基金項(xiàng)目 安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“入侵植物一年蓬的譜系分化格局與適應(yīng)性進(jìn)化研究”（1908085MC58）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目“《植物學(xué)》野外實(shí)習(xí)虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)”（2021xnfzxm062）；安慶師范大學(xué)校級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目（2022aqnujyxm45）。

作者簡(jiǎn)介 王仕文（2003—），男，安徽安慶人，從事生物入侵與生態(tài)安全研究。

通信作者 童躍偉（1987—），男，安徽蕪湖人，博士，講師，從事生物入侵與生態(tài)安全研究。

收稿日期 2024-03-07

摘要 一年蓬為菊科飛蓬屬植物，是分布較廣、危害較重的一種外來(lái)入侵雜草。為優(yōu)選該植物基因組DNA的提取方法，本研究采取四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)一年蓬基因組DNA的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取方法進(jìn)行優(yōu)化，并與常規(guī)的植物基因組試劑盒法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，一年蓬基因組DNA較優(yōu)的提取方法為改良CTAB法，即一年蓬的干燥葉片經(jīng)CTAB-free去除多糖，并加入β-巰基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因組DNA質(zhì)量較高，微量分光光度計(jì)檢測(cè)的A260/A280數(shù)值接近1.8～2.0，且凝膠電泳DNA條帶清晰，無(wú)明顯拖帶。該方法為該植物的遺傳多樣性和入侵機(jī)制等研究提供參考。

關(guān)鍵詞 菊科；一年蓬；DNA提取方法；改良CTAB法；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) Q949.783.5；Q75"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2024）13-0066-05

Optimization of DNA extraction methods from invasive plant Erigeron annuus

WANG Shiwen""" YANG Ziqiong""" WEI Shuya""" DING Tong""" GU Wanru""" CHEN Yubei""" QU Lili""" TONG Yuewei

（Research Center of Aquatic Organism Conservation and Water Ecosystem Restoration/

School of Life Science， Anqing Normal University， Anqing 246133， China）

Abstract Erigeron annuus， which belongs to the genus Suaeda of Asteraceae family， is one of the most widely distributed and seriously harmful alien invasive weeds. To select a better method for extracting genomic DNA of E. annuus， the CTAB method for extracting genomic DNA of E. annuus was optimized by orthogonal experiment with four factors and three levels， and compared with the common plant kit method. The results showed that the modified CTAB method was used to extract genomic DNA of E. annuus. This involved treating the dried leaves of E. annuus with CTAB-free to remove polysaccharides， adding β-mercaptoethanol to prevent phenol oxidation， and extracting with chloroform：isopentanol （24∶1） three times. The quality of the DNA extracted by the optimized scheme was good， with A260/A280 values measured by a microspectrophotometer close to 1.8 to 2.0， and the gel electrophoresis image band was clear without obvious drag. This method laid a foundation for studies on the genetic diversity and invasion mechanisms of E. annuus.

Keywords Asteraceae; Erigeron annuus; DNA extraction method; modified CTAB method; orthogonal test

生物入侵被認(rèn)為是導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境碎片化以及生物多樣性喪失的關(guān)鍵因子之一[1]，可能會(huì)給地方生物多樣性造成較大的危害，該問(wèn)題現(xiàn)已演變?yōu)槿蛐缘闹卮蟓h(huán)境問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題[2]。菊科飛蓬屬植物一年蓬（Erigeron annuus）廣泛分布于野外次生演替群落中[3]。該植物是目前分布較廣、危害較重的外來(lái)入侵雜草之一[4]。該物種種子量大[5]，種子具冠毛[6]以及生態(tài)幅較寬[7]，易在入侵地區(qū)大面積擴(kuò)散蔓延；而且其化感作用會(huì)抑制周?chē)参锏纳L(zhǎng)發(fā)芽[8]，在一定程度上影響區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。目前，對(duì)于一年蓬的研究主要集中于其自身的化學(xué)成分分析[9]、化感作用[10]等方面，而對(duì)其分子生物學(xué)及入侵機(jī)制等方面的研究相對(duì)有限。鑒于此，運(yùn)用分子生物學(xué)對(duì)一年蓬群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探討其種內(nèi)譜系地理格局形成機(jī)制、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及入侵機(jī)制的研究十分必要，而高質(zhì)量的一年蓬基因組DNA的獲取尤為關(guān)鍵。

目前，關(guān)于植物基因組DNA的提取方法有很多，應(yīng)用較多的有常規(guī)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[11]和植物試劑盒法（DP-320）。常規(guī)CTAB法因不同植物材料在化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等方面存在差別，提取效果往往差異較大[12-14]，在應(yīng)用上有一定的局限性；植物試劑盒法可以快速、有效提取植物基因組DNA，無(wú)需酚、氯仿抽提，避免了試劑污染，但成本較高?；诖?，為建立一種高效且經(jīng)濟(jì)的一年蓬基因組DNA提取方法，本研究對(duì)常規(guī)CTAB法進(jìn)行改良，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，并與植物試劑盒法進(jìn)行對(duì)比，目的是篩選出該物種一年蓬基因組DNA的較優(yōu)提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料" 試驗(yàn)所用一年蓬均采集自安慶師范大學(xué)校園內(nèi)，均選取幼嫩葉片作為試驗(yàn)材料。將采集的植物樣本清洗干凈，使用變色硅膠對(duì)其進(jìn)行快速干燥處理，并保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 試劑" 改良CTAB法所用試劑：Tris、EDTA、CTAB和瓊脂糖（上海生工生物工程有限公司）；loading buffer、核酸染料、50×TAE緩沖液（北京索萊寶公司）；液氮、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇和無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

植物試劑盒法所用試劑：DP-320新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器" 移液槍、電泳儀、凝膠成像儀、微量分光光度計(jì)、恒溫水槽和水浴鍋等。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 改良CTAB法" 設(shè)置樣品質(zhì)量（A）、CTAB-free劑量（B）、β-巰基乙醇劑量（C）和水浴時(shí)間（D）的L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)比不同因素對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響。DNA提取步驟如下。

（1）根據(jù)表1提供的樣品質(zhì)量，取相應(yīng)質(zhì)量的樣品至2 mL無(wú)菌離心管中，加入兩顆直徑5 mm的鋼珠，在液氮中冷凍樣品，隨后快速研磨樣品1 min。（2）加入相應(yīng)劑量的預(yù)熱CTAB-free溶液和β-巰基乙醇，置于65 °C恒溫水浴鍋中水浴，根據(jù)表1水浴相應(yīng)時(shí)間，其間每隔10 min均勻搖晃離心管一次，水浴結(jié)束后12 000 r/min離心5 min，取上清液。（3）上清液加入等體積的氯仿和異戊醇，氯仿∶異戊醇體積比為24∶1。上下混勻成乳濁狀，室溫放置2～5 min，隨后12 000 r/min離心5 min。（4）重復(fù)步驟（3）3次。（5）取上層水相至干凈的離心管中，加入2倍體積的冰鎮(zhèn)無(wú)水乙醇，置于-20 °C冰箱30 min以上，以沉淀DNA；然后10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μL 75%乙醇，洗滌1～2次，棄上清液，置于超凈臺(tái)晾干水分；加入100 μL無(wú)菌水溶解、混勻，保存于-20 °C備用。

1.2.2 植物試劑盒法" 使用前先在緩沖液LP3和漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，加入體積參照標(biāo)簽說(shuō)明。提取步驟如下。

（1）取新鮮植物組織100 mg或干組織20 mg，加入液氮充分研磨，加入400 μL緩沖液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/mL），旋渦振蕩1 min，室溫放置10 min；加入130 μL緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液至干凈離心管中。（2）上清液中加入1.5倍體積的緩沖液LP3（使用前先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），立即充分混勻15 s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；將溶液和絮狀沉淀一并加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（3）向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。注意：如果吸附柱膜呈綠色，吸附柱CB3中加入500 μL無(wú)水乙醇，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。（4）重復(fù)操作步驟（3）。（5）將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫，以徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液。（6）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50～200 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，收集濾液至離心管中。

1.3 DNA產(chǎn)率和質(zhì)量檢測(cè)方法

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)" 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA的片段大小、降解情況。取2 μL DNA提取液，加3 μL無(wú)菌水、1 μL loading buffer混勻后滴入1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在紫外凝膠成像儀上觀察并記錄。

1.3.2 分光光度計(jì)檢測(cè)" 取2 μL樣品DNA溶液，用微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA的A260/A280值。根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度（A）判斷DNA的提取質(zhì)量，A值在1.8～2.0，DNA的質(zhì)量較佳；A值小于1.8，說(shuō)明樣品DNA中存在酚類(lèi)或蛋白質(zhì)污染；A值大于2.0則說(shuō)明樣品DNA中有RNA污染[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTAB提取方法的優(yōu)化

設(shè)置樣品質(zhì)量（A）、CTAB-free劑量（B）、β-巰基乙醇劑量（C）和水浴時(shí)間（D）的L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)比不同因素對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響。由表2可看出，相較于處理7，處理9的DNA吸光度數(shù)值最低，為1.583。吸光度極差數(shù)據(jù)R顯示，4個(gè)因素對(duì)DNA吸光度的影響順序?yàn)镈gt;Agt;Cgt;B，其中樣品質(zhì)量、β-巰基乙醇劑量和水浴時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)DNA的吸光度均影響較大。

由表3可知，處理7得到的DNA濃度最高，平均值為424.7 ng/μL；處理6的濃度最低，為104.7 ng/μL。說(shuō)明樣品量、β-巰基乙醇及水浴時(shí)間對(duì)DNA提取濃度有明顯影響，極差數(shù)據(jù)R顯示，4個(gè)因素對(duì)一年蓬DNA提取濃度的影響順序?yàn)锳gt;Dgt;Cgt;B。

綜合來(lái)看，處理7得到的DNA濃度最高，平均值為424.7 ng/μL，吸光度平均值為1.766。因此，一年蓬葉片DNA濃度最佳的提取條件為處理7，即樣品量0.03 g，CTABfree溶液700 μL，β-巰基乙醇50 μL，水浴時(shí)間30 min，在該條件下提取的一年蓬基因組DNA濃度最高，吸光度平均值接近1.8。4個(gè)影響因素中樣品質(zhì)量、β-巰基乙醇劑量和水浴時(shí)間對(duì)提取的DNA濃度和吸光度均有明顯影響。

2.2 改良CTAB法與植物試劑盒法提取效果對(duì)比

改良CTAB法提取的DNA，在電泳時(shí)加樣孔干凈，無(wú)拖帶降解現(xiàn)象，DNA濃度較高（圖1A）；而植物試劑盒法提取的DNA譜帶電泳時(shí)加樣孔干凈，無(wú)拖帶現(xiàn)象，但對(duì)比改良CTAB法其DNA濃度不高（圖1B）。

lt;G：＼農(nóng)學(xué)通報(bào)＼2024-13期農(nóng)學(xué)通-內(nèi)文＼Image＼A1303-1.tifgt;[（A）][M 1 2 3 4][（B）][M 1 2 3 4][5 000][5 000]

（A）改良CTAB法；（B）植物試劑盒法；M為Maker；1～4為DNA樣品。

圖1 一年蓬基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的A260/A280比值，比較兩種提取方法提取的DNA樣品的純度。結(jié)果表明，改良CTAB法提取的DNA的A260/A280平均比值為1.769，接近1.8～2.0范圍，受酚類(lèi)、蛋白質(zhì)和RNA物質(zhì)污染較少，DNA純度較高（表4）；而植物試劑盒法提取的DNA的A260/A280平均比值為1.569，距1.8～2.0范圍有一定差距，說(shuō)明DNA樣品可能被酚類(lèi)或蛋白質(zhì)等物質(zhì)污染，其提取的DNA純度較改良CTAB法低（表5）。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)一年蓬植物，在常規(guī)的CTAB提取方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良：添加了β-巰基乙醇，以有效地抑制酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，從而減少了DNA降解[16]；在樣品研磨過(guò)程中采用液氮低溫研磨，減少了DNA降解；樣品研磨時(shí)使用無(wú)菌小鋼珠，在充分研磨樣品的同時(shí)避免了DNA污染[17]；為充分除去樣品中的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次[18-19]。此外，對(duì)樣品質(zhì)量、CTAB-free溶液劑量、β-巰基乙醇劑量及水浴時(shí)間進(jìn)行了定量試驗(yàn)，通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)比不同因素對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響，改良CTAB法提取的一年蓬葉片基因組DNA濃度和純度較高，優(yōu)于植物試劑盒法。后續(xù)可考慮水浴溫度、抽提次數(shù)等因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析這些因素對(duì)一年蓬葉片基因組DNA提取效果的影響，對(duì)該方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。改良CTAB法使用材料成本較低，相較于植物試劑盒法可以有效節(jié)約成本，獲得純度和濃度更高的一年蓬基因組DNA。

王軍等[20]對(duì)山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）基因組DNA的提取方法，宋國(guó)立等[21]對(duì)棉花（Gossypium）基因組DNA的提取方法進(jìn)行了與本研究類(lèi)似的改良，均加入了β-巰基乙醇，增加了氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提次數(shù)，提取的DNA凝膠電泳檢測(cè)加樣孔清晰，條帶無(wú)拖帶，且A260/A280值在1.8～2.0內(nèi)，即使用改良CTAB法均能提取到對(duì)應(yīng)研究對(duì)象的高濃度、高質(zhì)量的基因組DNA。

綜上，本研究采取四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)一年蓬基因組DNA的CTAB提取方法進(jìn)行優(yōu)化，并與常規(guī)的植物基因組試劑盒法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，一年蓬基因組DNA較優(yōu)的提取方法為改良CTAB法，即一年蓬的干燥葉片經(jīng)CTAB-free去除多糖，并加入β-巰基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因組DNA質(zhì)量高，微量分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280值接近1.8～2.0，且凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶清晰無(wú)明顯拖帶。該改良CTAB法為獲取高質(zhì)量的一年蓬基因組DNA提供了方法，為一年蓬的遺傳多樣性和入侵機(jī)制等研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：何 艷）