理化性質(zhì)分析

由表3可知，PeSUS5基因有最少的氨基酸數(shù)（796個(gè)）、分子量（91 523.73 u），PeSUS2有最多的氨基酸數(shù)（839個(gè)）、分子量（96 524.79 u）；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在5.37～6.89之間，均＜7，說明均為酸性蛋白；5個(gè)家族成員的不穩(wěn)定系數(shù)均在40以下，說明這些蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，其中PeSUS2基因具有最強(qiáng)的穩(wěn)定性；脂肪系數(shù)為84.50～94.64；平均親水性系數(shù)均為負(fù)值，說明百香果SUS基因家族蛋白均為親水性蛋白；由亞細(xì)胞定位分析可見，百香果SUS基因表達(dá)產(chǎn)物大部分定位于細(xì)胞質(zhì)中，因此可推測(cè)該家族蛋白主要參與胞質(zhì)基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

2.3 百香果SUS基因家族染色體定位分析

如圖1所示，百香果5個(gè)SUS基因分布在1、4、6、9號(hào)染色體上，其中9號(hào)染色體上有2個(gè)成員，其余3條染色體上各含有1個(gè)成員。

2.4 百香果SUS基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白質(zhì)的保守基序分析

如圖2所示，百香果SUS基因家族成員含有內(nèi)含子數(shù)量較多，介于12～14個(gè)之間；其中PeSUS3基因最多，含有14個(gè)，PeSUS2基因最少，含有12個(gè)。

由圖3可知，百香果SUS基因家族成員之間所包含的保守基序的種類、數(shù)量、位置均存在不同程度的差異，大致可分為3類，成員PeSUS1包含 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19；成員PeSUS3、PeSUS4相較于成員PeSUS1多了Motif 18；成員PeSUS2、PeSUS5相較于成員PeSUS3、PeSUS4多了Motif 20。其中 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19的保守性最高，因此Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19是百香果蔗糖合酶基因編碼蛋白的重要組件。

2.5 百香果SUS基因家族的進(jìn)化分析

將擬南芥SUS基因家族、水稻SUS基因家族、百香果SUS基因家族成員進(jìn)行多序列比對(duì)，其進(jìn)化樹如圖4所示。結(jié)果顯示，SUS基因家族共分為3個(gè)亞家族，其中PeSUS2、PeSUS4、PeSUS5屬于SUSⅠ亞家族，PeSUS1屬于SUSⅢ亞家族，PeSUS3屬于SUSⅡ亞家族。

2.6 百香果SUS基因家族成員啟動(dòng)子的順式作用元件分析

如圖5所示，PeSUS基因家族共鑒定出16種不同順式作用元件，包括參與干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)、低溫、分生組織表達(dá)、光、茉莉酸甲酯、胚乳表達(dá)、赤霉素、創(chuàng)傷、缺氧特異性誘導(dǎo)增強(qiáng)子、防御和脅迫、生長素、水楊酸、脫落酸、厭氧誘導(dǎo)、蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和玉米代謝順式作用元件，大致可分為3類，即生長發(fā)育相關(guān)、激素相關(guān)、逆境相關(guān)，表明PeSUS家族在百香果的不同生長階段以及應(yīng)對(duì)不同的環(huán)境條件都具有重要的作用。其中，生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件占比最多，尤其是光順式作用元件，說明PeSUS家族對(duì)百香果生長發(fā)育調(diào)控具有重要作用。

2.7 百香果SUS基因家族成員的組織表達(dá)模式分析

如圖6所示，百香果SUS各基因在葉片中的表達(dá)量有差別，其中PeSUS3基因的表達(dá)量最高，PeSUS5基因的表達(dá)量位于其次，PeSUS1、PeSUS2基因的表達(dá)量較低，PeSUS4基因在葉片中幾乎不表達(dá)；推測(cè)PeSUS3對(duì)百香果葉片生長具有一定作用。5個(gè)成員在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)果皮中的表達(dá)趨勢(shì)與葉片中基本一致。

2.8 百香果SUS基因在高溫處理下的表達(dá)分析

如圖7所示，對(duì)欽蜜9號(hào)百香果進(jìn)行6 h的高溫脅迫處理后，對(duì)其PeSUS基因進(jìn)行表達(dá)分析。其中，PeSUS1、PeSUS2基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)（Plt;0.05），PeSUS5基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)（Plt;001）；而PeSUS3基因的表達(dá)量有所下降，PeSUS4基因的表達(dá)量有所上升，但兩者表達(dá)量變化均無顯著性差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，百香果SUS基因家族中含有5個(gè)成員，其數(shù)量與目前已發(fā)現(xiàn)的一些物種相似，即擬南芥有6個(gè)［17］、水稻有7個(gè)［20］、檸檬有6個(gè)［13］、辣椒有5個(gè)［21］等。5個(gè)家族成員基因結(jié)構(gòu)相似，進(jìn)化分析結(jié)果顯示，百香果中的SUS成員分為3個(gè)亞家族，類似的結(jié)果在擬南芥［17］、豌豆［9］、無籽蜜柚［22］[JP+1]中都有發(fā)現(xiàn)。基因的組織表達(dá)模式與其功能特征密切相關(guān)，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開展的基因表達(dá)模式分析表明，PeSUS3基因在百香果2個(gè)品種的葉片、果皮中表達(dá)量均最高，推測(cè)此基因在百香果生長發(fā)育過程中可能擔(dān)任較為重要的角色，但未來還需進(jìn)一步探究該基因的具體生理作用和調(diào)控機(jī)制等。

前人的相關(guān)研究已經(jīng)表明，SUS家族成員在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，例如BoSUS1a、BoSUS1b基因表達(dá)水平在低溫處理后的耐冷甘藍(lán)CT-923葉片中急劇升高［23］，干旱脅迫下發(fā)菜Sus2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量逐漸增加［24］。部分研究的啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，百香果SUS基因家族成員啟動(dòng)子存在大量的逆境響應(yīng)元件，暗示該家族基因可能也會(huì)參與百香果的逆境脅迫響應(yīng)。高溫處理后PeSUS1、PeSUS2基因的表達(dá)量顯著下降，PeSUS5基因的表達(dá)量極顯著上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因在高溫脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究從百香果基因組中鑒定出5個(gè)PeSUS基因家族成員， 其編碼的氨基酸具有不同的理化性質(zhì)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示5個(gè)PeSUS蛋白被分為3個(gè)亞家族，且亞家族Ⅰ中包含3個(gè)成員。PeSUS3基因在2個(gè)品種葉片和果皮中的表達(dá)量最高，很可能在百香果葉片蔗糖合成和運(yùn)輸中發(fā)揮作用。PeSUS3基因的生物學(xué)功能還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證，期待本研究結(jié)果可為PeSUS候選基因功能的深入研究提供理論基礎(chǔ)，為百香果的分子育種提供一定的理論依據(jù)和基因資源。

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