摘要［目的］探究凍融循環(huán)對土壤細(xì)菌群落多樣性、組成以及潛在代謝功能的影響。［方法］將采集的土壤進(jìn)行不同凍融循環(huán)處理，通過高通量測序技術(shù)和Tax4Fun功能預(yù)測分析細(xì)菌群落多樣性和潛在代謝功能的變化。［結(jié)果］凍融處理后，土壤理化性質(zhì)與對照組差異明顯，土壤細(xì)菌群落多樣性隨著凍融次數(shù)的增加逐漸降低；所有處理組中放線菌門（Actinobacteria）占主導(dǎo)地位，其次是變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）；試驗(yàn)土壤中總共發(fā)現(xiàn)了277種功能途徑，關(guān)于新陳代謝的功能途徑占所有功能的64.60%～65.20%，占主要地位。凍融循環(huán)次數(shù)增加不僅會改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，還會影響其代謝過程。［結(jié)論］該研究為探究北方季節(jié)性凍融極端環(huán)境下土壤微生物群落代謝能力提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞凍融循環(huán)；高通量測序；微生物；群落結(jié)構(gòu)；代謝功能

中圖分類號Q89"文獻(xiàn)標(biāo)識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0062-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

EffectsofFreeze-thawCyclesonSoilBacterialCommunityStructureandMetabolicFunction

YANGTong，DUANYao-ting，LIUYong-qietal

（SchoolofEnergyandEnvironment，InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology，Baotou，InnerMongolia014010）

Abstract［Objective］Toexploretheeffectsoffreeze-thawcyclesonthediversity，compositionandpotentialmetabolicfunctionofsoilbacterialcommunity.［Method］Thecollectedsoilwastreatedwithdifferentfreeze-thawcycles，weusedhigh-throughputsequencingtechniquesandTax4Funfunctionalpredictiontoanalyzechangesinbacterialcommunitydiversityandpotentialmetabolicfunction.［Result］Afterfreeze-thawtreatment，soilphysicalandchemicalpropertiesweresignificantlydifferentfromcontrolgroup（Plt;0.05），thesoilbacterialcommunitydiversitydecreasedgraduallywiththeincreaseoffreeze-thawtimes，andthefreeze-thaw8cycles（C3）treatmentdecreasedby2.54%;Actinobacteriadominated（30.91%，32.75%and33.89%），followedbyProteobacteriaandAcidobacteria.Atotalof277functionalpathwayswerefoundintheexperimentalsoil，andthefunctionalpathwaysrelatedtometabolismaccountedfor64.60%-65.20%ofallfunctions，accountingforthemainposition.Theincreaseoffreeze-thawcyclesnotonlychangedthebacterialcommunitystructure，butalsoaffecteditsmetabolicprocess.［Conclusion］ItprovidedatheoreticalbasisforstudyingthemetaboliccapacityofsoilmicrobialcommunitiesinextremeseasonalfreezingandthawingenvironmentsinnorthernChina.

KeywordsFreeze-thawcycle;High-throughputsequencing;Microorganisms;Communitystructure;Metabolicfunctions

土壤環(huán)境中的微生物群落是多樣化的，它們不斷地推動著土壤生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程^［1］，在土壤物質(zhì)循環(huán)過程中起著不可代替的作用^［2］。凍融作用是一種由季節(jié)或晝夜溫度變化所造成的土壤凍結(jié)和解凍的反復(fù)過程，是高緯度地區(qū)的一種常見現(xiàn)象^［3-4］。凍融作用可以使土壤結(jié)構(gòu)和物質(zhì)發(fā)生明顯的變化^［5］，例如，凍融作用可以降低土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性^［6］，土壤孔隙度也會增大^［7-8］，同時也會促使重金屬形態(tài)變化^［9］。21世紀(jì)初，美國五大湖地區(qū)根據(jù)全球194個國家氣象站的數(shù)據(jù)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，1951—2000年，由于全球變暖導(dǎo)致冬季積雪減少，平均氣溫升高了1.5 ℃^［10］，土壤溫度也降低。積雪減少導(dǎo)致的積雪隔熱性的降低，會降低土壤溫度改變凍融循環(huán)的頻率和強(qiáng)度^［11-12］，并改變土壤每年被凍結(jié)的天數(shù)^［13-15］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活動均受生物和非生物因素所控制^［16］，全球凍融格局的變化勢必會使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化^［17］。然而目前關(guān)于凍融循環(huán)作用對土壤細(xì)菌群落代謝功能影響的研究比較匱乏。

目前常見的高通量測序技術(shù)是探究微生物群落系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)組成的有力工具，但無法對微生物群落代謝潛力進(jìn)行分析。Langille等^［18］使用PICRUSt預(yù)測16S rRNA基因序列的微生物群落KEGG Ortholog功能譜，這種算法通過16S rRNA基因序列將操作分類單元（OTU）與基因含量聯(lián)系起來，在腸道菌群功能預(yù)測方面有一定優(yōu)勢；但是當(dāng)微生物群落中含有未充分表征的分類時，這種分析方法可能會出現(xiàn)問題。Tax4Fun是一種基于16S的細(xì)菌群落功能預(yù)測分析工具。與PICRUSt相比，Tax4Fun的功能預(yù)測與宏基因組圖譜具有更高的相關(guān)性^［19］。因此，該研究將微生物群落測序技術(shù)和Tax4Fun功能預(yù)測方法結(jié)合，分析了凍融循環(huán)次數(shù)對土壤細(xì)菌群落多樣性和潛在代謝功能的影響，為研究北方季節(jié)性凍融極端條件下土壤細(xì)菌群落的變化提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集與凍融試驗(yàn)

試驗(yàn)土壤是校園內(nèi)（36°37′16″N、109°49′17″E）采集的土壤，土層深度為0～20cm。使用2mm篩去除樣本中的植物和大石塊，然后進(jìn)行室內(nèi)凍融試驗(yàn)。將土壤樣品置于-25°C冷凍24h，隨后在5°C解凍24h，此為一個凍融周期。對試驗(yàn)土壤進(jìn)行不同凍融處理：對照組（CK），5°C保存；處理1（C1），2個凍融周期；處理2（C2），6個凍融周期；處理3（C3），8個凍融周期。各凍融周期結(jié)束后取出部分試驗(yàn)土壤保存于-80°C冰箱中用于后續(xù)微生物試驗(yàn)測試。另一部分試驗(yàn)土壤待完全風(fēng)干后過200目篩，用于后續(xù)的土壤理化分析。

1.2土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH采用電位法（HJ962—2018）測定，烘干法測定土壤含水率，通過灼燒減量法測定土壤有機(jī)質(zhì)（OM）含量。

1.3IlluminaMiseq測序

在該研究中，根據(jù)E.Z.N.A.soilDNAkit（OmegaBio-tek，Norcross，GA，U.S.）指導(dǎo)書從0.5g土壤中提取DNA。隨后，采用引物338F/806R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。該試驗(yàn)在Illumina公司的MiseqPE300平臺上完成了所有的測序過程。

1.4數(shù)據(jù)處理

將16SrRNA基因序列通過R語言的Tax4Fun程序包，計算KEGG中的代謝循環(huán)和途徑。試驗(yàn)中所有樣品均平行重復(fù)測試3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖使用Orgin2021。采用SPSS16進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）來確定不同處理組之間的顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1土壤理化性質(zhì)

經(jīng)過不同處理的土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。各處理組的含水率均顯著高于CK組，C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了9.41%、17.43%和20.88%，C3組含水率最高。CK樣本的pH最大，經(jīng)過凍融循環(huán)后土壤的pH有所降低，C1、C2、C3處理組分別降低了0.06、0.07和015。凍融循環(huán)對土壤有機(jī)質(zhì)含量的影響最大，土壤有機(jī)質(zhì)含量明顯提高，C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了8277%、23.84%和13.93%，C1組有機(jī)質(zhì)含量最高。

2.2土壤細(xì)菌群落多樣性

維恩圖可以清晰地看出不同凍融循環(huán)次數(shù)下土壤細(xì)菌群落組成的相似性及重疊情況（圖1）。從圖1可以看出，所有處理中共有的OTU種類為1385種，占總OTU數(shù)的87.40%。對照組CK中有2種獨(dú)特的OTU，而C1、C2、C3中分別有2、1、3種特有的OTU種類。此外，4個處理中，C2含有最多的OTU種類（1513個），C3中最少（1511個）。

同時該研究進(jìn)行了不同凍融循環(huán)次數(shù)下土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），所有處理組別土壤細(xì)菌的覆蓋度均在99%以上。CK中Shannon-Wiener指數(shù)最高，經(jīng)過8次凍融循環(huán)（C3）后Shannon-Wiener指數(shù)最低，Simpson指數(shù)隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而增加，這表明隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加土壤細(xì)菌群落多樣性逐漸降低。

2.3土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

不同凍融循環(huán)次數(shù)下門水平的土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)如圖2所示。4個組別中物種豐富度最高的菌門是放線菌門（Actinobacteria），它在CK、C1、C2、C3處理中占比分別為30.71%、30.91%、32.75%和33.89%，隨著凍融次數(shù)增加在土壤中的占比增大。第二大優(yōu)勢門類是變形菌門（Proteobacteria），經(jīng)過2次凍融循環(huán)（C1）相對豐度達(dá)到最低，隨后逐漸增加，經(jīng)過8次凍融循環(huán)（C3）土壤中變形菌的占比達(dá)到最高，較C1組占比增加了11.13%。酸桿菌門（Acidobacteria）是第三大優(yōu)勢菌門，經(jīng)過2次凍融循環(huán)（C1）相對豐度達(dá)到最高，隨后逐漸降低。其他優(yōu)勢細(xì)菌門包括綠彎菌門（Chloroflexi，8.87%～11.06%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，4.45%～5.33%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，190%～2.40%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，1.66%～200%）、浮霉菌門（Planctomycetes，0.95%～1.31%）和厚壁菌門（Firmicutes，0.81%～1.08%）。其中擬桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門的相對豐度在凍融循環(huán)過程中呈先減后增的趨勢。此外，浮霉菌門相對豐度的變化趨勢則隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加呈下降趨勢，在C3中相對豐度最低。

基于Bray-Curtis相似性指數(shù)的層次聚類熱圖顯示了4個不同處理樣品的前10個細(xì)菌屬之間的層次關(guān)系（圖3）。結(jié)果表明，CK與C1相關(guān)，C2與C3相關(guān)。這說明多次凍融循環(huán)使得土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。4個處理（CK、C1、C2、C3）中最具代表性的菌屬是Subgroup_6，相對豐度

分別為7.31%、9.46%、7.99%和6.03%；其次是假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter），相對豐度分別為5.56%、5.81%、6.35%和6.88%。其他優(yōu)勢菌屬分別是芽球菌屬（Blastococcus）、斯科曼氏球菌屬（Skermanella）、KD4-96、冢村氏菌屬（Nakamurella）、小月菌屬（Microlunatus）、硝化螺菌屬（Nitrospira）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）。

2.4土壤菌群功能的預(yù)測

通過對不同處理土壤樣品中的細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），試驗(yàn)土壤中總共發(fā)現(xiàn)了277種功能途徑，關(guān)于新陳代謝（Metabolism）的功能途徑占所有功能的64.60%～65.20%，關(guān)于細(xì)胞進(jìn)程（Cellularprocesses）、人類疾病（Humandiseases）和環(huán)境信息處理（Environmentalinformationprocessing）方面的基因豐度隨著凍融次數(shù)的增多而降低；能量代謝（Energymetabolism）基因豐度先降低后增加；新陳代謝功能中最豐富的類別是碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）。經(jīng)過8次凍融循環(huán)后，土壤細(xì)菌群落的能量代謝功能（Energymetabolism）、糖合成和代謝功能（Glycanbiosynthesisandmetabolism）明顯降低，其中細(xì)菌群落能量代謝功能變化更為顯著，凍融后的3個處理組分別較CK組降低了0.67%、0.40%和0.27%。有關(guān)于次生代謝物的生物合成功能（Biosyntheticfunctionofothersecondarymetabolites）變化不明顯，而其余代謝功能相對豐度均有所提高，包括氨基酸代謝（Aminoacidmetabolism）和脂類代謝（Lipidmetabolism）等，其中，異源物質(zhì)生物降解和代謝功能（Xenobioticsbiodegradationandmetabolism）C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了2.43%、2.03%和1.01%。

2.5土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子冗余分析

土壤理化性質(zhì)與土壤菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的冗余分析（圖5）顯示，pH對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。第一優(yōu)勢菌門放線菌門（Actinobacteria）與土壤的pH和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，但與含水率呈負(fù)相關(guān)。然而，變形菌門（Proteobacteria）與pH和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，與含水率呈正相關(guān)。此外，酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）與土壤的pH和含水率呈正相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。

3討論

3.1凍融循環(huán)次數(shù)對土壤理化性質(zhì)的影響

在經(jīng)過不同凍融循環(huán)處理后，樣品的pH、含水率和有機(jī)質(zhì)含量均發(fā)生了不同程度的變化。凍融循環(huán)的一個關(guān)鍵特征是溫度的變化而導(dǎo)致土壤水分的相位變化。各試驗(yàn)組樣品的含水率均顯著高于對照組，并隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而上升，這是因?yàn)閮鋈谘h(huán)會促進(jìn)土壤水分向上遷移而使表層土壤水分增加^［20］。導(dǎo)致pH降低的主要原因是土壤水分的增加，這會導(dǎo)致土壤透氣性下降形成一個缺氧的環(huán)境，從而增強(qiáng)土壤硝化作用^［21］；另一個原因是凍融循環(huán)會促進(jìn)溶解性有機(jī)酸的釋放^［22］。凍融循環(huán)2個周期（C1）中有機(jī)質(zhì)含量顯著高于對照組，這可能是溶解性有機(jī)質(zhì)含量增加的緣故^［23］。在凍融作用下土壤團(tuán)聚體遭受擠壓而破裂，從而釋放出易于微生物接觸和利用的有機(jī)物質(zhì)包括碳水化合物、脂肪酸和固醇類等物質(zhì)，在微生物的作用下這類有機(jī)質(zhì)被降解成溶解性有機(jī)質(zhì)。此外凍融作用還會導(dǎo)致耐寒性差的微生物死亡，然后釋放大量的活性有機(jī)質(zhì)（包括多糖和氨基酸）^［24-25］。然而土壤有機(jī)質(zhì)含量隨凍融次數(shù)的增加出現(xiàn)降低的趨勢，這可能是因?yàn)榇婊畹奈⑸飳Νh(huán)境適應(yīng)性和代謝活動增強(qiáng)，從而降低了凍融作用導(dǎo)致的微生物死亡量，微生物裂解產(chǎn)生的溶解性有機(jī)質(zhì)含量降低，同時土壤中溶解性有機(jī)碳被存活微生物持續(xù)分解以供給自身需求，因此隨凍融次數(shù)的增加土壤有機(jī)質(zhì)含量開始持續(xù)降低。通過冗余分析發(fā)現(xiàn)，對于凍融條件下的土壤細(xì)菌群落，pH是最關(guān)鍵的影響因素，而土壤水分和有機(jī)質(zhì)作為微生物發(fā)育繁殖所必需的物質(zhì)，對細(xì)菌群落組成也有很大的影響。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，土壤的物理、化學(xué)性質(zhì)相繼發(fā)生改變，進(jìn)而對土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著性影響。

3.2凍融循環(huán)次數(shù)對土壤細(xì)菌群落的多樣性及組成的影響

結(jié)合Alpha多樣性指數(shù)可以看出，凍融循環(huán)8個周期（C3）樣品中OTU種類和Shannon-Wiener指數(shù)最低，這說明凍融循環(huán)次數(shù)越多，細(xì)菌群落多樣性越低，這與Lim等^［26］的研究結(jié)果一致。熱圖顯示CK群落結(jié)構(gòu)與C1相似，而與凍融循環(huán)6個周期（C2）和C3樣本有一定差異。這表明在經(jīng)過了多次凍融循環(huán)后，土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的改變。放線菌門（Actinobacteria）在細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位。已有研究表明，放線菌門在低溫條件下有很強(qiáng)的代謝能力并能降解復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)^［27］，所以隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，放線菌門相對豐度呈上升趨勢。變形菌門（Proteobacteria）種類繁多，有著很強(qiáng)的代謝活性^［28］和耐低溫能力，在永久凍土層的細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位^［29］。而酸桿菌門（Acidobacteria）可以在低溫條件下降解纖維素，具有降解復(fù)雜化合物的能力^［30］。綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在世界上大多數(shù)土壤環(huán)境中都能生存^［31］。假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）屬于放線菌門，降解能力很強(qiáng)，其在修復(fù)復(fù)合重金屬污染領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注^［32］。Subgroup_6菌屬與假節(jié)桿菌屬功能相似，所以這2種細(xì)菌相對豐度很高。以上說明能降解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)功能且具有較高代謝活性的細(xì)菌可以適應(yīng)極端的凍融環(huán)境。細(xì)菌群落優(yōu)勢物種的相對豐度經(jīng)過數(shù)次凍融后發(fā)生變化，但是種類沒有改變。這說明這些優(yōu)勢物種是大自然篩選出來的已經(jīng)適應(yīng)北方季節(jié)性凍融氣候的物種，凍融循環(huán)次數(shù)增加不會影響細(xì)菌群落的種類，而對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響主要體現(xiàn)在優(yōu)勢物種的豐度變化。

3.3凍融循環(huán)次數(shù)對細(xì)菌群落代謝功能的影響

Tax4Fun分析作為高通量測序分析的一種補(bǔ)充，對試驗(yàn)樣本進(jìn)行了潛在代謝功能的預(yù)測。該試驗(yàn)所取樣本中共發(fā)現(xiàn)了277種功能途徑，其中處于主導(dǎo)地位的是新陳代謝功能途徑。有關(guān)于細(xì)胞進(jìn)程、人類疾病和環(huán)境信息處理方面的基因豐度隨著凍融次數(shù)的增多而降低，說明凍融環(huán)境對細(xì)菌細(xì)胞活動有抑制作用。能量代謝基因豐度先降低后增加的趨勢解釋了變形菌門（Proteobacteria）豐度的變化規(guī)律。據(jù)報道，變形菌是能量代謝中最主要的細(xì)菌^［33］。該研究觀察到，在生理代謝功能方面，比如碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂類代謝等方面表現(xiàn)出了明顯提高，這是因?yàn)椴糠治⑸锛?xì)胞為了克服凍融作用所帶來的抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成表達(dá)的危害，啟動了其他的基因表達(dá)方式來增強(qiáng)極端環(huán)境的適應(yīng)能力^［34］。生物降解和代謝功能的提高使得這些經(jīng)過數(shù)次凍融循環(huán)存活下來的細(xì)菌能夠通過降解死亡細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)來增強(qiáng)自己的活性。

4結(jié)論

pH是影響凍融條件下土壤細(xì)菌群落最關(guān)鍵的因素，凍融循環(huán)次數(shù)的增加促使土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，細(xì)菌群落多樣性逐漸降低。細(xì)菌群落的優(yōu)勢物種的相對豐度隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加會發(fā)生變化，但優(yōu)勢物種類別不發(fā)生變化。除此之外，凍融環(huán)境對細(xì)菌細(xì)胞活動有遏制作用，凍融循環(huán)次數(shù)增加不僅會改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，還會影響其代謝過程，其中凍融后的3個處理組（C1、C2、C3）細(xì)菌群落能量代謝功能分別降低了0.67%、0.40%和0.27%，異源物質(zhì)生物降解和代謝功能分別提高了2.43%、2.03%和1.01%。該研究為探究北方季節(jié)性凍融極端環(huán)境下土壤微生物群落代謝能力提供理論基礎(chǔ)。

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