摘要以田間發(fā)現的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，對其進行組織培養(yǎng)，通過對不同激素配比的研究，建立韭菜珠芽的再生體系。結果表明，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，無菌率可達82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D為最佳不定芽誘導培養(yǎng)基，其不定芽誘導率為78.52%，MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA為最佳不定芽伸長培養(yǎng)基，不定芽伸長率可達86.63%，1/2MS+0.5mg/LIBA為最佳生根培養(yǎng)基，生根頻率為88.20%，其移栽成活率可達95%以上。

關鍵詞韭菜；特異性芽體；珠芽；組織培養(yǎng)

中圖分類號S633.3"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0042-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.010

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

EstablishmentofanEfficientinvitroRegenerationSystemofBulbelofChinesechive

ZHANGZi-juan，WANGChang-hao，ZHANGGui-hai"etal

（LangfangAcademyofAgriculturalandForestrySciences，Langfang，Hebei065000）

AbstractInthisstudy，thespecificbudontheupperpartofthereceptacleofChinesechiveplant（calledbulbil）foundinthefieldwasusedastheexplantfortissueculture.Throughthestudyofdifferenthormoneratio，theregenerationsystemofChinesechivebulbilwasestablished.Theresultsshowedthatusing10%sodiumhypochloritesolutionfor7minhadthebestdisinfectioneffectandthesterilityratewas82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-Dwasthebestmediumforadventitiousbudinduction，andtheadventitiousbudinductionratewas78.52%.MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAAwasthebestmediumforadventitiousbudelongation，andtheelongationofadventitiousbudreached86.63%，and1/2MS+0.5mg/LIBAwasthebestrootingmedium，therootingfrequencywas88.20%，thesurvivalrateoftransplantingwasmorethan95%.

KeywordsChinesechive;Specificbud;Bulbil;Tissueculture

韭菜，又名草鐘乳、起陽草，為百合科蔥屬多年生宿根草本植物，原產于中國，在我國已有3 000多年的栽培歷史^［1］。韭菜的葉片、花葶、假莖、花均可食用，其以獨特的辛辣味、豐富的營養(yǎng)物質、較多的粗纖維而深受消費者喜愛^［2-3］。我國是韭菜種植生產大國，目前韭菜育種方式多為常規(guī)育種，如雜交育種、優(yōu)勢育種等，育種周期較長，所需人力物力相對較多^［4］。相對于傳統(tǒng)的育種方式，將組織培養(yǎng)技術與育種技術相結合，利用韭菜器官組織培養(yǎng)獲得再生植株，對于種質材料的保存、拯救瀕危資源、縮短育種年限、提高育種效率都有積極意義^［5-6］。在韭菜組織培養(yǎng)研究中，有以韭菜根尖^［7］、葉片^［8］、花托^［9-10］等器官為外植體的相關研究，而筆者以田間偶然發(fā)現的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，其外觀為紫紅色、形態(tài)飽滿，以這種田間發(fā)現的材料為外植體，旨在探究出一套適合其組織培養(yǎng)的快速繁殖體系，為以后田間發(fā)現的變異株、特異株進行留種、保種、育種提供一種可行的方法。

1材料與方法

1.1基本培養(yǎng)基

選用MS（全配）培養(yǎng)基，pH調至5.8；所有培養(yǎng)基經120℃滅菌20min，植物激素經過濾滅菌后添加到受試培養(yǎng)基。接種后均放到培養(yǎng)間中進行組織培養(yǎng)。

1.2試驗材料

供試材料來源于河北省廊坊市農林科學院蔬菜研究所，韭菜品種為蔬菜研究所培育的PX系列。試驗材料為試驗基地田間偶然發(fā)現的、花盤上長出的特異性芽體。于晴天上午對長勢健壯、無病害的韭菜植株進行取材。

1.3試驗方法

1.3.1無菌外植體的獲得。

將花托基部順著珠芽長勢將其逐一分開，用手術刀片將其表面刮干凈。先于自來水下沖洗1～2h，再在超凈工作臺上，用75%乙醇消毒4～5min，然后采用以下不同消毒處理：10%次氯酸鈉溶液消毒3min（A）；10%次氯酸鈉溶液消毒5min（B）；10%次氯酸鈉溶液消毒7min（C）；10%次氯酸鈉溶液消毒9min（D）。10%次氯酸鈉溶液消毒后均用無菌水沖洗4～6次，再用無菌濾紙吸干珠芽表面水分，將消毒后萎蔫的苞片剝去，切去基部變腐部位，將剩余材料進行接種。7～14d后，統(tǒng)計外植體的無菌率。

1.3.2不定芽誘導。

將確認無菌的珠芽，接種至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和2，4-D（0.2、0.4、0.6mg/L）的MS培養(yǎng)基中進行不定芽誘導。21～28d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

1.3.3

不定芽伸長。將經不定芽誘導后的材料接種至不定芽伸長培養(yǎng)基中，使其伸長到一定高度，便于后期生根與移栽。以不同濃度的6-BA和NAA進行不定芽伸長研究，以確定不定芽有效伸長的最佳配方。

將誘導出的不定芽轉接至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5mg/L）組合的MS培養(yǎng)基上。10～15d后統(tǒng)計不定芽伸長率。

1.3.4不定根誘導。

選取長勢健壯的試管苗（3.0～4.0cm），通過MS（A）、1/2MS（B）、1/2MS+0.5mg/LIBA（C）進行不定根誘導，15d后開始統(tǒng)計每種方法的生根情況，25d后統(tǒng)計生根率，探索出生根頻率較高的方法。

1.3.5煉苗與移栽。

當試管苗的根長至4.0～5.0cm時，去掉組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，煉苗3～4d后將試管苗移栽到棚室中進行栽培，觀察生長情況。

1.4數據統(tǒng)計

無菌率=無菌外植體數/接種數×100%

不定芽誘導率=誘導出不定芽的外植體數/接種數×100%

不定芽伸長率=伸長的不定芽數/接種數×100%

生根率=生出根系的幼苗數/接種數×100%

2結果與分析

2.1無菌外植體的獲得

設置4種不同消毒方式進行消毒，以探究珠芽最佳消毒方式。由圖1可知，使用10%次氯酸鈉溶液消毒3min的方法A珠芽無菌率較低，為16.98%，珠芽表面狀態(tài)較好。此方法中，雖然次氯酸鈉溶液對芽體傷害較小，但無法獲得有效的無菌外植體。使用10%次氯酸鈉溶液消毒5min的方法B，其消毒效果相對于方法A，無菌率有所提升，珠芽表面苞皮軟化。使用10%次氯酸鈉溶液消毒

7min的方法C消毒效果最佳，無菌率達82.32%，芽體變軟，將表面苞皮去除后，里面部分仍保留完好（圖2C）。使用10%次氯酸鈉溶液消毒9min的方法D消毒效果最差，芽體腐爛程度較嚴重，即使去除苞皮后，可用材料較少。因此，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，為珠芽的最佳消毒方式。

2.2不定芽誘導

將獲得的無菌外植體，進一步轉接至不定芽誘導培養(yǎng)基中，以提高誘導率。將植物激素6-BA與2，4-D結合，可使外植體在誘導不定芽的同時，芽體基部與培養(yǎng)基接觸部位也伴隨著愈傷的形成，在愈傷組織上會長出較多的不定芽，可提高誘導效率（圖2D、E）。由表1可知，當6-BA濃度為1.0mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高而升高，整體不定芽誘導效果欠佳，基部愈傷組織較少；當6-BA濃度為1.5mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高先升高后降低，不定芽誘導率在2，4-D濃度為0.4mg/L時達到最大，為78.52%，高于2，4-D0.6mg/L時的不定芽誘導率（74.24%），誘導出的不定芽翠綠，基部愈傷組織致密，芽點較多；當6-BA濃度為2.0mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高而呈降低趨勢，不定芽較少，基部愈傷組織較疏松，有些呈水漬狀，芽點較少。因此，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導不定芽效果最好，其不定芽誘導率為78.52%。

2.3不定芽伸長

將上述誘導出的長至1～2cm的不定芽轉入不定芽伸長培養(yǎng)基中，進行伸長培養(yǎng)。結果發(fā)現，若將長出的不定芽切下，直接插入不定芽伸長培養(yǎng)基中，不定芽會變軟、變黃，直至枯萎；若將誘導出的不定芽連同基部愈傷組織一同轉入伸長培養(yǎng)基中，葉片伸長效果較好，顏色翠綠，生長旺盛（圖2F）。

將6-BA與NAA結合，可有效促進韭菜不定芽的伸長。由表2可知，當6-BA濃度為1.0與1.5mg/L時，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長率呈升高趨勢；當6-BA濃度為2.0mg/L時，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長率呈下降趨勢，但整體伸長率仍較高，伸長的葉片長勢也較好，在6-BA濃度為2.0mg/L、NAA濃度為0.5mg/L時，不定芽伸長率最高，可達86.63%，不定芽長勢較健壯，伸長的葉片形態(tài)寬，顏色深綠，長勢良好。在6-BA濃度為2.0mg/L和NAA濃度為1.5mg/L時，2種激素濃度均較高的情況下，雖然不定芽伸長率仍較高，但部分組培苗葉片會發(fā)生矮化現象，在基部

呈螺旋狀生長，與市場對韭菜直立性的要求不符。因此，不定芽伸長的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

2.4不定根誘導

為了探究韭菜組培苗的最佳生根方法，設計了3種不同的生根方式。將長至3.0～4.0cm的組培苗轉接至不定根誘導培養(yǎng)基中，13d后，基部有乳白色點狀凸起，30d時可見大部分組培苗均生根（圖3A、B）。由表3可知，采用不加任何植物激素的MS（全配）培養(yǎng)基的方法A，生根頻率最低，生根啟動最慢，長出的根較細、白。采用不加任何植物激素的1/2MS（全配）培養(yǎng)基的方法B，生根頻率大幅提高，為84.77%。采用1/2MS（全配）培養(yǎng)基，并添加0.5mg/LIBA的方法C，生根頻率有所提高，為88.20%，雖然方法C與方法B中的生根頻率相差較小，但生根啟動時間明顯縮短，且根長勢健壯，有利于提高后期的移栽存活率。因此，不定根誘導的最佳方法為C，即1/2MS+0.5mg/LIBA。在生產中采用方法B或者方法C2種生根方式均可，方法C雖然啟動天數較短，但方法B操作簡單，免去了添加植物激素的步驟，可根據實際所需進行選擇。

2.5煉苗與移栽

煉苗是組培苗對脫離組培環(huán)境進入到大田環(huán)境的一個過渡適應期，尤其是對環(huán)境中有菌的一種適應。當組培苗的根生長到一定長度時（4～6cm），打開組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，進行3～4d煉苗。煉苗后將組培苗從瓶中取出，洗凈培養(yǎng)基，在自來水中浸泡2～4h，再將其移栽到大田中，澆透水，在其生長過程中注意對水分的控制。經此過程，韭菜組培苗移栽成活率可達95%以上，需注意的是在移栽過程中，要盡量減少對根系的損傷（圖3C、D）。

3結論與討論

該試驗以田間發(fā)現的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，研究不同植物激素對其不定芽誘導的影響。結果發(fā)現，可采用10%次氯酸鈉溶液消毒7min的消毒方法，此方法無菌率最高，可以獲得有效的無菌外植體以滿足試驗需求。此芽體在MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導不定芽效果最好，不定芽誘導率可達78.52%，在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA條件下誘導不定芽伸長效果最佳，組培苗長勢也較好，該研究3種生根方法均可，可根據生產需要選擇適合的生根方式，經煉苗后，韭菜組培苗移栽成活率可達95%以上，可滿足生產需求。

研究發(fā)現，以田間發(fā)現的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，對其進行組織培養(yǎng)，進而獲得了再生植株，為今后韭菜相似特殊材料的保種、留種提供了可行方法。該研究中，對于外植體的消毒，沒有使用組培研究中常用的氯化汞消毒的方式^{［7-8，11］}，而是采用對人體、環(huán)境無害的次氯酸鈉溶液進行消毒，在獲得無菌外植體的同時達到了更安全、更環(huán)保的目的。研究發(fā)現，韭菜組培苗在培養(yǎng)過程中若采用單株且不帶基部愈傷部分進行培養(yǎng)時，在后期培養(yǎng)過程中大多數材料會出現變黃、枯萎的現象，為了避免此現象的發(fā)生，可以適當調節(jié)激素配比，在誘導不定芽的同時促進愈傷的發(fā)生，提高誘導效率。

參考文獻

［1］張明，呂愛琴，陳中府，等.我國韭菜資源研究現狀和種質創(chuàng)新研究建議［J］.植物遺傳資源學報，2016，17（3）：503-506，516.

［2］張寶海，韓向陽，何偉明，等.日光溫室韭菜輕簡化高效栽培技術［J］.中國蔬菜，2019（11）：101-103.

［3］周福君，翟瑩，魏源，等.不同光質對韭菜各茬生長及營養(yǎng)品質的影響［J］.東北農業(yè)大學學報，2017，48（11）：52-62.

［4］王貞，喬保建，王利亞，等.韭菜育種的研究進展［J］.江蘇農業(yè)科學，2014，42（3）：116-117.

［5］王利亞，王貞，馬培芳，等.韭菜大孢子誘導培養(yǎng)再生植株及移栽技術研究［J］.農業(yè)科技通訊，2017（10）：157-158.

［6］李冰冰.韭菜單倍體培養(yǎng)技術研究［J］.現代農業(yè)科技，2016（9）：67，69.

［7］葉青雷，馬云橋，劉海軍，等.野韭菜組織培養(yǎng)及快速繁殖研究［J］.安徽農學通報，2021，27（11）：36-37.

［8］胡永軍，林桂玉，田素波，等.壽光馬藺韭組織培養(yǎng)快繁體系的研究［J］.蔬菜，2013（9）：5-8.

［9］李勇，楊樺，龍蔚，等.韭菜組織培養(yǎng)及快速繁殖技術研究［J］.江西農業(yè)學報，2006，18（4）：106-107.

［10］王茜，龍驪豐，韋鵬霄，等.野韭菜花器官脫分化影響因子研究［J］.安徽農業(yè)科學，2014，42（31）：10861-10863.

［11］劉宏敏，馬培芳，張明.韭菜組織培養(yǎng)研究進展［J］.陜西農業(yè)科學，2011，57（5）：175-177.