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        黃瓜CsWRKY20基因的克隆及其生物信息學(xué)和高溫脅迫響應(yīng)分析

        2024-12-31 00:00:00陳岳鮑文敏徐俐琴張微微
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年7期
        關(guān)鍵詞:高溫脅迫生物信息學(xué)分析黃瓜

        關(guān)鍵詞:黃瓜;WRKY轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)分析;高溫脅迫;基因表達(dá)分析

        黃瓜(Cucumis sativus)是葫蘆科一年生草本植物,是中國設(shè)施栽培蔬菜中的第二大作物。作為一種喜溫但不耐熱的蔬菜,黃瓜生長的適宜溫度為25~30℃,當(dāng)溫度超過35℃,黃瓜葉片萎蔫,葉面積變小,根系受損,光合作用和呼吸作用均受到抑制,植株生長受阻、抗性降低,從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

        WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,因含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名,該結(jié)構(gòu)域包含N末端的WRKYGQK基序及C末端的鋅指基序。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指基序的結(jié)構(gòu),WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以分為三類:I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)型鋅指結(jié)構(gòu);Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子一般含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu):Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2HC(C-X7-C-X23 -H-X1一C)型鋅指結(jié)構(gòu)。

        WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。如:擬南芥WRKY22、WRKY6、WRKY53和WRKY70均可以調(diào)控植株葉片的衰老:WRKY12和WRKY13調(diào)控擬南芥在短日照條件下開花:WRKY23通過調(diào)節(jié)生長素的合成影響擬南芥根的發(fā)育。同時WRKY在植物響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用。如:過表達(dá)水稻OsWRKY45和OsWRKY72可以提高植株的耐鹽性:擬南芥在WRKY39基因敲除后,對熱脅迫的敏感性增加,種子發(fā)芽率降低,幼苗存活率下降,而過表達(dá)WRKY39轉(zhuǎn)基因的植株耐熱性則顯著增強(qiáng):黃瓜中的CsWRKY46受低溫和脫落酸(abscisic acid,ABA)誘導(dǎo)表達(dá),在擬南芥中過表達(dá)CsWRKY46能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性;CsWRKY50可被立枯絲核菌感染、非生物脅迫和多種信號分子誘導(dǎo)。

        WRKY20是高等雙子葉植物中保守的免疫調(diào)控因子,雙生病毒效應(yīng)蛋白通過調(diào)控植物WRKY20基因的表達(dá)能增強(qiáng)植株抗蟲能力。但在黃瓜中未見CsWRKY20響應(yīng)非生物脅迫的相關(guān)報道。本研究從黃瓜中克隆CsWRKY20基因,通過生物信息學(xué)方法分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)、序列特征和進(jìn)化關(guān)系,并用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測CsWRKY20在不同器官中以及在42℃高溫脅迫下的表達(dá)模式,可為進(jìn)一步研究該基因在黃瓜非生物脅迫中的作用和功能奠定基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1試驗材料培育與取樣

        以華北型黃瓜自交系9930為材料,種植于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院五厙實訓(xùn)基地。當(dāng)植株長出5片真葉時,取其根、莖、葉、子葉;當(dāng)黃瓜生長到20結(jié)位時,分別取花瓣、雄蕊、果刺、果皮、卷須。將五葉期幼苗置于42℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理,分別在處理0、1、3、6、12、24h取葉片。所有樣本采后立即置于液氮中冰凍,然后存于-80℃冰箱中備用。

        1.2基因克隆與鑒定

        在TAIR網(wǎng)站獲取擬南芥WRKY20的蛋白序列,比對到黃瓜9930 V3版基因組(http://cucurbitgenom-ics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese一long/v3/),獲得黃瓜的同源基因CsWRKY20(CsaV3一3G004410)。根據(jù)Cs WRKY20編碼區(qū)設(shè)計特異引物CsWRKY20_F(5'-ATGGACCCCACTGArl7CCGA一3')和CsWRKY20_R(5'-CTAATTTATAACACTTC-TATTGAGCA-3'),以黃瓜葉片的cDNA為模板,用PrimeSTAR Max Premix(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:PrimeSTARMax Premix 25 uL,上、下游引物(10umol/L)各2uL,模板DNA 200ng,ddH20補(bǔ)充至50uL。擴(kuò)增程序:94℃5min;98℃ 10s,55℃ 15s,72℃1min,35個循環(huán);72℃ 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,將目的片段連接至pClone007Blunt Vector克隆載體(上海擎科生物科技有限公司),熱激法轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落進(jìn)行PCR篩選,陽性克隆送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。

        1.3CsWRKY20的生物信息學(xué)分析

        使用Expasy在線網(wǎng)站(https://www. expasy.org)的“Compute pl/Mw tool”對CsWRKY20的等電點與分子量進(jìn)行預(yù)測。使用WoLF PSORT對CsWRKY20的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。利用Ex-PASy ProtScale在線網(wǎng)站分析CsWRKY20蛋白的親/疏水性。利用SOPMA對CsWRKY20的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用PlantCARE對CsWRKY20轉(zhuǎn)錄起始點上游2 002 bp的序列進(jìn)行啟動子順式作用元件預(yù)測。利用MEME對CsWRKY20的保守基序進(jìn)行預(yù)測。將CsWRKY20蛋白序列提交到NCBI(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)網(wǎng)站,經(jīng)同源比對,篩選并下載不同物種的WRKY20序列(表1)。利用DNAMAN軟件對9種植物的WRKY20蛋白序列進(jìn)行多序列比對,并通過MEGA X軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap值為1 000)。利用STRING數(shù)據(jù)庫推測CsWRKY20的互作蛋白。

        1.CsWRKY20的表達(dá)分析

        使用植物RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)分別提取各個器官的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)CsWRKY20編碼區(qū)序列設(shè)計特異性引物RT-CsWRKY20F(5'-TGCTA-AGTACAAGCTCTTGTCTC-3')和RT-CsWRKY20R(5'-TTCAAGTTGGTAAGAAGAACAGGA-3')用于熒光定量RT-PCR實驗,以檢測CsWRKY20在黃瓜不同器官以及高溫脅迫處理后的表達(dá)情況。使用康為世紀(jì)的UltraSYBR Mixture試劑盒進(jìn)行分析,PCR體系和程序見試劑盒說明書。以黃瓜Actin(Csa6G484600)基因為對照,利用2法計算基因的相對表達(dá)量。

        2結(jié)果與分析

        2.1CsWRKY20基因克隆及其編碼蛋白理化性質(zhì)

        利用特異性引物擴(kuò)增Cs WRKY20基因的CDS區(qū)域,獲得一條清晰明亮的條帶(圖1),測序結(jié)果顯示,CsWRKY20基因CDS序列長度為1602bp,共編碼533個氨基酸。CsWRKY20蛋白分子量為132959.43Da,等電點為4.97;屬于親水性蛋白,其中第477位氨基酸殘基的疏水性最強(qiáng),為1.744,第490位的氨基酸殘基親水性最強(qiáng),為-3.178;二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、a-螺旋、延伸鏈和轉(zhuǎn)角組成,其中無規(guī)則卷曲占比最高(74.48%),其余依次是延伸鏈(14.82%)、a-螺旋(6.57%)和轉(zhuǎn)角(4.13%)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CsWRKY20蛋白定位于細(xì)胞核中。

        2.2CsWRKY20的進(jìn)化分析

        利用DNAMAN軟件對9條WRKY20蛋白序列進(jìn)行多序列比對,結(jié)果(圖2)表明,CsWRKY20與甜瓜的CmWRKY20同源性最高,相似度達(dá)97.37%:與冬瓜、印度南瓜、野生灰籽南瓜、中國南瓜、美洲南瓜、胡桃、擬南芥的WRKY20蛋白同源性依次降低,相似度分別為84.11%、79.83%、79.48%、79.31%、78.97%、57.31%。此外,這些序列在N端均含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域,且含有兩個半胱氨酸(cysteine,C)和兩個組氨酸(histidine,H),即C2H2型鋅指結(jié)構(gòu),故將CsWRKY20歸納在WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的I類亞家族。

        為了分析CsWRKY20的親緣關(guān)系,利用CsWRKY20與其他物種的17條WRKY20蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示,18條蛋白序列分為兩組,所有葫蘆科蛋白聚為一組,其余蛋白序列聚為一組。CsWRKY20與甜瓜的Cm-WRKY20聚在同一亞組,說明它們的親緣關(guān)系較近,與多序列比對結(jié)果一致。使用NCBI的Con-served Domain Database對18條蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,Motif 1和Motif 2包含保守序列WRKYGQK。除了苦瓜的McWRKY20不含有Motif 3,其他序列都含有相似的Motif。

        2.3啟動子元件分析

        利用PlantCARE對CsWRKY20啟動子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析,結(jié)果(表2)表明,除了含有真核生物啟動子固有的TATA區(qū)和CAAT區(qū)外,CsWRKY20啟動子區(qū)域還包含2個防御脅迫響應(yīng)元件、1個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、1個脫落酸響應(yīng)元件和13個光周期響應(yīng)元件。

        2.4CsWRKY20基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)模式

        由圖4可見,CsWRKY20在黃瓜果刺中相對表達(dá)量最高,其次是根、莖、葉、子葉、果皮、花瓣、卷須中,雄蕊中相對表達(dá)量最低。

        2.5CsWRKY20基因在高溫脅迫處理下的表達(dá)模式

        圖5結(jié)果顯示.CsWRKY20在42℃高溫脅迫1h的表達(dá)水平顯著升高,為未處理時表達(dá)量的2.1倍;之后表達(dá)量下降,于6h后恢復(fù)到未處理時的水平。說明CsWRKY20可在短時內(nèi)響應(yīng)高溫的誘導(dǎo)。

        2.6CsWRKY20互作蛋白預(yù)測分析

        在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入CsWRKY20蛋白序列,通過擬南芥WRKY20同源蛋白構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò),推測CsWRKY20的互作蛋白。結(jié)果(圖6)顯示,WRKY20與WRKY21、NAC084、乙烯響應(yīng)因子ERF094、絲裂原活化蛋白激酶MPK19、GTP酶激活蛋白(T24P15.10和T10K17.140)、高速泳動蛋白HMGB6等具有互作關(guān)系,推測CsWRKY20可能通過與這些蛋白的互作發(fā)揮作用。

        3討論與結(jié)論

        WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物生長發(fā)育過程中一類重要的調(diào)節(jié)因子,能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫,并賦予植物多種脅迫抗性。本研究采用同源克隆方法克隆到黃瓜CsWRKY20基因,其CDS序列長度為1602bp,編碼533個氨基酸。CsWRKY20蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、a-螺旋、延伸鏈和轉(zhuǎn)角組成,含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu),故將其歸屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的I類亞家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測其主要位于細(xì)胞核中。同源進(jìn)化分析表明該蛋白與甜瓜的CmWRKY20親緣關(guān)系最近。

        WRKY轉(zhuǎn)錄因子受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。擬南芥中WRKY20響應(yīng)依賴茉莉酸和水楊酸信號,參與了益生細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌(Ba-cillus amyloliquefaciens)介導(dǎo)的提高作物抗逆性過程。大豆CsWRKY20在增強(qiáng)耐旱性和調(diào)節(jié)ABA信號方面發(fā)揮重要作用:一方面作為轉(zhuǎn)錄激活子提高了蠟質(zhì)合成關(guān)鍵基因表達(dá),促進(jìn)蠟質(zhì)合成,使植物合成較厚角質(zhì)層,減少非依賴于氣孔的水分喪失:另一方面通過增強(qiáng)氣孔對ABA開度的敏感性促進(jìn)植物在受到干旱脅迫時關(guān)閉氣孔,減少依賴于氣孔的水分喪失。本研究在CsWRKY20啟動子上發(fā)現(xiàn)了多個響應(yīng)激素信號通路和逆境脅迫的元件,如防御脅迫響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件和光周期響應(yīng)元件,表明其可能通過這些元件受相應(yīng)的信號誘導(dǎo)表達(dá)。

        植物遭受高溫脅迫后,會引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加、磷脂酸積累以及活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)爆發(fā)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路、植物激素合成等途徑響應(yīng)高溫脅迫。鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)是Ca2+結(jié)合信號,普遍存在于真核生物中。在擬南芥中,WRKY7/11/15/17/21/39/74均含有鈣調(diào)蛋白的保守結(jié)合位點:鈣調(diào)蛋白可以與WRKY53結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá):WRKY28受到氧化脅迫時表達(dá)上調(diào),過表達(dá)WRKY28的轉(zhuǎn)基因植株抗逆性顯著增強(qiáng):WRKY39黨茉莉酸和水楊酸的誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)一步研究表明,WRKY39正調(diào)控植株響應(yīng)熱脅迫過程中茉莉酸和水楊酸激活信號通路之間的相互作用。小麥TaWRKY33受高溫、ABA和茉莉酸的誘導(dǎo)表達(dá),過表達(dá)Ta WRKY33能提高植株對高溫的抗性。本研究結(jié)果表明,CsWRKY20在高溫處理1h的表達(dá)水平顯著升高.6h后恢復(fù)到初始水平,說明其可受高溫誘導(dǎo)短時上調(diào)表達(dá)。

        本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫推測了CsWRKY20的互作蛋白,發(fā)現(xiàn)其可能與絲裂原活化蛋白激酶MPK19相互作用。植物在受到高溫脅迫時,會激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。如:MAPK可通過磷酸化熱激轉(zhuǎn)錄因子HsFA3來調(diào)控番茄對熱脅迫的響應(yīng):當(dāng)馬鈴薯受到高溫脅迫時,StMPK1的表達(dá)顯著上升。

        綜上,本研究通過同源克隆獲得了黃瓜CsWRKY20基因,其編碼533個氨基酸,在果刺中和高溫脅迫1h的相對表達(dá)量最高,推測其可能響應(yīng)高溫脅迫。今后將利用過表達(dá)和敲除實驗對CsWRKY20的功能做進(jìn)一步分析和驗證,以期為闡明該基因在黃瓜抗逆中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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