摘要：以曬青毛茶為原料，利用雜色曲霉進行固態(tài)發(fā)酵。通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗，以發(fā)酵茶葉感官評分及茶多酚含量為考察指標(biāo)，對菌種添加量、外加水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度4個因素進行黑茶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究。結(jié)果表明，當(dāng)菌種添加量為14.5%、外加水量為25%、發(fā)酵溫度為32 ℃、發(fā)酵時間為10 d，發(fā)酵得到的茶葉感官評分為（91.00±2.29）分，茶多酚含量為（17.84±0.28）%。此工藝條件下制得的黑茶外形勻整、湯色紅濃明亮、香氣純正、滋味醇厚，且茶多酚含量高。

關(guān)鍵詞：雜色曲霉；發(fā)酵工藝；茶多酚；感官評分；響應(yīng)面

中圖分類號：TS272.5" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文章編號：1000－3150（2024）07-41-8

Study on the Optimization of Solid Fermentation Process of

Aspergillus versicolor to Sun-dried Green Tea

WANG Ruliang1，2， WANG Hongyue2， XU Conghua1， MA Tingjun1*

1. College of Food Science and Engineering， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China;

2. China Agricultural University， Beijing 100083， China

Abstract： In this study， Aspergillus versicolor was used as raw material for solid fermentation. Through the design of univariate experiment and response surface experiment， the sensory score of fermented tea and the content of tea polyphenols were taken as the investigation index， and the fermentation process conditions of black tea were studied by four factors： bacterial addition amount， added water volume， fermentation time and fermentation temperature. The results show that when the bacterial addition amount was 14.5%， the added water was 25%， the fermentation temperature was 32 °C， and the fermentation time was 10 days， the sensory score of tea was 91.00±2.29， and the content of tea polyphenols was （17.84±0.28）%. Under these processing conditions， the black tea had a uniform shape， red and bright soup color， pure aroma， mellow taste and high tea polyphenol content.

Keywords： Aspergillus versicolor， fermentation process， tea polyphenols， sensory score， response surface

黑茶屬于后發(fā)酵茶，是六大茶類之一，作為一類具有重要經(jīng)濟和保健價值的微生物發(fā)酵茶，與微生物存在密切的聯(lián)系，在黑茶加工儲存過程中都有微生物參與[1]。發(fā)酵（渥堆）工藝是各類黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵，不同類別黑茶都很關(guān)注發(fā)酵（渥堆）工序的裝備和工藝創(chuàng)新，以提高作業(yè)效率和茶葉品質(zhì)[2]。傳統(tǒng)黑茶制作靠自然微生物的作用，發(fā)酵周期長，質(zhì)量不夠穩(wěn)定，研究人員通過接種綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母等單一或混合菌種或外加酶進行發(fā)酵，可以改善上述缺陷[3-4]。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，是形成茶葉色香味的主要成分之一，也是茶葉中具有保健功能的主要成分之一[5]。茶多酚的含量對茶葉品質(zhì)本身有較大影響，占茶葉干物質(zhì)量的14%～24%，是茶葉獨特風(fēng)味形成不可缺少的一種物質(zhì)[6]，具有預(yù)防非酒精性脂肪肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[7-9]。

渥堆是黑茶加工工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，渥堆過程的溫濕度條件有利于多酚類化合物在水熱作用下發(fā)生反應(yīng)，去除青澀味，同時形成大量的色、香、味物質(zhì)，而且有利于在黑茶風(fēng)味形成過程中起到重要作用的微生物的生長。黑茶渥堆過程中的環(huán)境因素主要包括溫度、濕度和含水量等[10]。而渥堆效果是由多方面因素決定的，其主要影響因素有外界環(huán)境、渥堆時間和茶葉中微生物的生長情況[11]。

研究發(fā)現(xiàn)雜色曲霉具有較強的產(chǎn)酚酸能力，因此本研究擬利用實驗室分離到的雜色曲霉固態(tài)發(fā)酵曬青毛茶，以發(fā)酵成茶的感官評分與其茶多酚含量為指標(biāo)，單因素試驗確定菌種添加量、外加水量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度，并通過響應(yīng)面法進行優(yōu)化，以得到一款茶多酚含量高且口感好的黑茶。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

曬青毛茶（湖北竹溪），實驗室從湖北竹溪黑茶中分離得到的雜色曲霉菌種（經(jīng)過鑒定為純菌種），甲醇、碳酸鈉（北京化工廠），沒食子酸（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），福林酚（Sigma公司），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）。

1.2" 儀器與設(shè)備

電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），單人單面垂直超凈工作臺（北京金利順騰科技有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），可調(diào)節(jié)式封閉電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），生物顯微鏡（麥克奧迪），微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司），水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州翔天實驗儀器廠），臺式低速離心機（長沙易達儀器有限公司），紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市中環(huán)實驗室電爐有限公司）。

1.3" 方法

1.3.1" 孢子菌懸液的制備

參考鄭城欽等[12]的方法制備孢子菌懸液：菌種PDA活化→無菌水洗脫→錐形瓶→調(diào)節(jié)孢子量（1.0×107 CFU/ mL），于4 ℃保存。

1.3.2" 真菌菌種發(fā)酵曬青毛茶工藝流程

真菌菌種發(fā)酵曬青毛茶工藝流程參考吳凱為[13]的方法。

茶葉滅菌：稱取20 g茶葉置于250 mL的錐形瓶中，在121 ℃環(huán)境下滅菌20 min。

接種發(fā)酵：滅菌后室溫放置30 min后使用孢子懸液（1.0×107 CFU/mL）進行接種，接種添加量為15%，外加水量10%，在溫度28 ℃的環(huán)境下進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵7 d后取出。

烘干成茶：在60 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，制得成茶。

1.3.3" 單因素試驗

菌種添加量的確定：固定外加水量10%，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，考察菌種添加量5%、10%、15%、20%、25%對發(fā)酵成茶感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響。

外加水量的確定：固定菌種添加量15%，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度28 ℃，考察外加水量10%、15%、20%、25%、30%對發(fā)酵成茶感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響。

發(fā)酵溫度的確定：固定菌種添加量15%，外加水量10%，發(fā)酵時間7 d，考察發(fā)酵溫度26、28、30、32、34 ℃對發(fā)酵成茶感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響。

發(fā)酵時間的確定：固定菌種添加量15%，外加水量10%，發(fā)酵溫度28 ℃，考察發(fā)酵時間3、7、10、15、20 d對發(fā)酵成茶感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響。

1.3.4" 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果分析，以A-菌種添加量（%）、B-外加水量（%）、C-發(fā)酵溫度（℃）、D-發(fā)酵時間（d）為因素，以感官評分值和茶多酚含量為響應(yīng)值，利用Box-behnken中心組合原理進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

1.3.5" 感官審評

按照設(shè)計試驗方案進行調(diào)配，感官評分采取百分制。由10名專業(yè)人員對發(fā)酵成茶進行綜合感官評價，評價指標(biāo)參考《茶葉感官審評方法》（GB/T 23776—2018）[14]，從茶葉的外形、湯色、香氣、滋味、葉底5個方面進行評價，計算總分。

1.3.6" 茶多酚含量測定

茶葉中茶多酚含量的測定參照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）[15]。

1.3.7" 數(shù)據(jù)處理及分析

每組試驗均設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)均采用Excel和SPSS 23.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行方差分析和顯著性比較，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同菌種添加量對發(fā)酵茶葉感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響

不同菌種添加量對發(fā)酵茶葉感官評分及茶多酚含量的影響如圖1所示。菌種添加量為15%時，黑茶茶多酚含量最高、感官評分也最高。菌種添加量過少，茶葉發(fā)酵不充分，湯色黃亮，苦澀味較重；菌種添加量過高，茶葉外形色澤不均勻，斑點較多。因此確定發(fā)酵茶葉的菌種添加量為15%。

2.2" 不同外加水量對發(fā)酵茶葉感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響

水分含量的高低除了影響微生物的生長繁殖及活動外，也是渥堆過程中各種生物化學(xué)變化的直接參與者。水分含量過低會抑制微生物的生長，而過高則會導(dǎo)致一部分水溶性物質(zhì)被水帶走，不利于茶葉品質(zhì)的形成[16]。所以，保證發(fā)酵過程中適宜的水分含量是發(fā)酵出高品質(zhì)茶葉必不可少的條件。由圖2可知，隨著外加水量的增加，發(fā)酵茶葉茶多酚含量先升高后降低，當(dāng)外加水量為25%時，感官評分及茶多酚含量均最高，可能是因為在此條件下，雜色曲霉活性最高，通過濕熱作用產(chǎn)生較多多酚類化合物。因此確定外加水量為25%。

2.3" 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵茶葉感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響

適宜的溫度和濕度有利于渥堆過程中茶葉自身的酶促反應(yīng)、微生物的活動和其余酶類的活性。溫度過低或過高都會對化學(xué)反應(yīng)的進行產(chǎn)生抑制作用，由圖3可以看出，茶多酚含量在發(fā)酵溫度從26 ℃升至30 ℃時迅速降低，而后又隨發(fā)酵溫度的升高先升高后降低。茶多酚含量降低的原因可能是在黑茶加工過程中，茶葉中的黃烷醇類物質(zhì)經(jīng)過各種氧化反應(yīng)，產(chǎn)生包括茶紅素、茶褐素等其他聚合產(chǎn)物；在32 ℃時，茶多酚含量增加的原因可能是在此溫度下，雜色曲霉活性最高，產(chǎn)生了更多多酚類化合物。此外，感官評分在發(fā)酵溫度32 ℃時最高。因此確定發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.4" 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵茶葉感官品質(zhì)及茶多酚含量的影響

適宜的發(fā)酵時間是生產(chǎn)口感醇和、湯色紅濃的高品質(zhì)茶葉的必要條件。時間過短會導(dǎo)致物質(zhì)轉(zhuǎn)化率低、風(fēng)味粗老，從而影響黑茶茶葉品質(zhì)的形成；時間過長則會出現(xiàn)漚味及酸餿味，同時難溶物質(zhì)被降解生成更多的可溶性成分，導(dǎo)致內(nèi)含物質(zhì)含量降低，茶葉中的營養(yǎng)物質(zhì)也會逐漸被大量消耗[17]。由圖4可見，感官評分隨發(fā)酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為10 d時，感官評分最高；茶多酚含量在發(fā)酵7 d時最高，而后呈下降趨勢，可能是因為發(fā)酵時間越長，雜色曲霉通過生化反應(yīng)將多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)導(dǎo)致茶多酚含量減少。雖發(fā)酵時間為7 d時，茶多酚含量最高，但此條件下的發(fā)酵茶其湯色偏黃且口感苦澀不醇厚。因此選擇發(fā)酵時間為10 d，此條件既可保證發(fā)酵茶的感官評分最高，且避免更多茶多酚的流失。

2.5" 響應(yīng)面試驗分析

2.5.1" 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，以菌種添加量（Ａ）、外加水量（Ｂ）、發(fā)酵溫度（Ｃ）、發(fā)酵時間（D）為自變量，設(shè)計四因素三水平試驗方案（表1），以感官評分、茶多酚含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計四因素三水平試驗得到各試驗組感官評分及茶多酚含量（表2）。

2.5.2" 模型方程的建立及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對以上感官評分、茶多酚含量數(shù)據(jù)進行擬合，建立A、B、C、D

4個因素與感官評分、茶多酚含量Y的二階響應(yīng)回歸模型，進一步分析各因素對響應(yīng)值Y的影響，擬合二次多項式方程如下。

感官評分Y1 = 89.20+0.25A－0.21B+0.21C+0.33D－0.38AB－0.38AC+0.75AD－0.75BC+0.00BD+0.50CD－2.35A2－1.66B 2－3.04C 2－1.85D" 2，茶多酚含量Y2=17.53－0.51A+0.027B－0.078C－0.36D+0.19AB+0.88AC+0.60AD－0.35BC+0.14BD+0.15CD－0.68A2－1.63B 2－1.31C 2－1.68D 2。

通過進行回歸模型的顯著性分析，結(jié)果見表3、表4。由兩表可知，該模型P＜0.01，模型的顯著性水平為極顯著。失擬項P1=0.947 3、P2=0.259 5，均大于0.05，沒有顯著差異，說明該模型的擬合度良好。該模型的決定系數(shù)分別為R12=0.923 9、R22 = 0.908 2，均大于0.8，表明模型能夠較好地預(yù)測和分析實際情況，調(diào)整決定系數(shù)R12Adj=0.961 9、R22Adj=0.816 4，表明4個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系能夠較好地被該模型反映出來。

多元二次回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果中，各因素的F值反映了此因素對試驗指標(biāo)的重要程度，通過表3能夠得出，感官評分受4個因素的影響依次為D gt;A gt;B = C，即發(fā)酵時間gt;菌種添加量＞外加水量=發(fā)酵溫度。模型二次項A2、B 2、C 2、D 2對感官評分影響極顯著（P＜0.01）；一次項D和二次項AD、BC交互作用影響顯著（P＜0.05）；其余項對感官評分影響不顯著。剔除二次多項式中的不顯著項，將擬合方程修正為：Y1=89.20+0.33D+0.75AD－0.75BC－2.35A2－1.66B 2－3.04C 2－1.85D 2。

通過表4能夠得出，茶多酚含量受4個因素的影響依次為Agt;D gt;C gt;B，即菌種添加量gt;發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度gt;外加水量。模型一次項A和二次項AC、A2、B 2、C 2、D 2對響應(yīng)值茶多酚含量影響極顯著（P＜0.01）；一次項D影響顯著（P＜0.05）；其余項對茶多酚含量影響不顯著。剔除二次多項式中的不顯著項，將擬合方程修正為：Y2=17.53－0.51A－0.36D+0.88AC－0.68A2－1.63B 2－1.31C 2－1.68D 2。

2.5.3" 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面圖，分析菌種添加量（A）、外加水量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）對發(fā)酵成茶感官評分及茶多酚含量的影響情況（圖5、圖6）。響應(yīng)曲面圖趨于弧形，曲面坡度陡峭，且投射下來的等高線數(shù)量越多，說明兩個因素的交互作用愈顯著，反之，響應(yīng)曲面圖趨于平面，曲面坡度平緩，且投射下來的等高線數(shù)量越少，說明兩個因素的交互作用不顯著。所以由圖5可以看出，菌種添加量與外加水量、發(fā)酵溫度的交互作用不顯著，發(fā)酵時間與外加水量、發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。而發(fā)酵時間與菌種添加量、發(fā)酵溫度與外加水量間交互顯著。由圖6可以看出，菌種添加量與發(fā)酵溫度的交互作用明顯，其余均不明顯，且茶多酚的含量隨菌種添加量的升高呈先升高到達峰值后再下降的趨勢，所以菌種添加量對發(fā)酵茶葉中茶多酚的含量影響最顯著。

2.5.4" 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件，并結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出茶葉發(fā)酵的最佳工藝為：菌種添加量14.51%、外加水量24.90%、發(fā)酵溫度31.99 ℃、發(fā)酵時間9.86 d。在此條件下，預(yù)測發(fā)酵茶的感官評分為89.139 1分、茶多酚含量為17.589 3%。綜合考慮實際情況，將工藝條件調(diào)整為菌種添加量14.5%、外加水量25%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間10 d進行驗證試驗，在此條件下重復(fù)3次，感官評分為（91.00±2.29）分，茶多酚含量為（17.84±0.28）%。與模型預(yù)測值基本相符，證明此模型有效可靠。

3" 小結(jié)與討論

目前已有大量研究表明，微生物對黑茶發(fā)酵過程起著至關(guān)重要的作用，微生物可在濕熱作用下發(fā)生氧化、縮合、降解等一系列反應(yīng)，得到大量活性產(chǎn)物。在食品工業(yè)中采用微生物來提高產(chǎn)品質(zhì)量有較為廣泛的應(yīng)用，通常經(jīng)過接種特定固體菌劑來達到生產(chǎn)目的，且方法安全、可靠。本研究所采用的雜色曲霉經(jīng)過試驗證明具有較高的產(chǎn)酚酸能力，且可制備為固體菌粉以便于保存。利用人工接種該雜色曲霉進行固態(tài)發(fā)酵曬青毛茶，以感官評分及茶多酚含量為指標(biāo)，對菌種添加量、外加水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的單因素試驗及響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析和討論，得到了發(fā)酵曬青毛茶的最佳工藝，結(jié)果表明當(dāng)菌種添加量為14.5%、外加水量為25%、發(fā)酵溫度為32 ℃、發(fā)酵時間為10 d時，發(fā)酵得到的茶葉感官評分為（91.00±2.29）分，茶多酚含量為（17.84±0.28）%。此工藝條件下制得的黑茶外形勻整、湯色紅濃明亮、香氣純正、滋味醇厚，且茶多酚含量高。

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基金項目：北京現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系（BAIC09-2023）

作者簡介：王如良，男，副教授，主要從事茶葉加工技術(shù)與檢測研究。*通信作者，E-mail：mtingjun@163.com