【摘 要】損傷時間推斷是法醫(yī)實踐工作的重要任務(wù)之一，其在確定暴力實施時間、判斷損傷形成順序、劃分責(zé)任主體、分析案件性質(zhì)等方面具有重要作用，但傳統(tǒng)的方法受限于外界環(huán)境影響，難以精確推斷損傷時間，因此損傷時間推斷仍是法醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點。近年來，法醫(yī)科學(xué)研究者從組織形態(tài)學(xué)、非編碼RNA、蛋白質(zhì)、生物活性因子、代謝產(chǎn)物以及影像學(xué)和光譜學(xué)等方面對活體軟組織的損傷時間推斷進行了大量研究與探索。本文總結(jié)了這些方面的近期研究成果，對其在法醫(yī)實踐中的應(yīng)用前景進行探討，并從多組學(xué)聯(lián)合分析的角度，就如何實現(xiàn)損傷時間的精準(zhǔn)推斷進行了展望。

【關(guān)鍵詞】法醫(yī)學(xué)；損傷時間推斷；非編碼RNA；光譜學(xué)

【中圖分類號】DF795.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-08-31

損傷時間推斷（wound age estimation）一直是法醫(yī)學(xué)實踐中的重點和難點內(nèi)容，損傷時間的推斷在法醫(yī)學(xué)日常工作中應(yīng)用甚廣。準(zhǔn)確推斷損傷時間對劃定偵察范圍、確定犯罪嫌疑人有著非常重要的意義，因此損傷時間的準(zhǔn)確推斷是法醫(yī)命案現(xiàn)場中首要解決的任務(wù)之一。由于機體受外界環(huán)境影響因素較大，為準(zhǔn)確推斷損傷時間帶來一定的困難。因此尋找新的靈敏性高、特異性強、穩(wěn)定性好的檢測指標(biāo)是當(dāng)前損傷時間推斷急需解決的問題之一。本文就近年來關(guān)于法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷技術(shù)的研究成果總結(jié)如下。

1 基于組織形態(tài)學(xué)進行損傷時間推斷

組織形態(tài)學(xué)分析技術(shù)具有直觀性、客觀性以及良好的定位定性能力[1]，是目前應(yīng)用最廣泛的損傷時間推斷技術(shù)之一。機體損傷修復(fù)是一個持續(xù)的炎性組織愈合過程[2]，組織形態(tài)學(xué)分析技術(shù)通過觀察不同時間段中表現(xiàn)出的特征性細(xì)胞反應(yīng)，以此進行損傷時間的推斷。

組織形態(tài)學(xué)一般通過大體表征以及病理變化進行探索研究。上世紀(jì)末，Langlois NEI[3]對挫傷時間推斷的方法進行了回顧總結(jié)，包括視覺觀察法、比色法、分光光度法和組織病理學(xué)等，但視覺觀察法會受到人主觀性眼生理的限制，且結(jié)果不具備唯一性，實踐價值有限；比色法、分光光度法可以提供部分客觀的依據(jù)，但無法避免復(fù)雜變量因素對顏色變化的影響；相比之下，組織病理學(xué)能提供較多客觀且有效的信息，是近年來利用組織形態(tài)學(xué)進行損傷時間推斷的研究重點。

傳統(tǒng)組織學(xué)染色技術(shù)（蘇木精-伊紅和普魯士藍(lán)染色）主要通過觀察中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞所占總細(xì)胞的比率來顯示損傷6 h后的細(xì)胞反應(yīng)，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比率分別大于75%、50%時，分別提示損傷時間為12 h、1 d[4-5]。Liu QQ等[6]發(fā)現(xiàn)在2～6 h內(nèi)損傷骨骼肌創(chuàng)面中性粒細(xì)胞遷移距離呈逐漸增加的趨勢，這與炎癥反應(yīng)的進程一致。傳統(tǒng)染色技術(shù)可直接觀測炎癥細(xì)胞的浸潤情況，但大多情況下其僅能呈現(xiàn)6 h后的陽性表現(xiàn)且結(jié)果精確性較低，僅能起到輔助作用。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）和免疫熒光（immunofluorescence，IF）染色可觀察到早期細(xì)胞反應(yīng)并明確單個細(xì)胞的活化階段，其染色系統(tǒng)可研究多種類型細(xì)胞及多重標(biāo)記物的時程性變化。李炳譞等[7]應(yīng)用IF標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀測到星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）呈動態(tài)表達(dá)，樹突數(shù)目、長度、復(fù)雜程度等指標(biāo)呈時間相關(guān)性變化，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞是推斷腦挫傷時間的潛在指標(biāo)。Riezzo I等[8]聯(lián)合分析了80例鈍性外傷致脾破裂案例，應(yīng)用IHC標(biāo)記周圍組織纖維蛋白原、CD61及CD68，觀測其在損傷后的1個月內(nèi)的表達(dá)變化，基于此將損傷時間劃分為4個時間階段（1～3 d、4～10 d、11～16 d、17～30 d）進行判定。此外，杜秋香等[9]應(yīng)用HE和免疫熒光多重染色方法觀察了挫傷骨骼肌M1及M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量和比值的變化，發(fā)現(xiàn)其比值可作為損傷時段推測的依據(jù)。染色標(biāo)志物的不斷增加，豐富了病理推斷依據(jù)，對相應(yīng)損傷時間段的描述愈加精準(zhǔn)與全面，其推測結(jié)果亦更加可靠。

組織病理學(xué)染色技術(shù)還有針對特定組織的特殊染色，如外傷性脾破裂，應(yīng)用Mallory染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其染色較HE染色可更清晰地觀察到紫色條索狀纖維素樣物（新鮮出血區(qū)）與藍(lán)染膠原纖維（陳舊出血區(qū)）[10]。隨著科技的發(fā)展，全自動染色機以及病理組織切片識別量化技術(shù)也逐漸應(yīng)用于法醫(yī)實踐，這將大大提高染色和識別效率。雖然組織形態(tài)學(xué)的時間推斷指標(biāo)不斷被發(fā)現(xiàn)，但目前尚未形成準(zhǔn)確可靠的推斷方案，所以在該方面深入研究的同時，仍需開發(fā)其他損傷時間推斷技術(shù)。

2 基于蛋白質(zhì)及生物活性因子進行損傷時間推斷

蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾后的終產(chǎn)物，可直接調(diào)控?fù)p傷發(fā)生的生理病理進程，其結(jié)果可直觀的反應(yīng)生理生化階段，為損傷時間推斷提供分析靶點。Wang LL等[11]定量檢測了小鼠皮膚切創(chuàng)處的炎性細(xì)胞浸潤、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及系列細(xì)胞因子變化情況，中性粒細(xì)胞在12 h達(dá)到高峰后逐漸下降，巨噬細(xì)胞在3 d迅速上升并于5 d達(dá)到高峰，纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化在10 d時轉(zhuǎn)化率最高。單核細(xì)胞趨化蛋白-1 和巨噬細(xì)胞趨化因子-12 于12 h～5 d 逐漸增高，IL-1β，TNF-α 和pro-col Ⅲα1 增加到7 d，IL-6 和VEGF-A于12 h～1 d 迅速增加并于3 d～5 d 達(dá)到高峰，Pro-colIα2 從7 d增加到21 d。IL-1b、IL-6和TNF-α是促炎細(xì)胞因子，單核細(xì)胞趨化蛋白-1是巨噬細(xì)胞的強效趨化因子，巨噬細(xì)胞趨化因子-12是淋巴細(xì)胞和纖維細(xì)胞的強趨化因子等。由此可見在損傷與修復(fù)進程的發(fā)展過程中生物活性因子具有重要的調(diào)控作用。Tian Z等[12]通過建立大鼠骨骼肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)與肌衛(wèi)星細(xì)胞相關(guān)的多種生物標(biāo)志物呈現(xiàn)時間依賴性表達(dá)模式，Pax7、MyoD、肌生成素和IGF-1在愈合過程中表達(dá)上調(diào)，與組織形態(tài)學(xué)結(jié)果相對應(yīng)。此外，炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激會引起相關(guān)酶類活性改變。Li K等[13]研究表明乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）的表達(dá)量在骨骼肌損傷后12 h迅速增加到峰值，于5 d后逐漸恢復(fù)至正常水平。

蛋白組學(xué)通過高分辨質(zhì)譜以及生物信息的分析，對特定組織進行差異蛋白檢測，深化了蛋白質(zhì)研究策略。Zhang P等[14]使用iTRAQ耦合 LC-MS/MS進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析以篩選大鼠彌漫性軸突損傷生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)Rock-2隨著損傷時間表達(dá)量逐漸增加，而Snap-25 的表達(dá)量則逐漸降低。王皓晨[15]在利用蛋白組學(xué)篩選腦外傷過后潛在生物標(biāo)志物時，發(fā)現(xiàn)了PSMC4、Hexokinase-1、AP2M1、bcl-2、caspase-3、β-catenin呈現(xiàn)時序性變化。近年來，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS）的發(fā)展使得蛋白質(zhì)組樣品的分離、鑒定和定量效率得到極大提升[16]。利用高通量、大隊列蛋白質(zhì)組學(xué)分析[17]，篩選出損傷組織時序性表達(dá)蛋白質(zhì)，為損傷時間推斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了新的選擇。

Western blot和ELISA以及組學(xué)技術(shù)可用來檢測各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，包括細(xì)胞因子、修復(fù)蛋白以及酶類等。蛋白質(zhì)的表達(dá)變化要晚于RNA的表達(dá)變化，即在早期損傷時間推斷中優(yōu)勢較小，但蛋白組學(xué)的研究可以提供蛋白質(zhì)層面上的信息和功能，可使其與其他鑒定方法互為補充和相互驗證。

3 基于代謝產(chǎn)物進行損傷時間推斷

機體損傷之后，其微環(huán)境產(chǎn)生波動，轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平發(fā)生變化，擾動機體代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物變化。代謝組學(xué)可以對存在特定細(xì)胞、組織和生物體內(nèi)的所有代謝物進行全面的定量和定性分析[18]，其主要研究分子量小于1 000的內(nèi)源性小分子化合物。

田甜等[19]研究皮膚切創(chuàng)時間與血清標(biāo)志代謝物的關(guān)系時，采用正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial leastsquare-discriminantanalysis，OPLS-DA）模式得到21 種代謝標(biāo)志物的時間預(yù)測模型，具有較高的準(zhǔn)確率。曹潔[20]通過多元統(tǒng)計分析從損傷骨骼肌中篩選出43種與損傷時間高度相關(guān)的差異代謝物，應(yīng)用兩層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型將時間點細(xì)分為4 h、8 h、12 h、16～20 h、24～32 h、36～40 h和44～48 h，模型準(zhǔn)確率達(dá)到92.6%。Du T 等[21]進行了液相色譜-質(zhì)譜（LCMS）分析數(shù)據(jù)，確定了大鼠股骨肌肉在死亡后168 h內(nèi)10個時間段的代謝特征，揭示至少59種代謝物的代謝變化與死亡后的時間密切相關(guān)。安國帥[22]探索機器學(xué)習(xí)算法與代謝組學(xué)相結(jié)合來推斷損傷時間，以43和28種代謝物數(shù)據(jù)為特征，分別建立數(shù)據(jù)分析模型，將損傷時間推斷的時間窗縮短至4 h。呂柳[23]利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了顱腦損傷大鼠的代謝圖譜，篩選并鑒定出43個差異代謝物，為損傷時間推斷提供了新的技術(shù)和思路。

代謝組學(xué)的檢測成本較低且靈敏度高[24]，可以一次性檢測到大量代謝物水平的微量變化，代謝物的相加和交互效應(yīng)使得數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對于統(tǒng)計分析有更高的要求，目前代謝圖譜結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、機器學(xué)習(xí)算法[25]、多元統(tǒng)計分析算法成為趨勢。樣本量不足和過度的信息量會降低標(biāo)志物篩選的準(zhǔn)確性，建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)的代謝物數(shù)據(jù)庫以及采用先進的算法體系挖掘有效的生物信息，構(gòu)建穩(wěn)健的數(shù)學(xué)模型成為一種有效的解決途徑。

4 基于非編碼RNA進行損傷時間推斷

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）包括結(jié)構(gòu)性ncRNA和調(diào)控性ncRNA，在免疫應(yīng)答，基因表達(dá)，蛋白修飾，氧化應(yīng)激以及炎癥修復(fù)等過程中存在廣泛參與、調(diào)控作用[26]。損傷時間推斷主要應(yīng)用調(diào)控性ncRNA，包括lncRNA、miRNA、piRNA、circRNA等，部分調(diào)控性ncRNA在應(yīng)對損傷刺激時呈現(xiàn)時序性的變化[27]?；诖?，在損傷時間推斷領(lǐng)域，非編碼RNA的潛在作用不可忽視。

應(yīng)用ncRNA推斷損傷時間的研究主要集中在皮膚，腦，骨骼肌等組織[28]。實時熒光定量PCR（quantitative real-timePCR，RT-qPCR）可以通過檢測熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR 過程，其具有操作簡單且適合大樣本研究的優(yōu)點。Chang L等[29]研究表明miR-126在皮膚切創(chuàng)愈合過程中具有重要作用，通過RT-qPCR觀察到其表達(dá)量在1～7 d持續(xù)增加，損傷7 d時其表達(dá)量可增加至正常皮膚4倍。Etich J等[30]應(yīng)用RT-qPCR和生物信息學(xué)分析工具探尋用于量化皮膚傷口愈合過程中mRNA 和miRNA 表達(dá)的參考基因時發(fā)現(xiàn)miR-204在5～10 d表達(dá)量降低，miR-205在1～5 d表達(dá)量降低，而miR-31 表達(dá)量在5 d 后明顯增加。這些應(yīng)用RTqPCR對損傷時間的研究多是從候選分子中篩選出具有時間相關(guān)性的潛在標(biāo)志物[31-33]，未來需進一步構(gòu)建時間推斷模型，標(biāo)記物的篩選方法是推斷結(jié)果準(zhǔn)度與精度上升的關(guān)鍵步驟。

微陣列基于雜交技術(shù)可實現(xiàn)對ncRNA的高通量檢測，在短時間內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)情況。Li P等[34]應(yīng)用miRNA微陣列芯片技術(shù)檢測了皮膚損傷后產(chǎn)生的瘢痕組織，篩選出18個差異表達(dá)的miRNA，其中miR-149-5p、miR-203a、miR-222-3p、miR-122-5p 的含量隨時間呈顯著降低的趨勢。此外，Sun T等[35]應(yīng)用該技術(shù)觀察外傷性腦損傷后大鼠海馬miRNA表達(dá)的變化，在第1天、3天、5天篩選出17種均具有顯著變化的miRNA。Wang T等[36]應(yīng)用微陣列分析了切創(chuàng)皮膚愈合過程7 d內(nèi)的miRNA表達(dá)譜，篩選出54種顯著變化的miRNA，并驗證了miR-21 的表達(dá)量在傷后1 d、3 d、7 d持續(xù)上調(diào)，呈現(xiàn)時間相關(guān)性。微陣列以及RNA測序是檢測基因組表達(dá)豐度的有力手段，可以為損傷時間研究提供大量的潛在靶點。

目前，損傷時間推斷研究多采用ncRNA微陣列或二代測序技術(shù)篩選出各損傷時段差異表達(dá)的ncRNA 候選標(biāo)志物，隨后通過RT-qPCR技術(shù)靶向驗證。但ncRNA表達(dá)量可因年齡、性別、器官、環(huán)境差異而出現(xiàn)不一致結(jié)果[37-38]，由此可見為提高損傷時間推斷準(zhǔn)確性，需要進一步應(yīng)用多種技術(shù)篩選出更多高且穩(wěn)定表達(dá)的相關(guān)性分子標(biāo)志物，此外ncRNA具有高靈敏性以及高反應(yīng)性的優(yōu)點，但其也受代謝進程過快的限制，探索較為穩(wěn)定的反應(yīng)標(biāo)志物并與ncRNA聯(lián)合推斷成為趨勢。

5 應(yīng)用影像學(xué)、質(zhì)譜成像及光譜技術(shù)進行損傷時間推斷

應(yīng)用X 線、計算機斷層掃描（computed tomography，CT）及磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等影像學(xué)技術(shù)具有直觀、無創(chuàng)的優(yōu)點，在法醫(yī)臨床實踐中廣泛應(yīng)用。其推斷損傷時間的研究大多集中于骨折形成時間，主要包括肋骨，四肢長骨以及椎骨等[39]。而應(yīng)用于軟組織損傷時間的探索較少。MRI通過射頻脈沖信號激發(fā)，通過計算機形成圖像，無輻射且分辨率較高，適用于神經(jīng)、肌肉、腦等軟組織成像。Neumayer B等[40]將靜脈血注入大腿皮下組織形成血腫模型MRI技術(shù)進行檢測分析，其模型提供的查找表，可為法醫(yī)實踐提供0～366 h的分析依據(jù)。此外，鄧建強等[41]應(yīng)用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）檢測方法，結(jié)果表明挫傷組、切創(chuàng)組的1H-NMR圖譜在損傷后4 h和8 h分別檢測到NMR波峰，波峰的高度和總面積都與正常組有顯著差異，該研究本質(zhì)上是應(yīng)用NMR檢測組織代謝產(chǎn)物且無需破壞檢材，可為代謝產(chǎn)物推斷提供新視角。

基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）成像技術(shù)根據(jù)飛行時間與離子的質(zhì)荷比相關(guān)原理，可獲得生物組織中多肽和蛋白的表達(dá)譜。劉寧國和陳憶九[42]針對該技術(shù)在篩選損傷標(biāo)志物的應(yīng)用價值上進行了探討，其團隊提出該技術(shù)在研究損傷前后差異蛋白質(zhì)組方面具有高通量、高靈敏度和高精度等屬性優(yōu)勢。此外，基于MALDI-TOF 構(gòu)成的生物質(zhì)譜的組織成像技術(shù)（m ALDIimagingmass spectrometry，MALDI-IMS）可直接掃描生物樣品，同時分析生物組織切片中所有的組分（包括代謝物多肽和蛋白質(zhì)），在對組織連續(xù)切片分析后，不僅可以得到組分的二維分布圖像，也可以獲得大分子物質(zhì)的空間分布以及相對豐度等信息[43]。王麗麗等[44]利用該技術(shù)篩選出了腫瘤壞死組織中的6 277Da蛋白，其可作為結(jié)腸癌組織壞死過程中的生物標(biāo)志物。

傅里葉變換紅外（fourier transform infrared reflection，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)通過檢測物質(zhì)基團化學(xué)鍵振動信息，能夠準(zhǔn)確客觀地反映生物組織中物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與分布。董超秀等[45]利用FTIR顯微光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對挫傷骨骼肌光譜差異性與損傷時間的關(guān)聯(lián)進行了研究，結(jié)果顯示支持向量機構(gòu)建的判別模型進行4～24 h和28～48 h二分類準(zhǔn)確率達(dá)83.3%。

目前的質(zhì)譜成像以及光譜技術(shù)具有高效，便捷以及高通量等優(yōu)勢，為獲取受損組織的多元生物學(xué)信息提供了技術(shù)支持，在損傷分子標(biāo)志物的篩選以及鑒別方面具有獨特優(yōu)勢。

6 總結(jié)與展望

近年來，利用多種平臺和技術(shù)采集大規(guī)模，高通量的生物學(xué)信息，挖掘具有時間相關(guān)性的生物標(biāo)志物，取得了良好的進展，但目前的研究仍然存在一些難點：①致傷方式的復(fù)雜性。目前致傷模型的建立多采用挫傷、切創(chuàng)、擠壓傷等單一損傷方式，構(gòu)建的推斷體系無法適應(yīng)復(fù)雜多樣的損傷狀況。②影響因素的多樣性。由于體內(nèi)外各種因素的影響，如個體差異、環(huán)境差異以及醫(yī)療行為等，都會導(dǎo)致時間推斷區(qū)間出現(xiàn)偏差[46]。③檢測方法、技術(shù)及平臺缺乏標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。同一樣本使用不同的檢測技術(shù)、方法篩選出的標(biāo)志物具有差異性，不同檢測平臺的數(shù)據(jù)庫也往往具有較大差異。④缺乏人體樣本數(shù)據(jù)。由于難以獲取大量人體損傷后的動態(tài)檢測數(shù)據(jù)，推斷體系多由動物模型構(gòu)建，缺乏人體樣本的驗證。

目前，利用組學(xué)技術(shù)進行時間推斷的研究尚處于探索階段，盡管有學(xué)者嘗試建立單一領(lǐng)域多標(biāo)記物的時間推斷體系，但準(zhǔn)確度和精確度有待提高。組學(xué)技術(shù)在損傷時間推斷領(lǐng)域已展現(xiàn)了重要潛力，嘗試建立多指標(biāo)體系的綜合評價方法，即通過構(gòu)建外部表征—組織形態(tài)學(xué)—轉(zhuǎn)錄組學(xué)—蛋白組學(xué)—代謝組學(xué)綜合評價證據(jù)鏈，高通量的數(shù)據(jù)信息結(jié)合機器學(xué)習(xí)/人工智能算法，構(gòu)建穩(wěn)定的多元數(shù)學(xué)模型，有望使損傷時間推斷趨于精確化。值得注意的是這一方法的實現(xiàn)，不僅需要標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的檢測方法以及組學(xué)數(shù)據(jù)庫，而且需要更加專業(yè)的數(shù)據(jù)分析能力，此外對于平臺設(shè)備儀器也具有較高的要求。因此，找到精準(zhǔn)推斷損傷時間的方法并在法醫(yī)實踐中得到廣泛應(yīng)用，還有較長的探索之路。

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（重大科技創(chuàng)新工程）資助項目（編號：2021CXGC011305）。