【摘 要】目的：檢測不同物種肋骨骨質參數(shù)與微觀力學參數(shù)并分析其差異，探索利用肋骨上述參數(shù)鑒別不同物種的可行性。方法：提取人、豬、牛、羊、猴的左側第四肋骨起始于肋軟骨外約1 cm、長1 cm肋骨，利用Micro-CT檢測上述物種肋骨的皮質骨厚度、骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、組織體積（tissue volume，TV）、組織表面積（tissue surface，TS）、骨體積（bone volume，BV）、骨表面積（bone surface，BS）、BV/TV、BS/BV、BS/TV、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.SP）等骨質參數(shù)，利用納米壓痕技術檢測經(jīng)煮沸后的肋骨與新鮮肋骨骨皮質的壓痕硬度（indentation hardness，HIT）、壓縮模量（elastic modulus，EIT）并分析上述參數(shù)在不同物種間的差異。結果：骨質參數(shù)檢測中，TV、TS、BS/TV、BS/BV、Tb.SP、Tb.N 6個參數(shù)能將人肋骨樣本與豬、牛、羊、猴完全區(qū)分開來，而BV參數(shù)人肋骨樣本只有與牛（P=0.001）、羊（P=0.001）差異有統(tǒng)計學意義；BS參數(shù)人類樣本只與牛肋骨樣本差異無統(tǒng)計學意義（P=0.304）；BV/TV參數(shù)人肋骨樣本只與牛（P=0.025）、猴樣本（P=0.002）差異有統(tǒng)計學意義；Tb.Th參數(shù)人只與牛（P=0.001）、猴樣本（P=0.003）差異有統(tǒng)計學意義；BMD參數(shù)只有人肋骨樣本與豬有統(tǒng)計學意義（P=0.006）；肋骨骨皮質厚度除人與牛肋骨骨皮質差異無統(tǒng)計學意義外（P=0.579），與其余物種差異均有統(tǒng)計學意義。力學性能檢測方面，煮沸組人肋骨HIT和EIT與猴肋骨（P=0.001）、與牛肋骨HIT差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）外，與其余物種差異不具有統(tǒng)計學意義；新鮮組人肋骨除HIT、EIT與牛肋骨樣本（P=0.999、P=0.997）以及與猴肋骨本的HIT（P=0.092）差異無統(tǒng)計學意義以外，與其余樣本差異均有統(tǒng)計學意義樣。結論：利用Micro-CT骨質參數(shù)檢測及納米壓痕力學性能檢測均可鑒別人、豬、猴、牛、羊不同物種新鮮肋骨，對煮沸肋骨納米壓痕力學性能檢測僅可區(qū)分人與其他動物肋骨。人與牛肋骨骨皮質厚度差異不明顯，與豬、猴、羊的肋骨骨皮質厚度差異明顯。

【關鍵詞】法醫(yī)人類學；生物力學；種屬鑒定；納米壓痕；Micro-CT

【中圖分類號】R89 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-06-24

骨骼的堅固性使得其即使在惡劣的環(huán)境中也能夠長時間保存[1]，因此法醫(yī)工作者在鑒定實踐中常用骨骼來進行人類殘骸個體識別。通過肉眼觀察骨骼的形態(tài)學差異以及顯微鏡下觀察骨骼的微觀結構形態(tài)學差異來鑒別骨骼種屬的技術已經(jīng)較為成熟，但是骨骼如果被破壞（如腐敗、高溫、破碎、腐蝕等），其識別特征常不明顯[2-3]。此外，由于野外骨骼降解等因素導致骨骼殘缺不全、不同物種之間骨骼的局部相似性以及同一物種骨骼的多樣性，為骨骼的物種識別帶來了較大的挑戰(zhàn)[4]。

幾十年來，研究者們已經(jīng)開發(fā)了許多方法用于骨骼的種屬鑒定，如組織化學法、X射線衍射分析法、DNA 分析法、傅里葉變換紅外光譜法（fouriertransform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）及拉曼光譜法等[2，5-11]。其中，DNA分析法是區(qū)別樣本種屬來源較為準確及常用的方法[2]。由于骨骼中骨礦物質過度礦化和相對于軟組織而言細胞數(shù)量較少，有時候提取骨骼DNA仍然具有較大挑戰(zhàn)性，檢材的局限性可影響后續(xù)的遺傳分析。尤其在實際檢案中，在只有已被嚴重破壞的骨骼碎片作為檢材時，這些片段可能已經(jīng)只剩下很少或完全降解的DNA。若得到錯誤的DNA分型，會將人類骨骼遺骸誤認為是非人類或將非人類骨骼誤認為是人類，給案件定性及偵破帶來干擾[12]?；谝陨蠙z測方法的困難及局限性，亟須一些新的手段和方法進行骨骼種屬鑒定。

顯微CT（Micro-CT）與臨床CT一樣，都是通過X 射線顯示骨骼的成像方法。區(qū)別在于Micro-CT以更小的視野結合高分辨率探測器，能夠獲得骨骼微納觀級別成像，可以更加高效、準確地分析骨皮質及骨松質的結構，比如BMD、Tb.N、Tb.SP、Tb.Th等[13-14]。Micro-CT 基于其快速且無損檢測骨質參數(shù)的優(yōu)點，在骨骼研究方面是一種重要的檢測手段[15-16]。

納米壓痕技術作為一種測試材料微觀力學性能的技術，可用于檢測生物材料的塑性和彈性性能，如壓痕彈性模量（EIT，GPa）、壓痕硬度（HIT，MPa）等。納米壓痕法可以精確地測量與壓痕深度相關的多個材料特征參數(shù)，如壓痕硬度及彈性模量。當壓頭按預定的加載曲線壓入被測物，達到設定的最大力值時停止壓入，然后以可控的方式進行卸載。在加載和卸載過程中記錄壓入深度，通過施加的載荷、壓頭的形狀和壓痕深度就可以計算出各種性能參數(shù)[17-18]。

因此基于Micro-CT和納米壓痕技術在骨骼檢測上的優(yōu)勢，本研究擬檢測人、豬、牛、羊、猴5種物種肋骨的骨質參數(shù)及生物力學參數(shù)，探討利用以上2種檢測法進行骨骼種屬鑒定的可行性，為法醫(yī)實踐中遇到的復雜來源骨骼鑒定提供新方法和新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

人肋骨樣本來源于貴州醫(yī)科大學解剖實驗室所接收的捐贈樣本。獼猴肋骨標本由合作單位中國科學院昆明動物研究所提供（倫理審查編號IACUC-PE-2023-07-002），其余動物肋骨由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。物種樣本納入標準：人類樣本：死因與骨骼不相關；非人類樣本：物種來源一致；避免因年齡帶來的骨骼發(fā)育誤差，所有物種年齡均限定于：人類樣本成年階段：18～60周歲，男性；豬、牛、羊、猴骨樣本：均為性成熟期，性別為雄性（倫理審查編號2100880）。物種樣本排除標準：人類樣本：CT掃描排除肋骨損傷、肋骨疾病、高腐尸體、骨質疏松等；非人類樣本：肋骨損傷、肋骨疾病、物種來源不一致。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準（倫理審查編號2021倫審第66號）。

人、豬、牛、羊、猴肋骨組織用蘸有生理鹽水的濕紗布包裹，放置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，標本制備時常溫解凍。

1.2 Micro-CT檢測

取人、豬、牛、羊、獼猴第四肋骨，于近肋軟骨約1 cm處用手工鋸橫向截取長1 cm的肋骨組織樣本，仔細剔除肋骨周圍附著軟組織。Micro-CT檢測總樣本量25個，每組納入統(tǒng)計量5個。利用Micro-CT對上述人與動物肋骨進行掃描。掃描參數(shù)設置為射線管電流159 μA，掃描分辨率54.6 μm，曝光時間600 ms，掃描角度180°。掃描前利用標準體進行標定以獲得骨密度校準值。取骨骼內掃描區(qū)域大小100層為感興趣體積區(qū)域（volume of interesting，VOI），再次選取骨骼的感興趣區(qū)域（region of interesting，ROI）設定灰度閾值后，手動描繪骨小梁和骨皮質區(qū)域，測量并計算骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨體積分數(shù)等參數(shù)[19]。每組單個物種的Micro-CT掃描為無損檢測，肋骨掃描完成后繼續(xù)于-20 ℃下保持冷凍以備后續(xù)進行力學實驗。

1.3 肋骨骨皮質厚度檢測

為了比較人肋骨骨皮質厚度與其余物種是否存在差異，利用智能化圖像計算法檢測不同物種的肋骨平均骨皮質厚度。將Micro-CT 輸出的二維圖像利用Image-Pro Plus6.0（IPP）軟件手動描繪不同物種肋骨骨皮質外緣T1、內緣T2，測量并計算T1-T2的平均厚度CT1，測量平均厚度選取方法按照時鐘的12 個方向測量，總樣本量60 個，每組納入統(tǒng)計量12 個，軟件描邊盡可能細致不留空白以猴肋骨為例（圖1）。

1.4 納米壓痕檢測

分組：每個物種共收集9根肋骨（左側第四肋），將各物種肋骨隨機分為煮沸組與新鮮組，煮沸組與新鮮組各截取1 cm長肋骨，各9個樣本用于納米壓痕檢測。樣本總統(tǒng)計量90 個，每組納入統(tǒng)計量45 個，每個物種樣本納入統(tǒng)計量9個。①煮沸組：模擬實際案例中將骨骼煮沸以破壞遺骸的處理方法，將Micro-CT掃描后的各肋骨樣本用高壓鍋分別煮沸2 h，相對壓力達到80 kPa，每組設置的壓力值一致。冷卻后-20 ℃保存?zhèn)溆?。②新鮮組：將各物種新鮮的第四肋骨仔細剔除肋骨周圍附著軟組織，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣本制備：將環(huán)氧樹脂與增韌固化劑按100∶40的質量比均勻混合，倒入內徑為30 mm的圓柱形軟硅膠模具中。將上述2種處理方法得到的樣本置于制備好的凝膠中，樣本檢測面朝下，在室溫條件下降溫直至樣本完全被固化。依次使用低目到高目金相砂紙（目數(shù)分別為800、1 200、1 500、2 000、4 000）在金相樣品拋光機（MPD-1）上以500 r/min的轉速進行研磨拋光，直至樣品表面無明顯劃痕。將所制備樣本置于NHT3納米壓痕測試儀上，按所設定實驗壓入位置使用三棱錐壓頭進行物力學檢測（圖2A）。

參數(shù)設置：最大力N=20 mN，加載速度V=40 mN/min，保載時間T=10 s，卸載速度V=40 mN/min，每個樣打9個納米壓痕點，點間距離為40 μm（圖2B）。試驗過程中，計算機檢測軟件自動輸出載荷和接觸面積，計算壓縮壓痕硬度和彈性模量。本研究采用Oliver WC和Pharr GM[20]提出的方法獲取彈性模量（假設v=0.3泊松比）。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計計算均采用IBM SPSS statistics 26統(tǒng)計軟件進行。使用Shapiro-Wilk檢驗評估數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性，對服從正態(tài)分布者，以均數(shù)±標準差（x±s）描述，采用單因素分析檢驗比較組間差異，利用最小顯著差異法（Least Significant‐Difference，LSD）進行兩兩比較；若不服從正態(tài)分布，以中位數(shù)（上下四分位數(shù)）即[Md（P25，P75）]表示，采用非參數(shù)秩和檢驗（Wilcoxon檢驗）比較組內和組間差異。檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 Micro-CT檢測

利用Micro-CT掃描了人、豬、牛、羊、獼猴肋骨，檢測分析了BMD、Tb.N、Tb.Th等骨質參數(shù)，結果顯示人樣本與其余不同物種肋骨形態(tài)及骨質參數(shù)差異明顯（圖3、4）。各物種肋骨矢狀面Micro-CT掃描如圖3所示，牛肋骨樣本因過寬不符合Micro-CT掃描條件，利用手工鋸將其一分為二進行掃描。根據(jù)矢狀面掃描及三維重建結構來看，豬與羊肋骨樣本骨皮質較人與牛肋骨樣本薄但骨小梁數(shù)量更密集，骨小梁分離度以及厚度更小；猴肋骨樣本骨皮質最厚。

BMD表示骨組織礦物質含量的密度，其數(shù)值越大，代表骨骼壓痕硬度越高[21]；TV、TS、BV、BS表示ROI中骨量的多少；BS/BV指單位骨體積的骨面積大小，與BS/TV及BV/TV均可以反映骨組織骨量的多少；骨皮質相較于骨小梁承受更多的力，其內在性質及孔隙度的變化影響骨骼強度；骨小梁是骨皮質在骨骼內部的延續(xù)，作為皮質骨和髓腔的連接，骨小梁在骨髓腔內呈現(xiàn)出疏松多孔的結構，類似于海綿狀，其內填充骨髓，有研究表明，骨小梁的排列與應力相關，其連接而成的多孔網(wǎng)架結構，按應力曲線規(guī)律性排列，具有非均勻的各向異性，這種排列能增加骨強度[22-23]。Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th均為評價骨小梁空間形態(tài)結構的重要指標，當發(fā)生骨組織合成小于骨組織吸收時，Tb.N、Tb.Th數(shù)值減小、Tb.Sp數(shù)值增加，提示可能存在骨質疏松，反之亦然[24]。本研究中Micro-CT 骨質參數(shù)人類樣本與豬樣本無法用BV、BV/TV、Tb.Th 3 個參數(shù)進行區(qū)分（Pgt;0.05）；人類樣本與牛樣本無法用BS、BMD 2 個參數(shù)進行鑒別（Pgt;0.05）；人類樣本與羊樣本無法用BV/TV、BMD、Tb.Th 2 個參數(shù)進行區(qū)分（Pgt;0.05）；人類樣本與猴樣本無法用BV、BMD 2 個參數(shù)進行區(qū)分（Pgt;0.05）。剩余TV、TS、BS/TV、BS/BV、Tb.Sp、Tb.N 6個參數(shù)均可將人類樣本與豬、牛、羊、猴樣本區(qū)分（Plt;0.05）（圖4）。

研究中測量了不同物種肋骨骨皮質平均厚度CT1，人肋骨骨皮質除了與牛肋骨骨皮質沒有統(tǒng)計學差異外（Pgt;0.05），與其余物種差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）（圖5）。

2.2 納米壓痕測試

煮沸組與新鮮組中人肋骨樣本與豬、牛、羊、猴肋骨的HIT、EIT 差異如圖6所示。非人類物種肋骨間數(shù)據(jù)HIT和EIT兩兩差異如表1、2所示。圖6中煮沸組與新鮮組各物種HIT與EIT差異明顯：煮沸組中平均HIT最高的樣本是人，最低的是牛；平均EIT最高的是猴，最低的是人肋骨；新鮮組中HIT最高的樣本是豬，最低的是羊；平均EIT最高的是猴，最低的是羊。

煮沸組：人類樣本與其余物種間HIT和EIT統(tǒng)計分析如圖6A及B所示，HIT參數(shù)人類肋骨樣本與牛、獼猴肋骨樣本差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），與豬、羊肋骨樣本差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；EIT參數(shù)人肋骨樣本只與猴肋骨樣本差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），與其余物種肋骨樣本差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。

新鮮組：在新鮮組樣本中，各物種間HIT和EIT統(tǒng)計分析見圖6C及D所示，在HIT與EIT參數(shù)中人肋骨樣本除與牛肋骨樣本差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）以及HIT人肋骨樣本與猴肋骨樣本差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）外，與其余樣本差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。

如表1、2所示，煮沸組和新鮮組2組間HIT與EIT參數(shù)的非人類物種之間的多重比較，煮沸組中豬肋骨樣本HIT與牛肋骨樣本差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005）；與猴肋骨樣本EIT差異有統(tǒng)計學意義（P=0.010）。牛肋骨樣本除與豬樣本EIT差異無統(tǒng)計學差異外（P=0.842），與羊肋骨樣本EIT差異無統(tǒng)計學意義（P=0.106）。羊肋骨樣本只與牛肋骨樣本的HIT（P=0.029）和猴肋骨樣本的EIT 差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）。而在新鮮組中，只有猴肋骨樣本和豬肋骨樣本2個指標差異無統(tǒng)計學意義（HIT P=0.100；EIT P=0.983）以及與牛肋骨樣本HIT（P=0.219）外，其余非人類物種間差異均有統(tǒng)計學意義。

3 討論

骨骼主要由有機物、無機礦物質和水組成，有機物主要由構成基質結構的I型膠原蛋白組成，無機礦物質主要由鈣、磷離子為主，其存在形式主要為羥基磷灰石結晶，呈細針狀，與膠原纖維長軸緊密結合[11]。這3 種成分結合在一起，形成了骨骼獨特的化學、材料和機械特性。隨著肋骨作為胸廓的組成成分之一，既有保護心臟、肺臟、肝臟等器官的功能，也對呼吸起著支持的作用。且單一個體肋骨數(shù)量較多、不同物種間肋骨的形態(tài)相似度較高，肉眼區(qū)分有時難度較大，因此本研究選用肋骨作為研究對象。研究中所選擇的豬、牛、羊3 個物種是在生活中最常見的牲畜，作為重要的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值來源，全世界飼養(yǎng)超過數(shù)十億頭，這也導致其骨骼處理時會造成混亂；獼猴作為靈長目動物，因其與人類極為相像的生理特性，在骨骼種屬鑒定時也會帶來困難。本研究所選擇的物種經(jīng)常在法醫(yī)人類學鑒定中遇到并進行過專業(yè)分析[25-26]。家牛動物的祖先早在大約8 000年前被馴化后就作為農業(yè)生產(chǎn)、交通運輸?shù)戎匾獊碓?，因其強壯高大的體型可使其體重達幾百公斤。山羊種在肉用價值、奶制品以及紡織業(yè)中也占有重要角色。豬科動物由野豬馴化培育而來，中國作為飼養(yǎng)家豬最多的國家，其肉用價值超過其他牲畜，因此疾病防控成為重中之重。在優(yōu)勝劣汰的自然法則和人類對其品種的選育下，牛、羊、豬逐漸成為日常生活常見的品種。目前人們關于牛、羊、豬的研究多著重于經(jīng)濟價值、品種培育、疾病防控等方面，研究骨骼進行種屬鑒定的少見報道，尤其是骨骼微觀骨質參數(shù)和力學性能方面的差異研究。各物種的遺傳表征、形態(tài)特征、生活習性、棲息環(huán)境、分布范圍等各不相同，這也可能是導致了物種間骨骼微觀骨質參數(shù)和力學性能差異的原因。

利用肉眼觀察、組織學檢查、DNA檢測、免疫學檢測及蛋白質組學等方法進行骨骼種屬鑒定均存在一定的局限性，當骨組織發(fā)生腐敗、降解、高溫或是腐蝕后，會對骨骼的形態(tài)結構、理化性質等造成明顯損害，導致檢測結果存在誤差，影響鑒定結論[27]。隨著科技的進步，醫(yī)學影像學及生物力學技術方法發(fā)展迅速。醫(yī)學影像學中Micro-CT已得到了廣泛使用，生物力學研究已深入到納米級水平。上述方法能否應用于骨骼種屬鑒定，目前少見相關文獻報道。本研究檢測不同物種肋骨的骨質參數(shù)、骨骼壓痕硬度和壓縮模量，探索利用上述2種方法進行骨骼種屬鑒定的可行性，為骨骼種屬鑒定提供新思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，人、豬、猴、牛、羊不同物種的TV、TS、BV、BS、BS/TV、BS/BV、BV/TV、BMD、Tb.N、Tb.SP等骨質參數(shù)存在明顯差異，人、豬、猴、牛、羊新鮮肋骨樣本的HIT和EIT差異多具有統(tǒng)計學意義，上述發(fā)現(xiàn)為利用影像學及生物力學方法進行骨骼種屬鑒定提供了實驗參考依據(jù)。本研究同時發(fā)現(xiàn)，不同物種的煮沸組肋骨HIT及EIT差異多不明顯，可能與高溫對肋骨的力學結構或其組成成分造成影響，使不同物種肋骨的力學性能差異趨于一致有關。肋骨骨皮質厚度方面，除人與牛肋骨骨皮質厚度差異不明顯外，與豬、羊、猴差異均具有統(tǒng)計學意義，提示肋骨骨皮質厚度也是較好的骨骼種屬鑒定指標。

骨組織的組織礦物質含量與礦化程度與物種、生活習性、解剖部位、年齡、生長狀態(tài)等息息相關，利用Micro-CT可以快速無損地檢測骨質含量，測量時可通過篩選骨質參數(shù)達到較明顯區(qū)分人類樣本與其余物種的目的。納米壓痕在納觀級別檢測骨質的壓痕硬度及彈性模量，分析煮沸組中各樣本之間數(shù)據(jù)較多無統(tǒng)計學意義，其原因可能與高溫加熱導致骨骼的物理性質發(fā)生不可逆性的改變有關[28]，有研究表明，隨著溫度的不斷增高，當溫度到達50 ℃時，骨細胞發(fā)生壞死，到達70 ℃時，骨組織內的蛋白質和酶發(fā)生降解，若在相同溫度持續(xù)1 min時會對骨細胞結構及物理性質產(chǎn)生損傷[29-30]。而在新鮮組中，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義，因此納米壓痕可以較快檢測出未經(jīng)處理的新鮮骨骼是否來源于同一物種，比如實際案件中在特殊案發(fā)現(xiàn)場（屠宰場、肉販攤、冷運車）內發(fā)現(xiàn)大量骨骼時，可以利用納米力學的方法。但是針對發(fā)現(xiàn)的骨骼具體屬于哪個物種，不得而知，這也是本實驗的不足之處，后續(xù)可加大樣本量進行大量計算，運用統(tǒng)計學的方法建立力學判別模型以供物種來源鑒定[4]。

然而，實際案例中的情況往往錯綜復雜，任何形式的外界因素都可能致骨骼的物理性質發(fā)生改變，針對各種方式處理后的骨骼樣本進行種屬鑒定難度較大。本研究結果有望為復雜條件下的骨骼種屬鑒定提供新的思路。

4 結語

利用Micro-CT骨質參數(shù)檢測及納米壓痕力學性能參數(shù)檢測均可鑒別人、豬、猴、牛、羊不同物種新鮮肋骨；對煮沸肋骨納米壓痕力學性能參數(shù)檢測僅可區(qū)分人與其他動物肋骨。人肋骨雖與牛肋骨骨皮質厚度差異不明顯，但與豬、猴、羊的肋骨骨皮質厚度差異明顯。總之，本研究比較了人與4種非人類物種的肋骨微觀骨質參數(shù)和納米級力學性能參數(shù)的差異，探討了利用以上2種檢測方法進行物種種屬鑒定的可行性及局限性，增加了微觀水平不同物種骨骼鑒定的新方法及新思路。

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（責任編輯：周一青）

基金項目：貴州省科技支撐資助項目（編號：黔科合[2022]一般280）。