【摘 要】目的：鑒別不同個體的腦血管周圍色素（cerebral vascular pigment，CVP）的性質，并探索其與年齡、性別、腦區(qū)的相關性。方法：選取146例法醫(yī)尸檢案例的腦組織，采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin stain，HE）、普魯士藍染色法、改良Fouchet膽色素染色法、苯酚酒精（alkylphenol ethoxylate，APE）去除福爾馬林顆粒染色法、高錳酸鉀/草酸（potassium permanganate/oxalic acid，PPO）去除黑色素染色法、硫酸亞鐵染色法、Schmorl染色法以及酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase related protein1，TRP-1）免疫組化染色法對CVP進行性質分析。采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用卡方檢驗分析不同性別、年齡和腦區(qū)之間的CVP檢出情況。結果：CVP在HE染色法、普魯士藍染色法、改良Fouchet膽色素染色法、APE去除福爾馬林顆粒染色法中均呈棕黃色，在PPO去除黑色素染色法中成功被去除，在硫酸亞鐵染色法和Schmorl染色法中呈墨綠色、黑色改變，在TRP-1免疫組化染色法中呈紅色陽性結果。不同年齡組之間，CVP檢出率差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），呈增齡性加重改變；在不同部位腦組織之間，CVP檢出率差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），頂葉的檢出率遠高于額葉、顳葉、枕葉；而不同性別之間的CVP檢出率差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.050）。結論：CVP為黑色素，我們希望通過探討它潛在的來源和功能，為神經(jīng)系統(tǒng)的相關科學研究提供參考依據(jù)，促進神經(jīng)科學尤其是神經(jīng)病理學的發(fā)展。

【關鍵詞】特殊染色；組織學染色；腦血管；色素沉著；黑色素；神經(jīng)病理學；病理學

【中圖分類號】R361+.2；R89 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-02-28

在常規(guī)的組織病理學檢查中，確定人體組織沉著的色素性質很重要，因為不同的色素有不同的意義。例如，含鐵血黃素可為損傷時間和死亡時間提供參考[1]，膽色素可為膽管腎病或膽道膽管炎等疾病診斷提供依據(jù)[2-4]，黑色素可幫助診斷黑色素瘤[5]。

鑒定人體組織中的沉積色素通常需要根據(jù)其化學結構特征使用特殊的染色方法。例如，為了識別黑色素，可以利用高錳酸鉀溶液的強氧化性，破壞黑色素結構中的酸性環(huán)并達到去除目的[6-7]；也可以利用黑色素吸收亞鐵離子形成黑色素-亞鐵絡合物，與鐵氰化鉀結合生成亞鐵氰化物，呈現(xiàn)深藍綠色[8]；還可以利用黑色素將鐵離子還原為亞鐵離子去與鐵氰化鉀反應，生成亞鐵氰化物并著色[9]。當然，免疫組織化學染色也是一種鑒別手段，酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase related protein 1，TRP-1）是黑色素生成過程中的重要酶[10]，可作為黑色素特異性抗原進行物質的性質鑒定。

黑色素一般分為5種：真黑素、褐黑素、異黑素、神經(jīng)黑素和膿黑素[11]。這其中，人類的神經(jīng)系統(tǒng)就含有神經(jīng)黑色素。此外，黑色素是人體必需的色素，在光防護、視覺信號傳遞、溫度調節(jié)、免疫、抗氧化、機械加固、抗摩擦等方面發(fā)揮著重要作用[12-14]。

最近，本研究在腦血管周圍發(fā)現(xiàn)了一種圓形、棕黃色的色素，經(jīng)過一系列的實驗證實是黑色素。此前有報道稱，在烏干達人和鼠類動物的血管周圍間隙中存在黑色素[15-17]，但這些發(fā)現(xiàn)并未通過染色得到證實。另外，他們描述的黑色素形態(tài)是梭形或多極形的，更像跟隨血管進入大腦實質中的軟腦膜黑素細胞，而不是本研究描述的腦血管周圍色素（cerebral vascular pigment，CVP）。

據(jù)本研究所知，迄今還沒有關于腦血管周圍圓形黑色素的報道。本研究記錄并經(jīng)多種染色方法確認了腦血管色素的性質，同時討論了其特征和潛在功能。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2020年1月至2023年12月在廣東省汕頭大學司法鑒定中心進行的146例病理解剖案例死者的腦組織。納入標準：①已知死者具體性別和年齡的；②本中心獨立完成系統(tǒng)尸檢及其組織病理學檢驗的；③較新鮮尸體及其完整腦組織結構。將所取的腦組織按個體年齡分為4組：0至20歲為組Ⅰ，21至40歲為組Ⅱ，41至60歲為組Ⅲ，gt;61歲以上為組Ⅳ。

1.2 組織取材

對大腦進行外部檢查沒有異常后，在額葉、顳葉、枕葉、頂葉收集腦組織，每個案例總共收集4塊大腦組織樣本。同時，取生前確診肝硬化死者的肝組織作為普魯士藍染色的陽性對照，取普通死者的膽囊作為膽色素染色的陽性對照，取進行二次尸檢死者的腎組織作為苯酚酒精（alkylphenolethoxylate，APE）法去除福爾馬林顆粒染色的陽性對照，取普通死者的皮膚作為高錳酸鉀/草酸（potassium permanganate/oxalic acid，PPO）法去除黑色素染色、硫酸亞鐵染色、Schmorl染色的陽性對照，所有樣本經(jīng)福爾馬林固定、包埋后連續(xù)切成8片，分別用于8個不同的染色組。1組采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin stain，HE），其余5 組采用特殊染色方法（詳見1.3），另取1組進行免疫組織化學染色。在每組特殊染色和免疫組化染色中加入陽性對照切片，以消除假陰性結果的影響。

1.3 特殊染色

1.3.1 普魯士藍染色法[18]

配制2%亞鐵氰化鉀和2%鹽酸水溶液，等量混合后染色。切片脫蠟，用蒸餾水徹底清洗。在混合溶液中放置30 min，然后用蒸餾水清洗。1%伊紅水溶液反染15 s后，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.3.2 改良Fouchet法膽色素染色法[19]

制備10%氯化鐵和25%三氯乙酸的水溶液，并按1∶10混合。切片脫蠟，用蒸餾水徹底清洗，在新鮮混合溶液中浸泡10 min，然后在蒸餾水中洗滌2 min。用Van Gieson染色液反染，沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.3.3 APE法脫福爾馬林顆粒染色法[20]

將5 mL苯酚、5 mL鹽酸和90 mL無水乙醇混合成APE溶液，切片置于溶液中反應5 min，水洗，隨后進行HE染色，常規(guī)脫水、透明、封固。

1.3.4 PPO 法脫黑色素染色法[21]

切片用5% 高錳酸鉀處理2 min，水洗2 min，再使用5% 草酸脫色2 min，隨后進行HE染色，常規(guī)脫水、透明、封固。

1.3.5 硫酸亞鐵染色法

切片置于2.5%硫酸亞鐵溶液中反應1 h，用蒸餾水沖洗15 min，再置于1%鐵氰化鉀乙酸溶液中反應30 min，在1%乙酸溶液中分化數(shù)秒。1%伊紅水溶液反染15 s，常規(guī)脫水，透明、封固。

1.3.6 Schmorl染色法[8]

將配置好的1%三氯化鐵、1%鐵氰化鉀和蒸餾水按30∶4∶6的比例混合。切片放入混合物中反應15 min，沖洗后用1%伊紅水溶液反染15 s，常規(guī)脫水、透明、封固。

1.4 免疫組織化學染色

切片放在乙二胺四乙酸溶液中高壓3 min，然后用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌，在0.3%過氧化氫中孵育30 min。添加山羊血清封閉液，在30 ℃中保溫30 min，甩掉血清封閉液后滴加一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS 洗滌，滴加二抗在37 ℃保溫箱中孵育30 min。PBS沖洗，隨后使用3-氨基-9-乙基咔唑顯色液復染。光學顯微鏡下觀察染色，及時終止。切片用蘇木精反染，甘油密封。以上抗體均購自Abcam公司，全程按照說明書進行。

1.5 組織學觀察

由于CVP呈簇狀排列且相互重疊，定量分析可能不完全準確，因此目前暫時采用半定量方法。光鏡下觀察染色切片，在腦組織中任一視野中看到CVP，則記錄該樣本的CVP檢出率為（+），否則記錄為（-）。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用頻數(shù)（%）表示，利用卡方檢驗評估CVP檢出率與性別、年齡和大腦區(qū)域之間的關系。檢驗水準α=0.05，以Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基本信息

本研究共納入146 個案例，年齡0～94 歲，平均年齡43.26 歲，中位年齡46 歲。男性88 例（60.3%），女性58 例（39.7%）。男性組年齡0～94歲，平均年齡（46.9±2.7）歲；女性組年齡0～81歲，平均年齡（37.7±2.3）歲。根本死因以外傷（37.1%）較為多見，其次為呼吸系統(tǒng)疾病（21.9%）。相關基線資料見表1、圖1。

2.2 染色結果

HE染色中，CVP呈黃褐色類圓形，無明顯細胞結構（圖2）。在普魯士藍染色中，肝硬化死者的肝細胞內(nèi)見藍染的含鐵血黃素顆粒，呈陽性結果（圖3A），而同一反應中的CVP未染成藍色，呈陰性結果（圖3B）。在改良Fouchet法膽色素染色中，膽管壁灰綠色浸染，呈陽性結果（圖4A），而同一反應中的CVP未染成綠色，呈陰性結果（圖4B）。使用APE法去除福爾馬林顆粒染色前，在HE染色中見重復尸檢案例的腎小管上皮大量棕色顆粒沉著（圖5A），使用APE法后，同一位置未見色素沉著（圖5B），呈陽性結果；而相同處理后的CVP仍然存在，未被清除，呈陰性結果（圖5C）。

使用PPO法去除黑色素染色前，經(jīng)過HE染色顯示皮膚基底層黑色素為黑褐色（圖6A），經(jīng)過PPO法處理后，相同位置未見黑色素顆粒沉著（圖6B），呈陽性結果；相同處理后未檢見CVP，成功被去除（圖6C），也呈陽性結果。在硫酸亞鐵染色中，皮膚基底層黑色素呈深墨綠色改變（圖7A），同一染色反應中的CVP也被染成墨綠色（圖7B、C、D），兩者均呈陽性結果。同樣，在針對黑色素的Schmorl染色中，皮膚基底層黑色素（圖8A）和CVP（圖8B）都被染成黑色，均呈陽性結果。在TRP-1免疫組織化學染色中，皮膚基底層黑色素細胞（圖9A）和CVP（圖9B）都呈紅色陽性反應。

2.3 統(tǒng)計學結果

不同性別之間的CVP 檢出率差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.050）。不同年齡組之間的CVP檢出率差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），檢出率隨年齡段增高而增加。不同腦區(qū)之間的CVP檢出率差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），頂葉的檢出率遠高于額葉、顳葉、枕葉等部位。詳見表2和圖10。

3 討 論

本研究使用的染色方法是揭示人體內(nèi)源性色素性質的經(jīng)典方法。例如，用普魯士藍染色顯示含鐵血黃素[22- 23]，用改良Fouchet法膽色素染色顯示膽紅素[24]，用APE法去除福爾馬林顆粒[25]，用PPO法去除黑色素[26]，用硫酸亞鐵染色和Schmorl染色顯示黑色素[27，9]。

額葉、顳葉、枕葉和頂葉是共識最易發(fā)生腦外傷的部位[28]，特別是輕微腦傷的多發(fā)部位[29]。因此法醫(yī)在尸檢時常選擇這些區(qū)域進行大腦組織采樣。根據(jù)本研究的長期觀察，CVP經(jīng)常出現(xiàn)在不同年齡和性別的尸檢案例中，并且可以在不同的大腦區(qū)域看到。由于其圍繞血管的特性，它很可能與出血相關的陳舊病變有直接關系，但很少有研究證實它是否真的是一種血源性色素。本研究首先根據(jù)血紅蛋白的兩種主要代謝途徑進行驗證，但普魯士藍染色和改良Fouchet法膽色素染色表明CVP性質并非含鐵血黃素和膽色素。因此，CVP并不是源自血紅蛋白代謝。

由于案例均為尸體，不得不考慮CVP是否與尸體分解和組織固定有關。有報道稱，腐敗腎組織受到福爾馬林色素沉著的影響顯著 [30]，因此選擇作為消除福爾馬林顆粒染色陽性對照的是來自于一個在死后3個月進行第二次尸檢的個體的腎組織。本研究采用的APE法去除福爾馬林顆粒染色被認為是目前消除該色素顆粒最有效的方法[25]。在此方法中，腎組織的色素沉著被清除，但CVP不能被清除，因此否定了CVP是福爾馬林色素的假設。令人驚訝的是，CVP通過PPO法去除黑色素染色被成功清除，這表明CVP可能是黑色素。隨后，使用硫酸亞鐵染色、Schmorl染色以及對黑色素生物合成過程至關重要的TRP-1抗體免疫組織化學染色共同證實CVP為黑色素。

所納入的案例，盡管不同根本死因，但機體都伴發(fā)不同程度的其他傷病或醫(yī)療損害情況，難以完全拆分作統(tǒng)計分析，因此暫只考慮探究CVP 和性別、年齡、腦區(qū)位置之間的關系。統(tǒng)計學發(fā)現(xiàn)CVP的檢出率隨年齡增長而增加，頂葉檢出率高于大腦的額葉、顳葉、枕葉等部位。本研究推測這種年齡特征和位置差異可能與腦外傷或其病理過程有關：無論男女，頂葉都可能因內(nèi)板較薄而更容易在日常生活中受累積性輕微腦損傷的影響[31]，特別是血管和周圍腦組織等不同組織學結構之間容易發(fā)生不同步運動及其剪切力損傷[29]；而黑色素似乎就具有通過調節(jié)炎癥和增加血流量來加快代謝修復的能力[32-33]。

CVP在常規(guī)HE中不呈常見的深黑色，可能是腦血管特殊的微環(huán)境限制了黑色素發(fā)育到完全成熟階段。黑素體的發(fā)育分為4個階段[13]，在不同發(fā)育階段會受pH和銅、鋅等金屬離子濃度的影響而呈現(xiàn)不同的顏色[34-35]。

在其他腦外器官中未發(fā)現(xiàn)與CVP形態(tài)相同的色素，這可能歸因于黑色素的組織特異性。通過對脊椎動物化石的研究發(fā)現(xiàn)，不同組織中黑色素的幾何形狀和金屬離子組成是不同的[36-38]。人的神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等系統(tǒng)有著不同的內(nèi)環(huán)境。黑色素在這些不同的內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出不同的形態(tài)，發(fā)揮不同的功能，這是生物體進化過程中的一種選擇。

本研究存在一定的局限性：本實驗室近年來只飼養(yǎng)了SD大鼠，前期實驗在不同年齡SD大鼠的腦組織中均沒有發(fā)現(xiàn)類似的顆粒，因此缺乏通過動物實驗作進一步電鏡觀察以及其他的機制研究。然而，這并不影響目前已經(jīng)證明的CVP性質結果。本研究希望拋磚引玉，呼吁有能力的學者在現(xiàn)有研究成果的基礎上對CVP 進行更深入的探索。無論CVP是生理的還是病理的，進一步的研究將有助于本研究更好地了解神經(jīng)系統(tǒng)，從而為臨床實踐提供更好的基礎。

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（責任編輯：周一青）