摘要：從青海野生中國(guó)沙棘根際土壤中篩選出具有解磷能力的菌株，為挖掘根際解磷促生菌株創(chuàng)造條件。利用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離，篩選出在有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌株，利用平板劃線法對(duì)菌株進(jìn)行純化。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA分子鑒定法，鑒定出1株蜂房哈夫尼亞菌、2株不動(dòng)桿菌、3株沙雷氏菌，并對(duì)其解有機(jī)磷、解無(wú)機(jī)磷、種子發(fā)芽率以及促生能力等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。培養(yǎng)3 d，6株菌株溶解有機(jī)磷圈為7.21～13.57 mm，溶解無(wú)機(jī)磷圈為3.83～7.67 mm，解有機(jī)磷量為9.37～15.79 μg/mL，解無(wú)機(jī)磷量為5.29～8.49 μg/mL，以菌株W2、W6的效果最佳，顯著高于其他菌株。經(jīng)平板促生試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，解磷菌可提高蕹菜種子發(fā)芽率，W2處理的蕹菜種子發(fā)芽率最高，培養(yǎng)后3、5 d其發(fā)芽率分別為83%、97%，較CK分別提高15.3%、16.9%，W6處理次之。解磷菌可顯著提高蕹菜生長(zhǎng)發(fā)育，其中菌株W2、W6的促生效果顯著，其鮮重分別為0.22、0.21 g，較CK增加22.2%、16.7%。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)后得出，不同解磷菌處理下蕹菜的生長(zhǎng)狀況均得到一定程度的改善，發(fā)芽率得到顯著提高，其中W2、W6處理的效果最好。

關(guān)鍵詞：中國(guó)沙棘；菌種鑒定；解磷菌；根際促生菌；生長(zhǎng)發(fā)育；蕹菜

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）11-0247-07

中國(guó)沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi）別稱黑刺、酸柳、酸刺、吉漢等，廣泛分布于我國(guó)干旱半干旱地區(qū)［1］，抗逆性強(qiáng)，具有抗風(fēng)沙、保持水土的特性，在我國(guó)北方環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著重要作用［2］。中國(guó)沙棘根際土壤中存在大量的微生物，其根系分泌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可供微生物吸收利用［3］。土壤中的微生物通過(guò)趨化感應(yīng)向富含根系分泌物的區(qū)域靠近，使得根際微生物的豐富度和多樣性遠(yuǎn)高于非根際微生物，因此，研究根際微生物與植物之間的相互作用備受關(guān)注［4-6］。大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌可顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的提高［7-9］。郝亞妮等采用解磷菌與秸稈配施，發(fā)現(xiàn)這種方法可以提高苦蕎的發(fā)芽率且可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)［10］。王金昌等發(fā)現(xiàn)，將解磷菌定植于蕹菜根際可促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，蕹菜鮮重較不施用解磷菌明顯增加［11］。謝越盛等分離出4株具有溶磷活性的菌株，發(fā)現(xiàn)其均可促進(jìn)蕹菜的生長(zhǎng)發(fā)育、提高植株對(duì)磷的吸收，其中3BY11菌株處理后的蕹菜生物量增加35.9%［12］。Doilom等分離的10株解磷菌，在接種后，90%的植株都展現(xiàn)出體外溶解簡(jiǎn)單過(guò)磷酸鈣（SSP）和磷酸一銨（MAP）的功能，將該解磷菌作為這些磷源的溶磷菌，有助于更好地利用過(guò)磷酸鈣和磷酸一銨，降低農(nóng)業(yè)投入成本和土壤中過(guò)量的磷造成的不良影響［13］。Hameeda等利用泥炭作為生長(zhǎng)載體，接入5種不同解磷菌并共同培育一段時(shí)間后，在玉米盆栽試驗(yàn)中接種，發(fā)現(xiàn)玉米生物量及產(chǎn)量均得到提高［14］。近些年來(lái)的研究表明，植物根際中分離的解磷菌菌株在提高種子發(fā)芽率、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)、改善土壤特性等方面起著重要的作用［15-17］。

目前，中國(guó)沙棘的相關(guān)研究主要聚集在有益成分提取與生物學(xué)特性等方面［18-20］，對(duì)其根際促生菌的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究從青海野生中國(guó)沙棘根際土壤中分離出具有解磷功能的促生菌株，對(duì)其進(jìn)行生理生化、分子鑒定，并開(kāi)展種子發(fā)芽試驗(yàn)和促生試驗(yàn)，以期為研發(fā)適應(yīng)高原農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需的高效生物菌肥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑 革蘭氏染液、磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗壞血酸溶液、鉬酸鹽溶液、鉬銻抗顯色劑。

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基 本試驗(yàn)的培養(yǎng)基主要包括普通肉湯培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣土采集 按照“S”形采樣法，于2021年8月在青海省大通縣（37.144 3°N，101.273 3°E，海拔2 900 m）用土壤鉆采集土壤表層0～20 cm中國(guó)沙棘根際土壤，制成混合土樣，保存在4 ℃冰箱中，用于根際解磷菌的分離、純化與鑒定。供試土壤為沙質(zhì)土壤，土壤電導(dǎo)率EC值（土水比1 ∶5）為 3.05 mS/cm，pH值（土水比1 ∶2.5）為7.65，土壤養(yǎng)分含量分別為：有機(jī)質(zhì)5.13 g/kg、全氮 0.34 g/kg、全磷0.87 g/kg、全鉀3.82 g/kg。伴生植物有西藏沙棘、金露梅等。

1.2.2 菌種分離篩選 在無(wú)菌環(huán)境下稱取土樣 10 g，溶于滅過(guò)菌的生理鹽水中，將菌液放置于 30 ℃、170 r/min的搖床上培養(yǎng)30 min。對(duì)培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行稀釋，將土壤稀釋液分別加入到有機(jī)磷培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，每個(gè)平板3次重復(fù)。

1.2.3 菌種純化 在有機(jī)磷培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中選擇帶有透明圈或渾濁圈、凸起很高的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，分別在普通肉湯培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，直至出現(xiàn)單一菌株。

1.2.4 菌種形態(tài)鑒定 在普通肉湯培養(yǎng)基上選擇單一菌落，觀察該菌落的形狀、大小、顏色等。

1.2.5 生理生化鑒定 根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［21］對(duì)菌株的生理生化特征進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 菌種分子鑒定 采用引物序列（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′） 擴(kuò)增16S rDNA，測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，運(yùn)用MEGAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 菌種解磷能力的測(cè)定 溶磷定性測(cè)定：分別在卵黃瓊脂培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上用打孔器打3個(gè)孔，接種菌液30 μL/個(gè)，每個(gè)平板重復(fù)3次。28 ℃ 下培養(yǎng)3 d，分別在培養(yǎng)后1、3 d時(shí)測(cè)量透明圈直徑和渾濁圈直徑。溶磷定量測(cè)定：運(yùn)用張祥勝的發(fā)酵液有效磷含量測(cè)定方法［22］進(jìn)行磷含量測(cè)定。

1.2.8種子發(fā)芽能力測(cè)定 在30 ℃、170 r/min條件下，將菌株放置在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)D600 nm=1，稀釋100倍，備用。將種子浸泡在10%雙氧水中消毒10 min，用無(wú)菌水多次清洗晾干。以培養(yǎng)皿為單位，挑取大小一致、飽滿的蕹菜種子在菌液中浸泡2 h，以無(wú)菌水作為對(duì)照，重復(fù)3次，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，28 ℃培養(yǎng)5 d，分別于培養(yǎng)后3、5 d測(cè)量蕹菜種子的發(fā)芽率。

1.2.9 植物生長(zhǎng)能力的測(cè)定 選取15個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致的蕹菜幼苗均勻種植于1/2MS培養(yǎng)基中。在幼苗根系下方3 cm處滴加200 μL稀釋后的菌液，對(duì)照組滴加200 μL無(wú)菌水，每個(gè)處理組重復(fù)3次。觀察平板植物生長(zhǎng)狀況，并且記錄植物的莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬、主根長(zhǎng)、須根數(shù)、鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，其中Plt;0.05 代表存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌菌株形態(tài)學(xué)鑒定

在普通肉湯培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，共得到6株菌株，分別命名為W1、W2、W3、W4、W5、W6。W1菌落淡黃色，圓形，單一菌落直徑1～3 mm，邊緣光滑，中間略微凸起，透明度低，有黏性，表面微濕；菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀。W2菌落偏白色，圓形，單一菌落直徑1～2 mm，邊緣光滑，無(wú)凸起，不透明，有黏性，表面光滑且濕潤(rùn)；菌體革蘭氏染色呈陰性，圓球狀。W3菌落淡黃色，圓形，表面微微隆起，單一菌落直徑2～3 mm，稍有黏性，邊緣參差不齊，稍有光澤，透明度較低，濕潤(rùn)；菌體革蘭氏染色后呈陰性，桿狀。W4菌落淡黃色，圓形，單一菌落直徑1～3 mm，邊緣光滑，中間略微凸起，透明度低，有黏性，表面微濕；菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀。W5菌落顏色稍白，圓形，單一菌落直徑1～3 mm，邊緣光滑，中間微微凸起，透明度低，菌落有黏性，表面微濕；菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀。W6菌落黃色，圓形，單一菌落直徑1～2 mm，邊緣光滑，菌落表面光滑無(wú)凸起，不透明，有黏性，表面濕潤(rùn)；菌體革蘭氏染色呈陰性，圓球狀（圖1、圖2）。

2.2 解磷菌菌株生化鑒定

由表1可知，菌株W1、W4、W5在氧化酶、甲基紅、7%氯化鈉、木糖試驗(yàn)中呈陰性，在明膠液化、水楊苷、葡萄糖試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在葡萄糖氧化發(fā)酵（OF）試驗(yàn)中為發(fā)酵型細(xì)菌。菌株W3在氧化酶、淀粉水解、L-精氨酸雙水解酶、7%氯化鈉試驗(yàn)中呈陰性，在甲基紅、明膠液化、硝酸鹽還原、木糖、水楊苷、吲哚、葡萄糖試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在葡萄糖OF試驗(yàn)中為發(fā)酵型細(xì)菌。菌株W2和菌株W6在氧化酶、甲基紅、明膠液化、淀粉水解、水楊苷、吲哚、葡萄糖試驗(yàn)中呈陰性，在硝酸鹽還原、L-精氨酸雙水解酶、7%氯化鈉、木糖試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在葡萄糖OF試驗(yàn)中為發(fā)酵型細(xì)菌。

2.3 解磷菌菌株分子生物學(xué)鑒定

提取菌株16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3，擴(kuò)增所得條帶大小與預(yù)期片段相符合，約為 1 500 bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司測(cè)序。

分別將6株菌株的序列在BLAST中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，運(yùn)用MEGAlign建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示。菌株W1、W4與參考菌株普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）KT922023.1同源性分別為99.2%、99.4%，且共聚為一支，結(jié)合生理生化特征，將W1、W4鑒定為普城沙雷氏菌；菌株W5與參考菌株變形斑沙雷菌（S.proteamaculans）KX527690.1同源性為98.8%，且處于同一最小分支，結(jié)合生理生化特征將其鑒定為變形斑沙雷氏菌；菌株W3與參考菌株蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）JF418158.1同源性為99.1%，且共聚一支，結(jié)合生理生化特征，可將其鑒定為蜂房哈夫尼亞菌；菌株W2與參考菌株醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）KY753249.1同源性為99.1%，且處于同一最小分支，結(jié)合生理生化特征，將其鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌；菌株W6與參考菌株醋酸鈣不動(dòng)桿OQ421687.1同源性為99.3%，結(jié)合生理生化特征，將其鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌。

2.4 解磷菌菌株解磷能力測(cè)定

2.4.1 解磷菌菌株解磷定性測(cè)定結(jié)果 表2顯示，在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，各菌株所形成的渾濁圈直徑為3.71～7.76 mm，其渾濁圈直徑從大到小依次為菌株W6＞菌株W2＞菌株W4＞菌株W3＞菌株W5＞菌株W1，菌株W6的渾濁圈直徑最大，為7.76 mm，顯著大于除菌株W2之外的其他4株解磷菌。培養(yǎng)3 d，各解磷菌菌株的渾濁圈直徑為 7.21～13.57 mm，菌株W6的渾濁圈最大，較菌株W1顯著大88.2%。

在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，6株解磷菌所形成的透明圈直徑差異較大，在1.76～4.10 mm之間，菌株W6明顯高于其他菌株。培養(yǎng)3 d，其透明圈直徑在3.83～7.67 mm之間，菌株W2最大，較菌株W1顯著大100.3%。

2.4.2 解磷菌菌株解磷定量測(cè)定結(jié)果 由表3可知，在有機(jī)磷培養(yǎng)基上，6種解磷菌解有機(jī)磷的量為9.37～15.79 μg/mL；在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，解磷菌解無(wú)機(jī)磷的量為5.29～8.49 μg/mL。其中，菌株W2解有機(jī)磷功能顯著高于其他菌株，其次為菌株W6。菌株W2解無(wú)機(jī)磷功能顯著高于除菌株W6外的其他菌株，較菌株W5提高60.5%。

2.5 解磷菌菌株對(duì)蕹菜種子發(fā)芽率的影響

由圖5可知，不同解磷菌菌液處理均顯著影響蕹菜種子發(fā)芽率。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，對(duì)照的發(fā)芽率為72%，各解磷菌菌液處理的發(fā)芽率在 74%～83%之間，較CK提高2.8%～15.3%。培養(yǎng)5 d，CK的發(fā)芽率為83%，各解磷菌菌液處理的發(fā)芽率在85%～97%之間，較CK提高24%～16.9%，且菌株W2、W6與CK差異顯著。培養(yǎng)3、5 d 后，各解磷菌菌液處理中均以W2處理蕹菜種子發(fā)芽率最高，分別為83%、97%，較CK分別提高15.3%、169%。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，解磷菌菌液可顯著提高蕹菜種子發(fā)芽率，其中W2處理的蕹菜發(fā)芽率最高，W6處理次之。

2.6 解磷菌菌株對(duì)蕹菜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由表4可知，施用解磷菌菌液后蕹菜的生長(zhǎng)發(fā)育速度得到了明顯的提高，其莖長(zhǎng)、鮮重、葉長(zhǎng)、葉寬、主根長(zhǎng)和須根數(shù)與不施菌液處理相比都有明顯提高。其中，W2處理的蕹菜莖長(zhǎng)比其他菌液處理明顯增加，其莖長(zhǎng)為49.11 mm，比CK顯著增加395%，各個(gè)處理莖長(zhǎng)整體增量在3.3%～39.5%之間。施用解磷菌菌液也有利于鮮重增加，對(duì)其促進(jìn)效果最明顯的是W2處理，和CK相比其鮮重增加22.2%，其次是W6，增加16.7%。W2處理的葉長(zhǎng)較其他解磷菌菌液處理增加明顯，其葉長(zhǎng)為1944 mm，和CK相比顯著增加28.8%，各個(gè)處理葉長(zhǎng)增量為1.7%～288%。W6處理的葉寬和其他解磷菌菌液處理相比明顯更大，達(dá)到了 4.31 mm，和CK相比顯著增加34.3%。主根長(zhǎng)和須根數(shù)均為W2處理最佳，分別為20.85 mm和2757條，和CK相比分別顯著增加36.4%和784%。W2處理對(duì)蕹菜生長(zhǎng)發(fā)育（莖長(zhǎng)、鮮重、葉長(zhǎng)、葉寬、主根長(zhǎng)和須根數(shù)）的影響與W6處理相比不顯著；除鮮重外，W2處理均與CK相比促進(jìn)效果較明顯。W1、W5處理與CK的莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和葉寬差異都不顯著，施用解磷菌菌液的6個(gè)處理主根長(zhǎng)和須根數(shù)與CK均差異顯著。由此可以看出，施用解磷菌菌液可以促進(jìn)蕹菜生長(zhǎng)發(fā)育，效果以W2處理相對(duì)較好。

3 討論與結(jié)論

根際促菌可以溶解磷，分泌生長(zhǎng)激素［23-24］。對(duì)其特性的研究，有利于明確植物根際微生態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程，對(duì)促進(jìn)作物增產(chǎn)方面具有重要意義。一些根際促進(jìn)菌還能有效地轉(zhuǎn)化根際土壤中的磷，促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收［25］，以酸解等方式溶解土壤中難溶性磷鹽，供植物吸收［26］。楊瑞等從尾礦先鋒植物的根際土壤中分離出5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，其中就含有一些具有溶磷特性的溶磷菌［27］；李美從玉米根際土中分離出了4株具有高溶磷能力的菌株［28］。本研究從青海的野生中國(guó)沙棘根際土壤中分離出6株具有溶磷能力的根際促進(jìn)菌，結(jié)果表明，不同的解磷菌具有不同的解磷效果。張晶晶等從核桃的根際土壤中分離出磷解菌并培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)其透明圈直徑為 617～1215 mm，渾濁圈直徑為3.91～11.83 mm［29］。郭英等從野生大豆根部分離出溶磷菌，其溶磷圈直徑是菌落直徑的1.42倍［30］。本試驗(yàn)所獲得的6株菌株均具有溶磷能力，在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1、3 d，菌株的渾濁圈直徑分別為371～7.76、7.21～13.57 mm，其中菌株W6效果最好。菌株W6在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)1、3 d后，透明圈的直徑分別為4.10、7.35 mm，其解無(wú)機(jī)磷的能力較除W2外的其他菌株顯著提高。菌株的溶磷圈直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移而變大，這可能是因?yàn)榻饬拙芰啄芰Φ尼尫判枰銐虻臅r(shí)間。

解磷菌菌株經(jīng)生化及分子鑒定，確認(rèn)為1株蜂房哈夫尼亞菌、2株不動(dòng)桿菌、3株沙雷氏菌。同時(shí)，菌株可通過(guò)解磷、解鉀和降解纖維素等方式改良土壤的特性［23，31］，以提高種子發(fā)芽率及其生長(zhǎng)速度，與Hameeda等的研究結(jié)果［14，32-33］一致。解磷菌由于其獨(dú)特的促生功能，在農(nóng)業(yè)方面擁有良好的發(fā)展前景［34-36］。土壤微生物因其具有綠色無(wú)公害的特性，可用于生產(chǎn)生物肥料，提高土壤養(yǎng)分含量和微生物多樣性［37］。在生物有機(jī)肥的生產(chǎn)中，首先需從植物根際土壤中分離出可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)的菌株（菌株W2、W6），并利用上述菌株制成混合菌液，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。由此可見(jiàn)，本研究結(jié)果為生產(chǎn)高效生物有機(jī)肥提供了候選菌株。

本研究從青海野生中國(guó)沙棘根際土壤中分離出6株解磷菌菌株，結(jié)果顯示，菌株W6溶解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，培養(yǎng)3 d，渾濁圈直徑為13.57 mm；菌株W2溶解無(wú)機(jī)磷能力最強(qiáng)，培養(yǎng)3 d，透明圈直徑為 7.67 mm。解磷菌菌液可顯著提高蕹菜種子的發(fā)芽率，同時(shí)有助于增加蕹菜幼苗鮮重，有效促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，其幼苗的莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬、主根長(zhǎng)和須根數(shù)均較CK明顯增加，且以菌株W2、W6的促生效果最明顯。

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