關(guān)鍵詞：黃瓜；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析；高溫脅迫；基因表達(dá)分析

黃瓜（Cucumis sativus）是葫蘆科一年生草本植物，是中國設(shè)施栽培蔬菜中的第二大作物。作為一種喜溫但不耐熱的蔬菜，黃瓜生長的適宜溫度為25～30℃，當(dāng)溫度超過35℃，黃瓜葉片萎蔫，葉面積變小，根系受損，光合作用和呼吸作用均受到抑制，植株生長受阻、抗性降低，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域包含N末端的WRKYGQK基序及C末端的鋅指基序。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指基序的結(jié)構(gòu)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以分為三類：I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）型鋅指結(jié)構(gòu)；Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子一般含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)：Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2HC（C-X7-C-X23 -H-X1一C）型鋅指結(jié)構(gòu)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。如：擬南芥WRKY22、WRKY6、WRKY53和WRKY70均可以調(diào)控植株葉片的衰老：WRKY12和WRKY13調(diào)控擬南芥在短日照條件下開花：WRKY23通過調(diào)節(jié)生長素的合成影響擬南芥根的發(fā)育。同時WRKY在植物響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用。如：過表達(dá)水稻OsWRKY45和OsWRKY72可以提高植株的耐鹽性：擬南芥在WRKY39基因敲除后，對熱脅迫的敏感性增加，種子發(fā)芽率降低，幼苗存活率下降，而過表達(dá)WRKY39轉(zhuǎn)基因的植株耐熱性則顯著增強(qiáng)：黃瓜中的CsWRKY46受低溫和脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)CsWRKY46能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性；CsWRKY50可被立枯絲核菌感染、非生物脅迫和多種信號分子誘導(dǎo)。

WRKY20是高等雙子葉植物中保守的免疫調(diào)控因子，雙生病毒效應(yīng)蛋白通過調(diào)控植物WRKY20基因的表達(dá)能增強(qiáng)植株抗蟲能力。但在黃瓜中未見CsWRKY20響應(yīng)非生物脅迫的相關(guān)報道。本研究從黃瓜中克隆CsWRKY20基因，通過生物信息學(xué)方法分析其編碼蛋白的理化性質(zhì)、序列特征和進(jìn)化關(guān)系，并用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測CsWRKY20在不同器官中以及在42℃高溫脅迫下的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步研究該基因在黃瓜非生物脅迫中的作用和功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料培育與取樣

以華北型黃瓜自交系9930為材料，種植于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院五厙實訓(xùn)基地。當(dāng)植株長出5片真葉時，取其根、莖、葉、子葉；當(dāng)黃瓜生長到20結(jié)位時，分別取花瓣、雄蕊、果刺、果皮、卷須。將五葉期幼苗置于42℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理，分別在處理0、1、3、6、12、24h取葉片。所有樣本采后立即置于液氮中冰凍，然后存于-80℃冰箱中備用。

1.2基因克隆與鑒定

在TAIR網(wǎng)站獲取擬南芥WRKY20的蛋白序列，比對到黃瓜9930 V3版基因組（http：//cucurbitgenom-ics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese一long/v3/），獲得黃瓜的同源基因CsWRKY20（CsaV3一3G004410）。根據(jù)Cs WRKY20編碼區(qū)設(shè)計特異引物CsWRKY20_F（5'-ATGGACCCCACTGArl7CCGA一3'）和CsWRKY20_R（5'-CTAATTTATAACACTTC-TATTGAGCA-3'），以黃瓜葉片的cDNA為模板，用PrimeSTAR Max Premix（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：PrimeSTARMax Premix 25 uL，上、下游引物（10umol/L）各2uL，模板DNA 200ng，ddH20補(bǔ)充至50uL。擴(kuò)增程序：94℃5min；98℃ 10s，55℃ 15s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃ 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段連接至pClone007Blunt Vector克隆載體（上海擎科生物科技有限公司），熱激法轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR篩選，陽性克隆送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.3CsWRKY20的生物信息學(xué)分析

使用Expasy在線網(wǎng)站（https：//www. expasy.org）的“Compute pl/Mw tool”對CsWRKY20的等電點與分子量進(jìn)行預(yù)測。使用WoLF PSORT對CsWRKY20的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。利用Ex-PASy ProtScale在線網(wǎng)站分析CsWRKY20蛋白的親／疏水性。利用SOPMA對CsWRKY20的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用PlantCARE對CsWRKY20轉(zhuǎn)錄起始點上游2 002 bp的序列進(jìn)行啟動子順式作用元件預(yù)測。利用MEME對CsWRKY20的保守基序進(jìn)行預(yù)測。將CsWRKY20蛋白序列提交到NCBI（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）網(wǎng)站，經(jīng)同源比對，篩選并下載不同物種的WRKY20序列（表1）。利用DNAMAN軟件對9種植物的WRKY20蛋白序列進(jìn)行多序列比對，并通過MEGA X軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹（bootstrap值為1 000）。利用STRING數(shù)據(jù)庫推測CsWRKY20的互作蛋白。

1.CsWRKY20的表達(dá)分析

使用植物RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）分別提取各個器官的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)CsWRKY20編碼區(qū)序列設(shè)計特異性引物RT-CsWRKY20F（5'-TGCTA-AGTACAAGCTCTTGTCTC-3'）和RT-CsWRKY20R（5'-TTCAAGTTGGTAAGAAGAACAGGA-3'）用于熒光定量RT-PCR實驗，以檢測CsWRKY20在黃瓜不同器官以及高溫脅迫處理后的表達(dá)情況。使用康為世紀(jì)的UltraSYBR Mixture試劑盒進(jìn)行分析，PCR體系和程序見試劑盒說明書。以黃瓜Actin（Csa6G484600）基因為對照，利用2法計算基因的相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1CsWRKY20基因克隆及其編碼蛋白理化性質(zhì)

利用特異性引物擴(kuò)增Cs WRKY20基因的CDS區(qū)域，獲得一條清晰明亮的條帶（圖1），測序結(jié)果顯示，CsWRKY20基因CDS序列長度為1602bp，共編碼533個氨基酸。CsWRKY20蛋白分子量為132959.43Da，等電點為4.97；屬于親水性蛋白，其中第477位氨基酸殘基的疏水性最強(qiáng)，為1.744，第490位的氨基酸殘基親水性最強(qiáng)，為-3.178;二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、a-螺旋、延伸鏈和轉(zhuǎn)角組成，其中無規(guī)則卷曲占比最高（74.48%），其余依次是延伸鏈（14.82%）、a-螺旋（6.57%）和轉(zhuǎn)角（4.13%）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CsWRKY20蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.2CsWRKY20的進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對9條WRKY20蛋白序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果（圖2）表明，CsWRKY20與甜瓜的CmWRKY20同源性最高，相似度達(dá)97.37%：與冬瓜、印度南瓜、野生灰籽南瓜、中國南瓜、美洲南瓜、胡桃、擬南芥的WRKY20蛋白同源性依次降低，相似度分別為84.11%、79.83%、79.48%、79.31%、78.97%、57.31%。此外，這些序列在N端均含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，且含有兩個半胱氨酸（cysteine，C）和兩個組氨酸（histidine，H），即C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，故將CsWRKY20歸納在WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的I類亞家族。

為了分析CsWRKY20的親緣關(guān)系，利用CsWRKY20與其他物種的17條WRKY20蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，18條蛋白序列分為兩組，所有葫蘆科蛋白聚為一組，其余蛋白序列聚為一組。CsWRKY20與甜瓜的Cm-WRKY20聚在同一亞組，說明它們的親緣關(guān)系較近，與多序列比對結(jié)果一致。使用NCBI的Con-served Domain Database對18條蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Motif 1和Motif 2包含保守序列WRKYGQK。除了苦瓜的McWRKY20不含有Motif 3，其他序列都含有相似的Motif。

2.3啟動子元件分析

利用PlantCARE對CsWRKY20啟動子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果（表2）表明，除了含有真核生物啟動子固有的TATA區(qū)和CAAT區(qū)外，CsWRKY20啟動子區(qū)域還包含2個防御脅迫響應(yīng)元件、1個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、1個脫落酸響應(yīng)元件和13個光周期響應(yīng)元件。

2.4CsWRKY20基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)模式

由圖4可見，CsWRKY20在黃瓜果刺中相對表達(dá)量最高，其次是根、莖、葉、子葉、果皮、花瓣、卷須中，雄蕊中相對表達(dá)量最低。

2.5CsWRKY20基因在高溫脅迫處理下的表達(dá)模式

圖5結(jié)果顯示．CsWRKY20在42℃高溫脅迫1h的表達(dá)水平顯著升高，為未處理時表達(dá)量的2.1倍；之后表達(dá)量下降，于6h后恢復(fù)到未處理時的水平。說明CsWRKY20可在短時內(nèi)響應(yīng)高溫的誘導(dǎo)。

2.6CsWRKY20互作蛋白預(yù)測分析

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入CsWRKY20蛋白序列，通過擬南芥WRKY20同源蛋白構(gòu)建互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，推測CsWRKY20的互作蛋白。結(jié)果（圖6）顯示，WRKY20與WRKY21、NAC084、乙烯響應(yīng)因子ERF094、絲裂原活化蛋白激酶MPK19、GTP酶激活蛋白（T24P15.10和T10K17.140）、高速泳動蛋白HMGB6等具有互作關(guān)系，推測CsWRKY20可能通過與這些蛋白的互作發(fā)揮作用。

3討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物生長發(fā)育過程中一類重要的調(diào)節(jié)因子，能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫，并賦予植物多種脅迫抗性。本研究采用同源克隆方法克隆到黃瓜CsWRKY20基因，其CDS序列長度為1602bp，編碼533個氨基酸。CsWRKY20蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、a-螺旋、延伸鏈和轉(zhuǎn)角組成，含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，故將其歸屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的I類亞家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測其主要位于細(xì)胞核中。同源進(jìn)化分析表明該蛋白與甜瓜的CmWRKY20親緣關(guān)系最近。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。擬南芥中WRKY20響應(yīng)依賴茉莉酸和水楊酸信號，參與了益生細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌（Ba-cillus amyloliquefaciens）介導(dǎo)的提高作物抗逆性過程。大豆CsWRKY20在增強(qiáng)耐旱性和調(diào)節(jié)ABA信號方面發(fā)揮重要作用：一方面作為轉(zhuǎn)錄激活子提高了蠟質(zhì)合成關(guān)鍵基因表達(dá)，促進(jìn)蠟質(zhì)合成，使植物合成較厚角質(zhì)層，減少非依賴于氣孔的水分喪失：另一方面通過增強(qiáng)氣孔對ABA開度的敏感性促進(jìn)植物在受到干旱脅迫時關(guān)閉氣孔，減少依賴于氣孔的水分喪失。本研究在CsWRKY20啟動子上發(fā)現(xiàn)了多個響應(yīng)激素信號通路和逆境脅迫的元件，如防御脅迫響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件和光周期響應(yīng)元件，表明其可能通過這些元件受相應(yīng)的信號誘導(dǎo)表達(dá)。

植物遭受高溫脅迫后，會引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加、磷脂酸積累以及活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）爆發(fā)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、植物激素合成等途徑響應(yīng)高溫脅迫。鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）是Ca2+結(jié)合信號，普遍存在于真核生物中。在擬南芥中，WRKY7/11/15/17/21/39/74均含有鈣調(diào)蛋白的保守結(jié)合位點：鈣調(diào)蛋白可以與WRKY53結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)：WRKY28受到氧化脅迫時表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)WRKY28的轉(zhuǎn)基因植株抗逆性顯著增強(qiáng)：WRKY39黨茉莉酸和水楊酸的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步研究表明，WRKY39正調(diào)控植株響應(yīng)熱脅迫過程中茉莉酸和水楊酸激活信號通路之間的相互作用。小麥TaWRKY33受高溫、ABA和茉莉酸的誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)Ta WRKY33能提高植株對高溫的抗性。本研究結(jié)果表明，CsWRKY20在高溫處理1h的表達(dá)水平顯著升高．6h后恢復(fù)到初始水平，說明其可受高溫誘導(dǎo)短時上調(diào)表達(dá)。

本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫推測了CsWRKY20的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)其可能與絲裂原活化蛋白激酶MPK19相互作用。植物在受到高溫脅迫時，會激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。如：MAPK可通過磷酸化熱激轉(zhuǎn)錄因子HsFA3來調(diào)控番茄對熱脅迫的響應(yīng)：當(dāng)馬鈴薯受到高溫脅迫時，StMPK1的表達(dá)顯著上升。

綜上，本研究通過同源克隆獲得了黃瓜CsWRKY20基因，其編碼533個氨基酸，在果刺中和高溫脅迫1h的相對表達(dá)量最高，推測其可能響應(yīng)高溫脅迫。今后將利用過表達(dá)和敲除實驗對CsWRKY20的功能做進(jìn)一步分析和驗證，以期為闡明該基因在黃瓜抗逆中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。