【關鍵詞】支氣管哮喘；NLR家族的Pyrin域蛋白3；Th17/Treg；氣道慢性炎癥

【中圖分類號】R332.3 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2023-11-29

氣道慢性炎癥是哮喘的病理基礎，很多研究證實NLR 家族的NLRP3（NLR family，pyrin domaincontaining protein 3）炎性小體參與哮喘等氣道疾病的炎癥過程[1-2]。NLRP3 控制caspase-1 的活化，調控IL-1β等促炎細胞因子的修飾與活化，IL-1β可以促進Th17的分化、維持Th17相關細胞因子的產生，也可以促進嗜酸性粒細胞的募集[3]。激活NLRP3炎癥小體對調節(jié)Th17和Treg的控制有重要的作用[4]。已經證實Th17/Treg 平衡失調介導哮喘氣道炎癥，是哮喘重要的發(fā)病機制之一[5]。因此，本研究推測NLRP3炎癥小體參與Th17/Treg平衡失調介導的氣道炎癥發(fā)病過程，目前尚未見相關報道。MCC950是作用強且具有特異性的NLRP3炎癥小體抑制劑，常常選用MCC950作為NLRP3相關疾病動物模型的干預劑[6]。本研究擬建立哮喘小鼠模型，通過NLRP3抑制劑MCC950干預，觀察Th17/Treg水平及其細胞因子水平、肺組織病理學改變和肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白水平，探討NLRP3炎癥小體介導Th17/Treg失衡在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及其機制，并為哮喘的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

無特定病原體6～8 周18～20 g BALB/C 雌性小鼠（萊彼特生物科技有限公司，重慶）倫理批準號MKLLY（A）-2021-128；OVA（美國 Sigma公司）；MCC950（美國MedChe?mExpress 公司）；NLRP3 抗體（美國GeneTex 公司）；Anti-Caspase-1抗體（英國abcam公司）；FITC anti-mouse CD4、PEanti-mouse CD25、APC anti-mouse CD127（IL-7Rα）、PerCPanti-mouse CD45、PE anti-mouse IL-17（美國Biolegend 公司）；小鼠IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35 的ELISA試劑盒（江萊生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠分組、模型的建立與干預 32只無特定病原體6～8周BALB/C雌性小鼠隨機分為哮喘模型組（AS組）、正常對照組（NS組）、MCC950干預組（MC組）及地塞米松組（Dex組），每組8只。參照Kim DI等[7]制作哮喘小鼠模型的方法，并根據本課題組[8]多年制作哮喘小鼠模型的方法進行改進，AS組第1天和第13天給予小鼠10% OVA氫氧化鋁凝膠混懸液腹腔注射聯(lián)合頸部及雙側大腿根部皮下注射以致敏，第19～23天每天給予小鼠10% OVA霧化吸入激發(fā)。NS組：注射劑OVA以PBS代替、霧化用生理鹽水代替，余處理同哮喘組。MC組和Dex組分別采用MCC950和地塞米松干預，具體方法是在AS組處理的基礎上每次霧化激發(fā)前30 min分別腹腔注射MCC950 10 mg/kg[9]和地塞米松2 mg/kg[10]進行干預。

1.2.2 外周血、支氣管肺泡灌洗液、肺和脾組織標本采集與制備 末次激發(fā)24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，眼眶靜脈叢采血用于制作外周血單個核細胞懸液（peripheralblood mononuclear cell，PBMC），然后打開腹腔，腹主動脈處放血，取脾臟備用。打開胸腔，暴露雙肺，結扎右肺肺門，取出整個右肺，右肺中葉用于制作單個核細胞懸液；右肺下葉置于4%多聚甲醛常溫固定，后續(xù)免疫組織化學（immunohis?tochemistry，IHC）檢測。暴露頸部氣管，在環(huán)狀軟骨上方用靜脈留置針插管固定，無菌PBS灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），30 min 內行細胞計數，1 200 r/min 4 ℃離心，取沉渣涂片瑞氏吉姆薩染色，其余標本迅速凍存在-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外周血、脾及肺組織單個核細胞懸液的制備 ①PBMC的制備：加入等量的樣本稀釋液到采集血液中混勻，小心加至淋巴細胞分離液上層，吸取PBMC，裂紅離心棄上清，800 μLPBS重懸計數。②脾組織單個核細胞懸液的制備：取新鮮小鼠脾臟，冷PBS清洗放到40 μm細胞篩網，注射器活塞輕柔按壓研磨，用3 mL PBS 輕輕沖洗篩網。余步驟同PBMC。③右肺中葉單個核細胞懸液的制備：先配制酶消化工作液，按照銀維謀[11]等的方法用，1 mg/mL膠原酶（collagenase V）+0.2 mg/mL DNse I，溶于1640培養(yǎng)基中，將取出的右肺中葉用冷的PBS清洗，加入1 mL酶消化工作液；剪碎肺組織，37 ℃搖床消化30～40 min；其余步驟同脾組織單個核細胞懸液的制備。

1.2.4 外周血、肺及脾單個核細胞懸液流式細胞染色 參照劉紅云等[12-13]流式細胞技術檢測Th17和Treg流式細胞染色的方法，按照說明書使用。①Treg染色：將前面的單個核細胞懸液計數，分裝，分別加染色抗體和對照CD4、CD45、CD25、CD127；4 ℃避光孵育；2%多聚甲醛4 ℃避光固定，洗滌、離心棄上清；Staining Buffer重懸，上機。②Th17染色：取前面剩余單個核細胞懸液進行計數，按照（1～2）×10⁶/mL個細胞，加入1640培養(yǎng)基+血清鋪板；加三聯(lián)體Cell activationcocktail with Brefeldin A（PMA+離子霉素+高爾基體阻斷劑）混勻后37 ℃培養(yǎng)4～6 h；收集細胞，染色緩沖液重懸；表面染色，分別加入CD4、CD45、CD69和對照CD4、CD45；固定破膜，加入Cyto-Fast? Fix Perm Buffer，室溫避光孵育，洗滌，Cyto-Fast? Perm Wash Solution 重懸；胞內染色，加入Cyto-Fast? Perm Wash Solution，分別加IL-17抗體和IL-17對照抗體，室溫避光孵育；洗滌、離心、棄上清；加入Cell StainingBuffer重懸，上機。

1.2.5 肺組織石蠟切片的制作 肺組織在4%的多聚甲醛固定14～20 h，分別置于50%和70%乙醇12 h和4 h，80%和90%乙醇30min，95%和100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡45 min，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。

1.2.6 NLRP3、caspase-1蛋白水平免疫組化 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復后自然降到常溫，3%的H₂O₂室溫避光孵育，封閉用山羊血清封閉，滴加相應一抗孵育沖洗后滴加對應的二抗及DAB顯色，設空白對照，陰性對照和陽性對照，陽性表達為黃色、淡黃色和棕黃色。用LeicaV4.2采圖系統(tǒng)采圖；每組在相同條件下隨機選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應用圖像分析軟件Image-proplus 6.0，以積分光密度及區(qū)域為指標進行定量分析，計算平均積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.2.7 BALF 中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35濃度（ELISA） 平衡至室溫，按說明書配制標準品工作液濃度梯度分裝，設立復孔和空白對照，配制洗滌緩沖液、生物素化抗體工作液和酶結合物工作液即配即用。按操作步驟分別加樣、加生物素化抗體、酶結合物工作液、加底物、終止，用450 nm波長對各孔吸光度（absorbance，A）值進行測量。采用ELISAcalc 軟件繪制標準曲線，以標準濃度為橫坐標（X軸），對應的A 450 nm值為縱坐標（Y軸），繪制出標準品的線性回歸線，按曲線方程計算各樣本的濃度值（以Y值計算X值）再乘以稀釋倍數，得出對應的濃度（pg/mL）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件分析數據，根據資料的屬性對各組數據進行統(tǒng)計分析，以均數±標準差（x±s）表示。對多樣本均數比較時采用單因素方差分析，有差異者進一步采用LSD-t 檢驗行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學的變化

AS組小鼠經過OVA 致敏和激發(fā)后，表現(xiàn)出呼吸急促、時而躁動不安、抓耳撓腮，時而精神萎靡、口唇、眼瞼發(fā)紺、進食差、不活潑、活動減少；MC組、Dex組上述表現(xiàn)較AS組明顯減輕，NS組無上述表現(xiàn)。

2.2 BALF總細胞計數、瑞士-吉姆薩染色白細胞分類計數的變化

AS組細胞計數、白細胞計數及嗜酸性粒細胞占白細胞分類計數百分比較NS組增高；MC組、Dex組較AS組降低，均Plt;0.01。見表1、圖1。

2.3 流式細胞技術檢測外周血、肺及脾組織單個核細胞懸液CD4細胞Th17比例和Treg比例及Th17/Treg比例的變化

參照流式細胞技術[14-15]檢測Th17、Treg細胞的方法，以CD4 細胞IL-17（CD4⁺IL-17⁺）和CD4⁺CD25⁺CD127^low 占CD⁴⁺細胞比例分別反映Th17和Treg水平。AS組外周血、肺、脾組織單個核細胞懸液中Th17較NS組高，Treg較NS組低，MC組、Dex 組Th17 較AS 組減低，Treg 較AS 組升高，P=0.000。見圖2、3、4，表2。

2.4 肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白水平的變化

NLRP3主要表達在肺上皮細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞，Caspase-1蛋白在肺和脾臟中大量表達，染色中黃色、棕黃色為其陽性表達，見圖5。AS組NLRP3、Caspase-1肺組織蛋白水平較NS組高，MC組、Dex組較AS低，P=0.000。見圖6，表3。

染色中黃色、棕黃色為其陽性表達，AS組小鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1 的表達呈強陽性，NS 組表達較弱；MCC950及地塞米松干預后上述蛋白的表達強度較AS組進一步減弱。

2.5 BALF 中IL-17A、IL-1β、IL-10、IL-18、IL-33、IL-35 濃度變化

AS組BALF的IL-17A、IL-1β、IL-18及IL-33濃度較NS增高，P 均lt;0.01，IL-10、IL-35 濃度較NS 降低，Plt;0.05；MC組、Dex 組IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33 濃度較AS 組降低，P 均lt;0.01，IL-10、IL-35濃度較AS組高，Plt;0.05；見表4。

3 討 論

哮喘的發(fā)病機制復雜，現(xiàn)有的理論不能完全闡明哮喘的發(fā)病機制，使哮喘的控制面臨巨大的挑戰(zhàn)，進一步深入研究哮喘的發(fā)病機制有重要意義。研究表明，哮喘患者中存在Th17/Treg 細胞平衡失調，NLRP3參與哮喘的發(fā)病過程，本研究通過制作小鼠哮喘模型，探討NLRP3 炎癥小體介導Th17/Treg失衡在哮喘氣道炎癥中的作用，使用NLRP3抑制劑MCC950干預哮喘小鼠，觀察MCC950干預對哮喘小鼠氣道炎癥、Th17/Treg失衡的影響，進一步探討哮喘的發(fā)病機制，并為哮喘的治療提供新的思路。

本研究觀察到AS組的小鼠呼吸頻率增快、呼吸困難、口唇發(fā)紺、煩躁抓耳、活動減少，檢測發(fā)現(xiàn)BALF 細胞計數及EOS 百分比和IL-17A、IL-18 及IL-33濃度增高，通過對肺組織切片HE染色后觀察到以嗜酸性粒細胞為主的氣道炎癥。成功的哮喘動物模型[16-18]表現(xiàn)為氣道炎性指標增加（如BALF的EOS、細胞因子IL-17、IL-18及IL-33等）、肺組織炎癥細胞浸潤、黏液分泌物增多等及氣道反應性增加。評價哮喘動物模型成功的指標包括氣道炎癥細胞浸潤增加和氣道反應性增高。氣道反應性測定包括無創(chuàng)和有創(chuàng)兩種方法，其干擾因素多，實施繁雜，儀器設備昂貴，且不能模擬哮喘自然發(fā)病狀態(tài)，目前應用較少。復習大量國內外哮喘動物模型的相關文獻發(fā)現(xiàn)，大多數研究將以嗜酸粒細胞浸潤為主的氣道炎癥改變作為判斷哮喘小鼠模型成功的主要指標，氣道反應性測定少用。

本研究應用流式細胞技術檢測AS組外周血、肺及脾組織的單個核細胞懸液中Th17占CD4+細胞的百分比均高于NS組，而Treg占CD4⁺細胞的百分比均低于NS組，同時Th17/Treg的比值升高。哮喘發(fā)生與Th17升高、Treg降低及Th17/Treg平衡失調有關。有研究表明哮喘患者病情的嚴重程度與患者外周血中Th17細胞IL-17的表達量呈正相關，其痰液的IL-17A 水平升高[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠中，Th17不僅在外周血中升高，在肺組織、脾組織中同樣升高，考慮哮喘的炎癥不僅累及肺，還在外周血和脾組織中有表達。研究表明Treg的數目變化或功能缺陷也在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[21]。本研究進一步采用MCC950 干預后Th17 比例下降，Treg 比例上升，Th17/Treg 比例較AS 組下降，MCC950干預有助于改善這種平衡失調。文獻報道，MCC950干預抑制小鼠氣管移植后Th1/Th17反應和促進Treg反應改善閉塞性細支氣管炎[22]，未見MCC950改善哮喘Th17/Treg平衡的報道，將為探索哮喘患者NLRP3抑制劑和Th17與Treg調節(jié)作用方面的機制和治療藥物提供新思路。

應用ELISA測各組小鼠BALF液中的Th17相關細胞因子IL-17A 和Treg 相關細胞因子IL-10、IL-35的濃度，結果顯示AS組BALF中IL-17A濃度較NS增高，IL-10、IL-35水平均低于NS組，MC組IL-17A濃度較AS組降低，IL-10、IL-35高于AS組。這一結果表明哮喘小鼠中Th17相關細胞因子增加，Treg相關細胞因子降低。研究表明氣道中IL-17A、IL-17F等因子的水平與哮喘疾病嚴重程度和氣道反應相關[23-24]。Kearley J[25] 等研究發(fā)現(xiàn)將CD4⁺CD25⁺Treg輸入哮喘小鼠體內，分泌的IL-10可緩解哮喘小鼠氣道高反應、減輕嗜酸性粒細胞浸潤，本研究使用OVA建立的哮喘小鼠模型中Treg相關細胞因子降低。與此同時使用MCC950干預可以抑制Th17相關細胞因子IL-17A和促進Treg相關細胞因子IL-10、IL-35 的產生，可以調節(jié)Th17 和Treg 功能，MCC950可能成為Th17/Treg失衡所致哮喘的潛在治療藥物。由此，本研究得出結論哮喘中Th17/Treg比例升高，并且其相關細胞因子水平也有相應改變，Th17/Treg 比例失衡可能是哮喘發(fā)病機制之一。經MCC950干預可調節(jié)Th17/Treg比例失衡和調節(jié)相關細胞因子的濃度。

應用免疫組化法觀察到AS組肺組織NLRP3和Caspase-1蛋白水平高于NS組，ELISA測定顯示AS組BALF中IL-1β、IL-18、IL-33濃度較NS組增高，考慮哮喘小鼠中炎癥小體NLRP3和Caspase-1及其下游細胞因子濃度增加，炎癥小體NLRP3 和Cas?pase-1及其下游細胞因子IL-1β、IL-18、IL-33參與小鼠哮喘的發(fā)生發(fā)展。應用MCC950干預后MC組IL-1β、IL-18、IL-33 濃度較AS 組降低。該結果表明NLRP3、Caspase-1 及其下游細胞因子的增高與哮喘有關，使用MCC950干預后可使其濃度下降，可能有助于哮喘氣道慢性炎癥的控制。Rossios C等[26]研究證實患者痰液樣本中的NLRP3炎癥小體與哮喘病情呈正相關，哮喘病情越重則NLRP3炎癥小體表達水平越高。本研究應用MCC950干預后哮喘小鼠BALF液的IL- 1β、IL-33及IL- 18濃度和肺組織NLRP3 蛋白水平、Caspase-1 蛋白水平較AS 組降低，證實MCC950干預可阻滯哮喘小鼠NLRP3及其下游細胞因子IL- 1β、IL-33及IL- 18表達。IL-1β和IL-18可誘導T細胞向Th1和Th17分化，IL-1β可促進Th17細胞分化、維持Th17相關細胞因子的產生，也可促進嗜酸性粒細胞的募集。在炎癥條件下，在有IL-2存在的前提下IL-1β可誘導Treg轉化為促炎Th17，且在炎癥和自身免疫之間建立起功能聯(lián)系[27]。上述結果證實之前的推測，NLRP3炎癥小體參與Th17/Treg平衡失調介導的氣道炎癥發(fā)病過程，NLRP3炎性小體及其下游細胞因子IL-1β、IL-33及IL-18參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展，MCC950可能是NLRP3炎性小體介導的哮喘氣道炎癥藥物治療的新思路或新途徑。

糖皮質激素因對炎癥細胞、炎癥介質和炎癥反應等多途徑均有抑制作用而成為目前治療哮喘的一線用藥。Dex作為糖皮質激素的代表藥，本研究設立Dex干預組，對比MCC950干預組哮喘小鼠氣道炎癥的影響，結果顯示，Dex干預與MCC950干預相比，Dex組外周血、肺組織及脾組織中Th17較MC低，Treg較MC組高，差異有統(tǒng)計學意義；BALF液中IL-1β、IL-10、IL-17A、IL-33、IL-18 表達及肺組織中Caspase-1 蛋白水平與MC組差異有統(tǒng)計學意義。Dex 組BALF 細胞數、嗜酸性粒細胞比例低于MC組，差異有統(tǒng)計學意義，綜合分析Dex干預哮喘小鼠優(yōu)于MCC950，其機制是糖皮質激素作為抗炎藥從多個環(huán)節(jié)全面抑制哮喘氣道炎癥，MCC950主要作用于NLRP3 及其細胞因子所致的氣道炎癥有關。盡管MCC950對哮喘小鼠作用不如Dex，但非激素類藥物類似于白三烯受體的拮抗劑孟魯司特鈉，也為探索哮喘發(fā)病機制、新藥的研究、聯(lián)合治療等提供新的思路。

綜上所述，在哮喘小鼠模型中，NLRP3、Cas?pase-1及NLRP3下游細胞因子IL-1β、IL-18及IL-33升高，Th17產生的細胞因子IL-17A升高，Treg產生的細胞因子IL-10、IL-35降低，Th17/Treg比例升高，NLRP3炎癥小體可通過介導Th17/Treg失衡，參與或加重哮喘氣道炎癥的發(fā)生。MCC950可通過下調哮喘小鼠Th17 功能，上調Treg 功能，從而調節(jié)Th17/Treg平衡，降低支氣管肺組織IL-17A、IL-1β、IL-18、IL-33、NLRP3 及Caspase-1 水平，上調支氣管肺組織IL-10、IL-35 水平，減輕哮喘氣道炎癥。然而，NLRP3及相關細胞因子的調控以及Th17和Treg之間的轉化調控復雜精細，涉及復雜的炎癥和免疫異常，許多問題還未得到闡釋。因此，進一步研究NLRP3和Th17與Treg在哮喘發(fā)病機理中的作用及相互影響，探索NLRP3 及相關因子的調控和Th17與Treg之間的轉化調控將有助于進一步闡明哮喘的發(fā)病機制，為哮喘的治療提供新的思路。