【關(guān)鍵詞】膿毒癥；延髓內(nèi)臟帶；膽堿能抗炎通路；神經(jīng)炎癥

【中圖分類(lèi)號(hào)】R114 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-07-31

早期感染引起的失控的系統(tǒng)炎癥風(fēng)暴與高死亡率密切相關(guān)[1]，抗炎治療可以顯著改善膿毒癥患者的死亡率和預(yù)后[2]，表明控制膿毒癥系統(tǒng)性炎癥對(duì)改善患者預(yù)后的重要性。雖然神經(jīng)-免疫交互作用在調(diào)控系統(tǒng)性炎癥方面取得重要進(jìn)展[3]，但炎癥調(diào)控的神經(jīng)中樞在膿毒癥中的病理改變及其干預(yù)效應(yīng)尚未明了。延髓內(nèi)臟帶（medullary visceral zone，MVZ）是迷走神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)性炎癥的初級(jí)中樞，同時(shí)將外周炎癥信息傳輸?shù)礁呒?jí)神經(jīng)中樞并接受高級(jí)中樞的調(diào)控[4]，其在系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控中具有關(guān)鍵的作用。先前的研究證實(shí)：MVZ通過(guò)膽堿能抗炎途徑（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）有效地調(diào)節(jié)系統(tǒng)炎癥和免疫，選擇性α7煙堿乙酰膽堿受體激動(dòng)劑3-（2，4-二甲氧基苯基）丙烯堿（GTS-21）明顯降低炎癥介質(zhì)的血清水平[5]，例如可溶性CD14（Presepsin）、高遷移率族蛋白-1（high mobilitygroup box-1，HMGB-1）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、TH17淋巴細(xì)胞百分比；相反，一種強(qiáng)有力的選擇性尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑甲基牛扁亭（methylly?caconitine，MLA）會(huì)惡化膿毒癥的系統(tǒng)炎癥和免疫功能[6-7]。已知GTS-21 和MLA 都可以穿過(guò)血腦屏障[8-9]，同時(shí)，CAP具有廣泛的中樞調(diào)節(jié)作用，如認(rèn)知功能和系統(tǒng)性炎癥[10-11]，因此，GTS-21和MLA除了在外周激活或拮抗CAP影響系統(tǒng)性炎癥外，是否會(huì)進(jìn)入中樞，直接影響CAP的調(diào)節(jié)中樞（MVZ）的神經(jīng)炎癥并影響其結(jié)構(gòu)與功能，從而進(jìn)一步影響其對(duì)系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控尚不得而知。

研究表明[12-13]：系統(tǒng)炎癥會(huì)誘導(dǎo)MVZ的神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致自主的調(diào)控紊亂。臨床上，重癥監(jiān)護(hù)室確診為膿毒癥腦病的患者與無(wú)腦病的患者相比，死亡率顯著提高[14]。由此推測(cè)，MVZ在膿毒癥早期階段受到全身性炎癥的攻擊，這可能是膿毒癥誘導(dǎo)CAP調(diào)節(jié)功能紊亂和早期炎性風(fēng)暴的重要機(jī)制。因此在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究擬探索膿毒癥誘導(dǎo)的MVZ 的病理改變，關(guān)鍵神經(jīng)元的凋亡及其功能狀態(tài)，MVZ神經(jīng)炎癥，損傷及修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)，以明確前期驗(yàn)證的膿毒癥誘導(dǎo)CAP功能低下的原因，同時(shí)，以CAP激活與拮抗進(jìn)行干預(yù)以探索其對(duì)MVZ病理的干預(yù)效應(yīng)，從而探明膿毒癥誘導(dǎo)的MVZ的病理改變并證實(shí)中樞CAP的干預(yù)可能成為膿毒癥系統(tǒng)性炎癥與免疫紊亂的重要手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠（周齡：6周）64只，許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104；購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[出售許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012]，動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。光照/黑暗時(shí)間為12/12 h。溫度控制在（22±2） ℃。濕度保持在（60±10）%。進(jìn)食及飲水自由。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d之后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛(ài)和使用協(xié)定指南執(zhí)行（IACUC），并得到貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：2019007。

1.2 主要試劑

GTS-21，貨號(hào)：29834（dihydrochloride MCE）；MLA，貨號(hào)：HY-N2332A/CS-0021211（MCE）；熒光（FITC）標(biāo)記羊抗兔IgG，武漢博士德生物，貨號(hào)：BA1105；熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗小鼠IgG：武漢博士德生物，貨號(hào)：BA1031；Anti-caspase 3，武漢三鷹生物，貨號(hào)：66470-2-IG；Anti-Tyrosine Hydroxylase，武漢博士德生物，貨號(hào)：BM4568；Anti-Choline acetyltransferase：武漢博士德生物，貨號(hào)：bs-2423R；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，上海翊圣生物，貨號(hào)：40308ES20；DAPI，碧云天，貨號(hào)：C1002；Trizol，Aidlab，貨號(hào)：252250AX；dNTP，TIANGEN，貨號(hào)：#P4325；Taq Plus DNA Polymerase，TIANGEN，貨號(hào)：ET105-01。

1.3 主要儀器

病理切片機(jī)：德國(guó)Leica RM 2016 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；切片刀：日本羽毛R35一次性刀片；組織攤烤片機(jī)：武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機(jī)；顯微鏡：奧林巴斯BX53生物顯微鏡；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：ABI-QuantStudio 6。

1.4 研究方法

1.4.1 動(dòng)物及分組、處理方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組并進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)。對(duì)照組8只：正常飼養(yǎng)，不做任何處理；假手術(shù)組8只：大鼠剖腹暴露盲腸但不進(jìn)行穿刺結(jié)扎，并予哌拉西林（50 mg/kg，腹腔注射，每天3次，連續(xù)3 d）；膿毒癥組共48只，采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿刺法（cecal ligation and puncture，CLP）膿毒癥模型制備[15]，制備成功后隨機(jī)再分為3 組，每組16 只。模型組：予哌拉西林（50 mg/kg，腹腔注射，3次/d，連續(xù)3 d）及生理鹽水（1 mL/100 g，腹腔注射，3次/d，連續(xù)3 d）；GTS-21組，哌拉西林使用同膿毒癥組，并以GTS-21（4 mg/kg[16]，腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d）進(jìn)行干預(yù)；MLA 組：哌拉西林使用同膿毒癥組，并以MLA（4.8 mg/kg[17-18]，腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d）進(jìn)行干預(yù)。3 d后處死大鼠取延髓組織分析。采用MSS（Murine Sepsis Score）評(píng)分系統(tǒng)對(duì)造模進(jìn)行評(píng)價(jià)[19]，根據(jù)大鼠外觀、意識(shí)水平、行為表現(xiàn)、對(duì)刺激的反應(yīng)、睜眼反應(yīng)、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量等進(jìn)行綜合積分，一般積分超過(guò)4分可認(rèn)為膿毒癥造模成功，分值越高，表明膿毒癥越嚴(yán)重[20]。采用3名實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分，取平均值來(lái)評(píng)價(jià)各組大鼠造模后的病情嚴(yán)重程度，見(jiàn)圖1。

1.4.2 病理學(xué)觀察 采用灌注取腦的方式，制備大鼠延髓中尾段的石蠟包埋切片，選取延髓組織（最后區(qū)平面到閂平面）石蠟切片脫蠟、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色、用100倍及400倍光學(xué)顯微鏡重點(diǎn)觀察孤束核、迷走運(yùn)動(dòng)背核與腹外側(cè)核組織病理特點(diǎn)，并使用Image J軟件進(jìn)行手工計(jì)數(shù)各組切片神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量以進(jìn)行定量分析。

1.4.3 TdT mediated dUTP Nick End Labeling（TUNEL）與細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取延髓的石蠟包塊，常規(guī)切片脫蠟，PBS潤(rùn)洗切片，加入2 mg/mL的Proteinase K溶液孵育，在延髓組織上加入TdT孵育緩沖液37 ℃孵育60 min，滴加DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細(xì)胞呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

運(yùn)用常規(guī)的標(biāo)記指數(shù)（LI）表示，選取3個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)視野標(biāo)記指數(shù)=各視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞，每個(gè)病例的凋亡指數(shù)（AI）等于各視野標(biāo)記指數(shù)的平均值

1.4.4 免疫熒光雙標(biāo) 選取延髓中尾段的石蠟包埋切片，分別用于標(biāo)記Caspase 3及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltrans?ferase，CHAT）或酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的一抗混合物中孵育24 h、然后將切片與熒光標(biāo)記的二抗（Cy3，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG）4 h、最后將切片用帶有DAPI 媒介對(duì)切片中所有細(xì)胞進(jìn)行核染色，使用奧林巴斯BX53生物顯微鏡拍攝，用image pro（ipp6.0）軟件分析每組3幅圖像，計(jì)算平均光密度。

1.4.5 RT-PCR 取大鼠延髓組織50 mg，Trizol 法提取RNA，RT逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入所設(shè)計(jì)的引物（表1），實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)（SYBR Green染料法），繪制擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)，以β-actin作內(nèi)參，采用QPCR算法（相對(duì)定量，2-ΔΔCt法）計(jì)算生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（grouth associated protein-43，GAP-43）mRNA，少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（oligodendrocyte transcrip?tion factor 2，Olig-2）mRNA，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular en?dothelial growth factor，VEGF）mRNA，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）mRNA，和基質(zhì)金屬蛋白（matrix metalloprotein，MMP）-9 mRNA的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本比較采用單因素方差分析，先進(jìn)行Leven方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的2組資料之間的比較采用Bonferroni 結(jié)果判定；方差不齊的2 組資料的比較以Tamhane結(jié)果判定；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示。采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

術(shù)后第3 天，膿毒癥模型組共死亡9 只，死亡率為：56.3%；GTS-21組死亡8只，死亡率為：50%；MLA組死亡11只，死亡率為：68.8%；對(duì)照組與假手術(shù)組無(wú)死亡。5組死亡率有明顯差異（χ2=14.210，P=0.003），但膿毒癥模型組、GTS-21 組及MLA 組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.210，P=0.107）。

按照MSS評(píng)分規(guī)則，膿毒癥模型組均造模成功（MSS評(píng)分均大于15分），因此所有模型均造模成功。膿毒癥模型組，GTS-21組及MLA組評(píng)分明顯高于對(duì)照組（P=0.000），且MLA組評(píng)分明顯高于GTS-21組（P=0.000）[21]。

2.1 腦組織大體標(biāo)本觀察

5組大鼠延髓外觀沒(méi)有明顯的差異，腹側(cè)面模型組和MLA組大鼠前正中線(xiàn)稍淺，提示該2組大鼠延髓組織水腫明顯，見(jiàn)圖2。

2.2病理學(xué)觀察

對(duì)照組和假手術(shù)組延髓組織結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，孤束核（nucleus tractus solitary，NTS），背側(cè)迷走運(yùn)動(dòng)核（dorsal va?gus motor nucleus，DVMN），腹內(nèi)測(cè)網(wǎng)狀核（ventrolateral re?ticular nucleus，VLRN）細(xì)胞排列整齊，高倍鏡下神經(jīng)元數(shù)量較多，膠質(zhì)細(xì)胞較少；膿毒癥3組可組織水腫明顯，見(jiàn)神經(jīng)元減少及膠質(zhì)增生；MLA組神經(jīng)元較對(duì)照組和假手術(shù)組明顯減少（123.44±20.20 及112.78±15.59 vs. 80.44±22.44，P=0.001，P=0.024），膠質(zhì)細(xì)胞有增多的趨勢(shì)，細(xì)胞排列紊亂，5組細(xì)胞總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

2.3 TUNEL

從5組大鼠MVZ的TUNEL圖像及凋亡指數(shù)的柱狀圖可以看出：與對(duì)照組及GTS-21組相比，模型組與MLA組大鼠MVZ區(qū)細(xì)胞明顯凋亡，凋亡指數(shù)（AI）高于對(duì)照組（[ 25.40±9.13）% vs. （0.53±0.09）%，P=0.000]，GTS-21具有降低膿毒癥導(dǎo)致的凋亡的趨勢(shì)（[ 17.03±4.16）% vs.（ 25.40±9.13）%，P=0.000]，MLA 較GTS-21 增加凋亡（[ 29.11±4.60）% vs.（17.03±4.16）%，P=0.000]，見(jiàn)圖4。

2.4 免疫熒光雙標(biāo)（CHAT，TH/Caspase 3）

各組TH/ Caspase 3及CHAT/Caspase 3免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示膿毒癥誘導(dǎo)MVZ兒茶酚能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元較對(duì)照組Caspase 3 表達(dá)顯著升高（0.001 94±0.000 72 vs.0.000 39±0.000 34；0.003 38±0.001 25 vs. 0.000 39±0.000 28，P=0.021，P=0.000），TH 表達(dá)顯著降低（0.001 62±0.000 73vs. 0.004 58±0.001 48，P=0.000），但CHAT僅有下降的趨勢(shì)（0.003 70±0.002 82 vs. 0.005 27±0.001 86，P=0.761）；GTS-21具有降低膿毒癥兒茶酚胺能和膽堿能神經(jīng)元Caspase 3表達(dá)（0.002 53±0.001 02 vs. 0.003 38±0.001 25；0.001 16±0.000 82 vs. 0.001 94±0.000 72，P=0.741，P=0.002），并上調(diào)膿毒癥TH 與CHAT 表達(dá)的趨勢(shì)（其結(jié)果分別為0.002 58±0.000 69，0.004 85±0.001 51，P=0.488，P=0.994）；MLA 則促進(jìn)膿毒癥導(dǎo)致的兒茶酚胺能和膽堿能神經(jīng)元Caspase 3表達(dá)（0.003 61±0.001 91，0.003 73±0.001 07，P=0.066，P=0.000），顯著降低TH與CHAT表達(dá)（0.001 17±0.000 69，0.002 41±0.000 47，P=0.000，P=0.019），見(jiàn)圖5、6。

2.5 RT-PCR

以β-actin 作內(nèi)參，計(jì)算GAP-43 mRNA，GFAP mRNA，VEGF mRNA，MMP-9 mRNA and" Olig-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。這些基因的表達(dá)與神經(jīng)炎癥，損失，修復(fù)，髓鞘化，膠質(zhì)化等神經(jīng)重塑密切相關(guān)。與對(duì)照組相比，膿毒癥顯著上調(diào)了關(guān)鍵基因GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 和MMP-9mRNA 的表達(dá)（2.188±0.238 vs. 1.022±0.231，2.825±0.267vs. 1.071±0.062，3.689±0.320 vs. 1.060±0.120，3.169±0.241 vs. 1.073±0.153，P=0.000），下調(diào)了Olig-2 mRNA的表達(dá)（0.534±0.067 vs. 1.027±0.172，P=0.000）。GTS-21 的干預(yù)下調(diào)了膿毒癥GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)（1.655±0.125，1.676±0.106，2.085±0.308，2.043±0.255，P=0.000，P=0.195，P=0.005，P=0.002），具有上調(diào)Olig-2 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)（0.718±0.068，P=0.001）；反之，與GTS-21相比，MLA則顯著上調(diào)了GAP-43 mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)（3.029±0.180，3.756±0.376，4.768±0.342，3.949±0.408，P=0.000），顯著下調(diào)了Olig-2 mRNA 的表達(dá)（0.232±0.053，P=0.000），見(jiàn)圖7。

3 討論

研究表明[22-23]：在膿毒癥大鼠的中樞，LPS能通過(guò)Toll-like receptor 4激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥；此外，外周血循環(huán)中的細(xì)胞因子也能通過(guò)破損的血腦屏障進(jìn)入中樞，直接誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥[24-25]。神經(jīng)炎癥可通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）/STAT3/ERK通路和線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)變性及代謝紊亂[26-27]，并影響區(qū)域神經(jīng)功能。據(jù)此，并結(jié)合前期研究[21]推測(cè)，膿毒癥可誘導(dǎo)MVZ的神經(jīng)炎癥并影響其對(duì)系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控，可能與膿毒癥早期失控的炎癥風(fēng)暴相關(guān)，基于α7nAChR激活可通過(guò)多種途徑保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥的攻擊[28]，激活α7nAChR遏制膿毒癥的炎癥風(fēng)暴可能涉及到其對(duì)中樞MVZ神經(jīng)元的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然膿毒癥早期大鼠腦組織的外觀無(wú)明顯改變，但HE染色發(fā)現(xiàn)，膿毒癥各組MVZ神經(jīng)元明顯下降，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，表明膿毒癥誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥通過(guò)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致MVZ神經(jīng)元損傷與凋亡；同時(shí)，神經(jīng)炎癥可能上調(diào)了GFAP，使膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加并處于活化狀態(tài)。

進(jìn)一步的TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膿毒癥誘導(dǎo)MVZ神經(jīng)元凋亡及膽堿能抗炎通路中樞干預(yù)具有明確的效果，GTS-21能明顯減少膿毒癥MVZ細(xì)胞凋亡，而MLA則可使凋亡進(jìn)一步加重的趨勢(shì)，驗(yàn)證了中樞CAP 激活能發(fā)揮抗凋亡作用。研究證實(shí)[29-31]：CAP終端分泌的乙酰膽堿能激活小膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7nAChR，α7nACHR被激活后通過(guò)Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducersand activator of transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路，NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、高遷移率族蛋白1、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的產(chǎn)生，并提高白細(xì)胞介素-10等抗炎因子水平，減少小膠質(zhì)細(xì)胞激活，使小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制，從而快捷有效地抑制神經(jīng)炎癥，減少凋亡。

MVZ區(qū)域包含多種類(lèi)型的神經(jīng)元，膽堿能神經(jīng)元直接參與系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控[32]；兒茶酚胺能神經(jīng)元投射到迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核和延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也參與了MVZ 對(duì)炎癥與免疫及應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控[33]。為進(jìn)一步驗(yàn)證2種神經(jīng)元的活性及凋亡情況，本課題組進(jìn)行了CHAT/Caspase 3 and TH/Caspase 3免疫熒光雙標(biāo)記測(cè)定，結(jié)果表明：膿毒癥導(dǎo)致2種神經(jīng)元明顯凋亡，伴隨凋亡，TH表達(dá)明顯下降，GTS-21明顯減少了兒茶酚胺能神經(jīng)元的凋亡并增加TH 表達(dá)，MLA明顯增加了兒茶酚胺能神經(jīng)元的凋亡并進(jìn)一步降低了TH 的表達(dá)；GTS-21 能升高膿毒癥CHAT 表達(dá)的趨勢(shì)，MLA 則明顯降低膿毒癥CHAT表達(dá)。提示激活中樞CAP能降低神經(jīng)炎癥水平，在抗凋亡同時(shí)，改善腦組織損傷，并提高了功能神經(jīng)元的活性[34-35]。在此，本課題組發(fā)現(xiàn)膿毒癥對(duì)膽堿能神經(jīng)元和兒茶酚胺能神經(jīng)元影響并不同步，伴隨著MVZ 神經(jīng)元凋亡的加重，TH 表達(dá)同步降低，而CHAT表達(dá)并無(wú)明顯影響，可能與膿毒癥促使MVZ膽堿能系統(tǒng)功能活化，以增加迷走輸出，從而發(fā)揮系統(tǒng)性抗炎的重要機(jī)制[36-37]，也間接表明MVZ中對(duì)炎癥起調(diào)節(jié)作用的主要為膽堿能神經(jīng)元。

病理學(xué)研究提示，膿毒癥導(dǎo)致MVZ神經(jīng)凋亡及組織重構(gòu)，即膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)元減少。為進(jìn)一步明確MVZ神經(jīng)組織重構(gòu)的傾向及調(diào)控機(jī)制，本課題組依次檢測(cè)了各組GAP-43 mRNA，Olig-2 mRNA，VEGF mRNA，GFAP mRNA，MMP-9 mRNA 表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，GAP-43 mRNA，VEGF mRNA，GFAP mRNA，MMP-9 mRNA 在膿毒癥模型組中表達(dá)明顯上調(diào)，Olig-2 mRNA表達(dá)則明顯下調(diào)；GTS-21可明顯降低GAP-43 mRNA，VEGF mRNA，GFAPmRNA，MMP-9 mRNA 的表達(dá)，提升Olig-2 mRNA表達(dá)；MLA則相反。

GAP-43涉及到神經(jīng)元的再生，軸突的延伸，突觸發(fā)育與重建調(diào)控，從而恢復(fù)受損的神經(jīng)功能[38-39]，根據(jù)神經(jīng)受損的情況而動(dòng)態(tài)改變其表達(dá)水平[40]，與神經(jīng)炎癥，神經(jīng)損傷和修復(fù)相關(guān)。MMP是一類(lèi)具有重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)功能的蛋白酶[41-42]，在神經(jīng)組織受到各種生理刺激和病理?yè)p傷后，神經(jīng)炎癥水平升高，從而促使其含量，活性和基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，通過(guò)控制樹(shù)突棘的形狀和興奮性突觸的功能參與突觸可塑性的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[43-44]，其表達(dá)可反應(yīng)神經(jīng)炎癥的水平。GFAP是神經(jīng)炎癥的生物標(biāo)記物[45-46]，其表達(dá)增高表明膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)組織的膠質(zhì)化。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增殖和生成成來(lái)促進(jìn)血管新生，也與神經(jīng)損傷，神經(jīng)炎癥，神經(jīng)恢復(fù)等相關(guān)[47-48]。本研究可以看出，膿毒癥導(dǎo)致其MVZ神經(jīng)炎癥，神經(jīng)損傷與修復(fù)。GTS-21能抑制神經(jīng)炎癥，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)；MLA則惡化神經(jīng)炎癥。因此，膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥風(fēng)暴與MVZ 的損傷，CAP調(diào)控紊亂相關(guān)，干預(yù)中樞CAP對(duì)系統(tǒng)性炎癥有重要影響。Olig-2是少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，其表達(dá)的下降提示髓鞘化降低[49]，Olig-2水平升高與髓鞘破壞后代償性再生有關(guān)[50]?？梢?jiàn)前期研究所示膿毒癥導(dǎo)致心率變異性下降與膿毒癥誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥進(jìn)一步導(dǎo)致髓鞘化異常，從而導(dǎo)致CAP指令傳出障礙相關(guān)。GTS-21 通過(guò)抗炎而促進(jìn)髓鞘化，MLA則惡化神經(jīng)炎癥，加劇髓鞘破壞而進(jìn)一步損傷CAP對(duì)外周炎癥風(fēng)暴的調(diào)控。

本研究揭示了MVZ的神經(jīng)炎癥可能是膿毒癥系統(tǒng)性炎癥調(diào)控紊亂的重要機(jī)制，中樞CAP的激活可能成為遏制膿毒癥早期炎癥風(fēng)暴的有效干預(yù)措施。但本研究亦有以下不足：首先，本研究沒(méi)有直接探索MVZ的神經(jīng)炎癥及干預(yù)CAP對(duì)外周CAP調(diào)控的影響，比如對(duì)迷走神經(jīng)電活動(dòng)及脾組織釋放乙酰膽堿的影響，因此尚不能完全說(shuō)明中樞MVZ的病理?yè)p害及干預(yù)是否為系統(tǒng)性炎癥失控及干預(yù)的根本原因。此外，本研究采用腹腔給予α7nAChR的激動(dòng)劑與拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，因其對(duì)中樞及外周都有作用，究竟是對(duì)系統(tǒng)性炎癥的直接干預(yù)導(dǎo)致MVZ的病理變化，還是因?yàn)橹苯痈深A(yù)MVZ的炎癥導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥水平的變化為主，尚不能完全明確。最后，Olig-2 mRNA表下調(diào)是否意味著MVZ脫髓鞘，從而導(dǎo)致CAP的傳出障礙與系統(tǒng)性炎癥的失控，需要進(jìn)一步證實(shí)。下一步，本研究將聚焦以上幾個(gè)問(wèn)題進(jìn)一步探索，為中樞抗炎，促髓鞘化等手段治療膿毒癥提供理論基礎(chǔ)。

本研究初步證實(shí)了膿毒癥誘導(dǎo)MVZ神經(jīng)炎癥、功能神經(jīng)元凋亡及活性的改變、髓鞘化異常等，從而導(dǎo)致CAP 對(duì)系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控障礙，可能是膿毒癥誘導(dǎo)炎癥風(fēng)暴的重要機(jī)制；膽堿能抗炎通路的干預(yù)能明顯影響上述過(guò)程。激活α7nAChR可改善MVZ 中樞病理結(jié)構(gòu)，使其向“正?；狈较虬l(fā)展，可能是其遏制外周炎癥風(fēng)暴的重要機(jī)制之一；而α7nAChR的拮抗劑則相反，因此，抑制MVZ神經(jīng)炎癥可能成為膿毒癥炎癥失控的重要干預(yù)靶點(diǎn)。