【摘 要】目的：研究海水中溺死大鼠和CO2窒息死后入水大鼠盲腸微生物的演替規(guī)律，并結(jié)合隨機(jī)森林（random forest，RF）機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行死后淹沒(méi)時(shí)間（postmortem submersion interval，PMSI）的推斷。方法：本研究將70只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為海水溺死組（seawater drowning group，D組）和死后入水組（postmortem submersion group，PS組）。建立動(dòng)物模型后置于25 ℃恒溫氣候箱，按照死后經(jīng)歷時(shí)間（0、12、24、36、48、72、96 h）對(duì)盲腸內(nèi)容物進(jìn)行取材，經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）法提取DNA，細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)特異性擴(kuò)增，高通量測(cè)序等得到測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)盲腸微生物群落特征進(jìn)行多樣性分析；結(jié)合微生物組測(cè)序結(jié)果和RF機(jī)器學(xué)習(xí)算法，篩選生物標(biāo)志物，建立海水溺死和死后入水組大鼠尸體的PMSI預(yù)測(cè)模型。結(jié)果：海水溺死組和死后入水組的盲腸微生物群落特征存在差異。結(jié)合RF機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出16種推斷PMSI的潛在生物標(biāo)志物，并分別建立了海水溺死組（D組）和死后入水組（PS組）的PMSI推斷模型。海水溺死組預(yù)測(cè)模型結(jié)果：平均絕對(duì)誤差（mean absolute error，MAE）=13.272 h，R2=0.798；死后入水組預(yù)測(cè)模型結(jié)果：MAE=9.956 h，R2=0.793。結(jié)論：本研究表明，海水溺死和死后入水2種死因的盲腸微生物群落存在規(guī)律性差異，證明了結(jié)合RF機(jī)器學(xué)習(xí)算法的盲腸內(nèi)容物微生物群落演替能夠成為海水尸體PMSI推斷的有效生物學(xué)指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】溺死；死后浸沒(méi)時(shí)間；隨機(jī)森林；微生物組學(xué)；死亡時(shí)間推斷

【中圖分類號(hào)】R89 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-07-26

微生物群是一個(gè)龐大的群落集合體，其中包含單細(xì)胞細(xì)菌、病毒、真菌、古細(xì)菌和真核生物。而微生物組則代表著這些生物體在生物體內(nèi)所攜帶的遺傳信息及它們之間的相互作用。作為一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的實(shí)體，人類微生物群在人的一生中會(huì)經(jīng)歷許多變化，以適應(yīng)各種環(huán)境和個(gè)人因素，如吸煙習(xí)慣、藥物治療、飲食習(xí)慣和醫(yī)療保健狀況等[1-3]。微生物群落與人類生活緊密相連，它們不僅參與人類的正常生理活動(dòng)，還在死后尸體的腐敗分解過(guò)程中以及死亡時(shí)間的推斷中發(fā)揮著重要作用[4]。近年來(lái)，對(duì)于水中尸體死亡時(shí)間推斷開(kāi)展了多個(gè)方面的研究，主要包括尸體腐敗評(píng)分系統(tǒng)[5-6]，生化檢測(cè)等[7]。然而，這些方法大多數(shù)不夠精確或客觀。近些年，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，特別是16s rDNA序列技術(shù)的發(fā)展，使得獲得樣本的微生物組整體特征信息成為可能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物群落構(gòu)成及其動(dòng)態(tài)變化的深度分析，此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展為全面且系統(tǒng)地探究微生物群落賦予了前所未有的深度與廣度[8]。

有研究表明，微生物群落在尸體腐敗過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并且微生物群落及其組成可能發(fā)生規(guī)律性演替[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，尸體微生物的變化在尸體不同部位、不同死因、不同環(huán)境下有所不同，其中包括溺死和非溺死尸體間的微生物差異。海南四面環(huán)海，溺死案件相對(duì)多發(fā)，且由于氣溫高，尸體發(fā)現(xiàn)時(shí)多腐敗，但目前海水尸體內(nèi)部器官組織的微生物變化的研究報(bào)道缺乏。盲腸內(nèi)微生物較為豐富，且其相對(duì)封閉，并便于取材。故本研究擬模擬海南島年平均氣溫和濕度的環(huán)境[10-11]，構(gòu)建海水溺死及死后入水動(dòng)物模型，并運(yùn)用16s rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)水中尸體盲腸的微生物群落在不同死亡時(shí)間的狀況進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)合生物信息學(xué)方法，探討溺水與對(duì)照組間微生物群落的差異及其死后演替規(guī)律。此外，應(yīng)用隨機(jī)森林機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)推斷死后淹沒(méi)時(shí)間（postmortem submersion interval，PMSI），為判斷海水中腐敗尸體死因及推斷死亡時(shí)間中相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康成年SD（sprague dawley）大鼠70 只（體質(zhì)量220～250 g），隨機(jī)分為海水溺死組（seawater drowning group，以下簡(jiǎn)稱D組）和死后入水組（postmortem submersion group，以下簡(jiǎn)稱PS組）。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D組和PS組大鼠，按照死后經(jīng)歷時(shí)間（0、12、24、36、48、72、96 h）分別分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)亞組，每亞組各5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

實(shí)驗(yàn)前，在清潔環(huán)境下飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，保證12 h晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)操作均符合中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院頒布的《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作管理》的規(guī)定，并通過(guò)了海南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查（倫理審批號(hào)：HYLL-2021-346號(hào)）。

1.2 動(dòng)物模型的制備

實(shí)驗(yàn)中海水取自海南島某海岸附近海水，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)室恒溫氣候箱，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的溫度控制模擬海南島年平均氣溫條件23.1～27.0 ℃，故本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將恒溫氣候箱溫度控制在25 ℃，濕度控制在80%[10-11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前提取現(xiàn)場(chǎng)水樣標(biāo)本，-80 °C保存?zhèn)錂z。

溺死動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，隨機(jī)挑選35只大鼠，將它們放入無(wú)菌的袋子中，使其完全浸沒(méi)在水中，并按照將大鼠置于水中1 min，然后在水上呼吸30 s，重復(fù)此循環(huán)直至大鼠死亡。然后將大鼠放入已提前放置于上述實(shí)驗(yàn)條件的氣候箱內(nèi)已盛有前步所取海水的透明塑料箱中。

死后入水動(dòng)物模型：隨機(jī)選取35只大鼠置于無(wú)菌密封空塑料箱中（箱子的頂部有孔道并通過(guò)橡膠管連接于CO2瓶），打開(kāi)CO2瓶的通氣閥向泡沫箱中通入CO2約5 min，直至確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)活動(dòng)、無(wú)呼吸、瞳孔放大且心跳停止后，再觀察2 min，確認(rèn)死亡。然后將大鼠放入已提前放置于上述實(shí)驗(yàn)條件的氣候箱內(nèi)、已盛有海水的透明塑料箱中。

1.3 檢材的提取

分別于死后0、12、24、36、48、72、96 h共7個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)分別從2種死因組中隨機(jī)各取5只大鼠尸體，于無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行解剖。提取大鼠尸體盲腸內(nèi)容物至無(wú)菌凍存管中，并浸入液氮速凍，隨后取出置于-80 °C環(huán)境中保存?zhèn)錂z。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求，若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)胸腹部皮膚腐敗破潰與胸腹腔相通，則停止對(duì)該大鼠尸體的采樣工作。

依據(jù)以上原則，在實(shí)驗(yàn)中，海水溺死組和死后入水組的0、12、24、36、48、72 h這6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本均能正常采集，海水溺死組的96 h成功采集3具大鼠尸體，死后入水組96 h時(shí)間點(diǎn)成功采集2具大鼠尸體，其余大鼠因腐敗嚴(yán)重剔除出實(shí)驗(yàn)組。以上共計(jì)采集65具大鼠尸體的組織樣本。

1.4 DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增

采用CTAB法提取樣品的總基因組DNA。檢測(cè)DNA濃度和純度。根據(jù)濃度，用無(wú)菌水將DNA稀釋至1 ng/μL。以上述得到的已稀釋的DNA 作為模板，使用特異性引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)。所有PCR混合液加入15 μL Phusion? High-FidelityPCRMasterMix（NewEnglandBiolabs）、0.2 μmol/L 引物和10 ng 基因組DNA 模板，在98 ℃下進(jìn)行1 min的第一次變性，然后在98 ℃（10 s）、50 ℃（30 s）和72 ℃（30 s）下進(jìn)行30次循環(huán)，最后在72 ℃下保持5 min。

PCR 產(chǎn)物使用2% 濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。在確認(rèn)PCR產(chǎn)物合格后，酶標(biāo)儀測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度，根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度進(jìn)行等量混樣處理。混勻后再次使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR產(chǎn)物的條帶。最后，采用通用型DNA純化回收試劑盒（TianGen）對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。

1.5 高通量測(cè)序

采用NEB Next? Ultra ? Ⅱ FS DNA PCR-free LibraryPrep Kit構(gòu)建文庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建完成后經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量。合格的文庫(kù)使用NovaSeq 6000進(jìn)行PE 250上機(jī)測(cè)序。

1.6 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

根據(jù)Barcode序列和PCR 擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中將各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（Version 1.2. 11）對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接[12]，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；使用fastp軟件（Version 0.23.1）對(duì)拼接得到的Raw Tags經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）[13]；將Clean Tags數(shù)據(jù)進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(guò)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（Silva database）進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）[14]。

對(duì)以上得到的Effective Tags，使用QIIME2（VersionQIIME2-202006）軟件中的DADA2模塊進(jìn)行降噪，從而獲得最終的ASVs（Amplicon Sequence Variants，擴(kuò)增子序列變異）以及特征表[15]；使用QIIME2軟件運(yùn)用Silva 138.1數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋；使用QIIME2軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，得到所有ASV序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系；最后對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 Alpha多樣性分析

將物種豐度、樣本不同分組數(shù)據(jù)輸入至Paleontological Statistics軟件中進(jìn)行α多樣性分析，分別計(jì)算海水溺死組和死后入水組各時(shí)間點(diǎn)各樣本的物種多樣性：香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)（Shannon index）和物種豐富度（Chao-1指數(shù)）。

1.7.2 Beta多樣性分析

為了衡量不同樣本間物種多樣性的差異，根據(jù)海水溺死組和死后入水組各樣本的物種分類信息和物種豐度信息，基于weighted Unifrac距離的計(jì)算方法，使用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）來(lái)展示各樣本微生物群落的相似性和不同死因（海水溺死和死后入水）引起的微生物群落差異。

1.7.3 生物標(biāo)志物篩選、PMSI推斷模型的建立

使用機(jī)器學(xué)習(xí)中的RF算法基于上述樣本數(shù)據(jù)建立PMSI推斷模型，為了篩選生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)集，使用“randomForest”程序包中內(nèi)置函數(shù)rfcv（）探索物種數(shù)量與誤差之間的關(guān)系。并選用相應(yīng)的生物標(biāo)志物的OTU作為數(shù)據(jù)集，運(yùn)用RF算法對(duì)PMSI進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用Mean Decrease Accuracy和MAE等指標(biāo)來(lái)衡量物種在PMSI推斷模型中的重要性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05

2 結(jié) 果

2.1 海水溺死組和死后入水組大鼠盲腸微生物群落演替

2.1.1 測(cè)序結(jié)果

海水溺死組和死后入水組共收集到65例盲腸內(nèi)容物樣本，其中，海水溺死組33例，死后入水組32例。通過(guò)特異性擴(kuò)增16S rDNA V3-V4區(qū)域，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，得到原始下機(jī)數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接、過(guò)濾及均一化等處理。海水溺死組（圖1A）和死后入水組（圖1B）的稀釋曲線均顯示，隨著測(cè)序深度的增加新的ASV鑒定率逐漸降低，這意味著具有良好的序列覆蓋率。

2.1.2 微生物群落構(gòu)成及分布豐度分析

在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類水平對(duì)海水溺死組和死后入水組大鼠盲腸微生物分別選擇相對(duì)豐度最高的前10個(gè)物種做柱狀圖進(jìn)行分析。

在門分類水平上（圖2A、2G），厚壁菌門（Firmicutes）0 h時(shí)的相對(duì)豐度在海水溺死組和死后入水組中均最高，并隨后整體呈下降趨勢(shì)；擬桿菌門（Bacteroidetes）在0 h時(shí)的相對(duì)豐度僅次于厚壁菌門，并隨PMSI增加，整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。盡管厚壁菌門的相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，在死后入水組中，厚壁菌門在0、12、24、36、48、72、96 h 時(shí)的相對(duì)豐度均最高；但在海水溺死組中，隨著死亡時(shí)間的增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度上升至第一位。

在綱分類水平上（圖2B、2H），Bacteroidia、Clostridia 和Bacilli 的相對(duì)豐度在海水溺死組和死后入水組中均較高，Bacteroidia 的相對(duì)豐度在海水溺死組和死后入水組中，隨PMSI增加，整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。Bacilli的相對(duì)豐度在死后入水組的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于海水溺死組，且隨著PMSI增加，在海水溺死組中其相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，而在死后入水組中呈升高趨勢(shì)。隨著PMSI增加，Clostridia的相對(duì)豐度在海水溺死組中整體呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，且在36 h的相對(duì)豐度最低；而在死后入水組中，其相對(duì)豐度趨于穩(wěn)定。

在目分類水平上（圖2C、2I），海水溺死組和死后入水組大鼠各時(shí)間點(diǎn)中，Bacteroidales的相對(duì)豐度均保持較高水平，且在12 h組的溺死組大鼠的相對(duì)豐度最高，超過(guò)了總物種豐度的50%；0 h的溺死組大鼠中，乳桿菌目（Lactobacillales）的相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他溺死組以及死后入水組。

在科分類水平上（圖2D、2J），Muribaculaceae 在海水溺死組中的相對(duì)豐度保持較高水平，而其他科的相對(duì)豐度則相對(duì)較低。在死后入水組中，除了Muribaculaceae 以外，毛螺菌科（Lachnospiraceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae）的相對(duì)豐度也保持較高水平，且在0 h時(shí)，乳桿菌科的相對(duì)豐度最高。并且在12 h前后的相對(duì)豐度達(dá)到高峰，隨PMSI延長(zhǎng)其相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)。在48 h后，海水溺死組和死后入水組的Muribaculaceae、毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相對(duì)豐度均出現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)；乳桿菌科（Lactobacillaceae）在死后入水組中也顯示出上述豐度下降的規(guī)律，但是在海水溺死組中，乳桿菌科的相對(duì)豐度在48 h到72 h間明顯增加。

在屬分類水平上（圖2E、2K），海水溺死組與死后入水組在TOP10物種相對(duì)豐度上共有6個(gè)相同屬，分別為：Ligilac?tobacillus、Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lac?tobacillus、Dubosiella 、Romboutsia。海水溺死組中，0 h組時(shí)，杜波西氏菌屬（Dubosiella）和羅姆布茨菌屬（Romboutsia）的相對(duì)豐度保持較高水平，隨著PMSI的增加，相對(duì)豐度呈減少趨勢(shì)，Ligilactobacillus 隨PMSI的增加，相對(duì)豐度逐漸升高，在36 h組相對(duì)豐度達(dá)到較高水平，隨后其相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)；0 h組中，阿克曼氏菌（Akkermansia）的相對(duì)豐度很低，但是隨著PMSI的增加，其后各分組中均存在明顯的相對(duì)豐度。死后入水組中，0 h時(shí)，Lactobacillus 的相對(duì)豐度最高，并隨著PMSI 的增加逐漸下降；Lachnospiraceae_NK4A136_group 在12 h 組的相對(duì)豐度達(dá)到峰值，隨后相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)。0 h組的正常未腐敗盲腸內(nèi)容物的微生物群落，海水溺死組，乳酸桿菌（Lactobacillus）是非優(yōu)勢(shì)種，隨著浸沒(méi)時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)豐度明顯增加，而死后入水組中，0 h組時(shí)，乳酸桿菌（Lactobacillus）是明顯的優(yōu)勢(shì)屬，隨著浸沒(méi)時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)豐度明顯減少。

在種的分類水平上（圖2F、2L），海水溺死組與死后入水組在TOP10物種相對(duì)豐度上有4個(gè)相同物種。在0 h時(shí)，海水溺死組中，Corynebacterium_stationis和Roseburia_intestinalis的相對(duì)豐度較高，隨后其豐度呈明顯下降趨勢(shì)，Bacteroides_sar?torii 和Trichinella_pseudospiralis 的相對(duì)豐度隨死亡時(shí)間的增加，整體呈上升趨勢(shì)，且72 h時(shí)，Trichinella_pseudospiralis 的相對(duì)豐度達(dá)到最高，96 h時(shí)Bacteroides_sartorii 的相對(duì)豐度達(dá)到最高；死后入水組中，0 h時(shí)，Lactobacillus_intestinalis 的相對(duì)豐度最高，并隨后呈下降趨勢(shì)；隨著死亡時(shí)間的增加，Methanosphaera_cuniculi 的相對(duì)豐度呈逐漸升高趨勢(shì)并趨于穩(wěn)定。

2.1.3 盲腸內(nèi)容物微生物群落Alpha多樣性分析結(jié)果

基于海水溺死組和死后入水組樣本進(jìn)一步分析盲腸中微生物群落的Alpha多樣性，基于OTU水平對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析，來(lái)反映盲腸微生物群落的物種豐度和物種多樣性。運(yùn)用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，并繪制Aphla多樣性指數(shù)箱線圖（圖3）。

反映群落分布豐富度的指數(shù)為Chao-1指數(shù)。在海水溺死組中（圖3A），死亡后12 h時(shí)的物種豐富度最低，且組間有明顯差異（Plt;0.01）。說(shuō)明在0 h后，隨著時(shí)間的推移，腸道菌群的分解導(dǎo)致微生物菌群的下降。在死后入水組中（圖 3C），48 h時(shí)的物種豐富度最低，且組間有明顯差異（Plt;0.01）。

物種多樣性指數(shù)反映的是物種豐富度和均勻度的綜合情況，主要指數(shù)有Shannon指數(shù)。圖中顯示，海水溺死組的Shannon 指數(shù)（圖3B）變化不明顯，表示0～12 h間，物種多樣性存在明顯差異（Plt;0.01），其組間多樣性沒(méi)有明顯差異；死后入水組的物種多樣性（圖3D），隨著死亡時(shí)間的增加，在36 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后明顯下降（Plt;0.01）。

2.1.4 盲腸內(nèi)容物微生物群落PCoA分析結(jié)果

根據(jù)海水溺死組和死后入水組各樣本的物種分類信息和物種豐度信息，基于weighted Unifrac距離的計(jì)算方法，使用主坐標(biāo)分析（PCoA）來(lái)展示各樣本微生物群落的相似性和不同死因（海水溺死和死后入水）引起的微生物群落差異（圖4）。在海水溺死組中，在海水溺死組中，導(dǎo)致大鼠腐敗尸體微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素是第一主成分，貢獻(xiàn)值為79.9%；第二主成分則貢獻(xiàn)值為9.9%（參見(jiàn)圖4A）。總體而言，除個(gè)別樣本存在差異外，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分組的樣本，在PCoA1 的方向上，組間的差異相對(duì)較小；在PCoA2的方向上，0 h組和24 h組與其他時(shí)間分組存在差異。在死后入水組中，對(duì)于腐敗尸體的微生物群落結(jié)構(gòu)，第一主成分貢獻(xiàn)值為41.1%，第二主成分貢獻(xiàn)值為17.2%（圖4B）。在PCoA1的方向上，0 h組樣本與其他組樣本的微生物群落存在一定差異，而其他組間差異較??；在PCoA2的方向上，除個(gè)別樣本外，各組間的差異較小。

2.2 隨機(jī)森林分析以及PMSI推斷模型的建立

2.2.1 隨機(jī)森林參數(shù)調(diào)優(yōu)

使用R 包randomForest 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)森林模型擬合參數(shù)調(diào)優(yōu)圖（圖5），由圖可見(jiàn)無(wú)論是單個(gè)組別或是所有組別分類誤差率隨著randomForest函數(shù)中決策樹數(shù)量（treeNum參數(shù)）的增大而趨于穩(wěn)定。擬合模型中決策樹數(shù)量選擇5 000。

2.2.2 交叉驗(yàn)證與模型誤差率分析

本研究進(jìn)一步通過(guò)R包randomForest中rfcv函數(shù)做10折交叉驗(yàn)證并重復(fù)1次獲得變量選取與模型分類平均誤差率的關(guān)系，見(jiàn)圖6。交叉驗(yàn)證的結(jié)果顯示，隨著模型中變量數(shù)量升高，模型的誤差迅速下降，綜合考慮樣本量和誤差率，以16個(gè)細(xì)菌屬來(lái)（紅圈處對(duì)應(yīng)的x 軸數(shù)值）建立的模型誤差最合適。

2.2.3 潛在生物標(biāo)志物的篩選

結(jié)合交叉驗(yàn)證結(jié)果，選擇合適個(gè)數(shù)的差異特征進(jìn)行下一步建模。數(shù)量選擇上可根據(jù)上述圖6，選擇紅圈處對(duì)應(yīng)的x軸數(shù)值作為相應(yīng)的特征個(gè)數(shù)。依據(jù)平均精確度減少（Mean Decrease Accuracy）的值從大到小篩選16個(gè)細(xì)菌為潛在生物標(biāo)志物，并作圖7。16個(gè)PMSI推斷的潛在標(biāo)志物見(jiàn)表1。

2.2.4 大鼠RF回歸模型的建立

使用python建立RF回歸分別對(duì)海水溺死組大鼠和死后入水組大鼠進(jìn)行回歸分析，選擇上述16個(gè)種屬的大鼠盲腸微生物數(shù)據(jù)集中70%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，30%的數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，并判別正確的大鼠腐敗盲腸微生物數(shù)據(jù)作為測(cè)試數(shù)據(jù)集，最終選擇14個(gè)屬的大鼠盲腸微生物對(duì)海水溺死組大鼠的PMSI進(jìn)行RF回歸模型預(yù)測(cè)；選擇16個(gè)屬的大鼠盲腸微生物對(duì)死后入水組大鼠的PMSI進(jìn)行RF回歸模型預(yù)測(cè)。

結(jié)果顯示，海水溺死組中：RF回歸模型訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)R2=0.891，平均絕對(duì)誤差（mean absolute error，MAE）=6.496；驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)R2=0.798，MSE為218.102，MAE=13.272。

死后入水組中：RF回歸模型訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)R2=0.933，MAE 為5.43；驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)R2=0.793，MAE=9.956。兩組RF預(yù)測(cè)模型的相應(yīng)數(shù)據(jù)如下：

①特征重要性。圖8展示了海水溺死組和死后入水組RF預(yù)測(cè)模型中，各生物標(biāo)志物的重要性比例。在海水溺死組的預(yù)測(cè)模型中，Anaerovorax 的重要性最高，為24.7%；在死后入水組的預(yù)測(cè)模型中，Monoglobus 的重要性高達(dá)38.3%。

②模型評(píng)估結(jié)果。表2、表3分別展示了海水溺死組和死后入水組的模型評(píng)估結(jié)果，包含訓(xùn)練集和測(cè)試集的預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)量化指標(biāo)來(lái)衡量隨機(jī)森林的預(yù)測(cè)效果。結(jié)果顯示：

海水溺死組中：RF回歸模型訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)R2=0.891，MSE 為81.612，MAE 為6.496；驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)R2=0.798，MSE為218.102，MAE為13.272。

死后入水組中：RF回歸模型訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)R2=0.933，MSE為51.415，MAE為5.43；驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)R2=0.793，MSE為144.892，MAE為9.956。兩組RF預(yù)測(cè)模型的相應(yīng)數(shù)據(jù)見(jiàn)下表2、表3。

③測(cè)試集預(yù)測(cè)結(jié)果。表4、表5分別展示了海水溺死組（D組）和死后入水組（PS組）的隨機(jī)森林模型對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)情況。并根據(jù)此測(cè)試集的數(shù)據(jù)，做出以下實(shí)際PMSI（真實(shí)值）和預(yù)測(cè)的PMSI（預(yù)測(cè)值）的折線圖（圖9），藍(lán)色折線為實(shí)際PMSI，橙色折線為預(yù)測(cè)的PMSI，圖中展示了隨機(jī)森林模型對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)情況。從圖中可看出，死后入水組的預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值更相近。

3 討 論

3.1 大鼠盲腸內(nèi)容物微生物群落分析

法醫(yī)微生物學(xué)是法醫(yī)調(diào)查中評(píng)估水中尸體PMSI的一種新興工具[16-17]。之前有研究檢驗(yàn)了小鼠、豬和人類遺體的皮膚、骨骼、尸體相關(guān)土壤和腹部等的微生物群落，這些研究中的微生物群落會(huì)隨著周圍的生物和環(huán)境條件（例如天氣、昆蟲可及性和尸體位置）而波動(dòng)[18-21]。盲腸靠近腸道的下段，相對(duì)封閉不易受外界環(huán)境影響，微生物豐富，且靠近肛門，便于取材，目前關(guān)于死后微生物群落在海水尸體中的盲腸微生物群落演替和死亡時(shí)間推斷仍然缺乏。考慮到上述環(huán)境因素等的影響，以及物種的組成與相對(duì)豐度變化會(huì)導(dǎo)致微生物群落演替。本研究以盲腸樣本為例，對(duì)海水溺死大鼠和死后入水大鼠進(jìn)行細(xì)菌群落演替分析。

研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，海水溺死組與死后入水組中厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）占主導(dǎo)地位，這與以往研究的幾篇報(bào)道相吻合[22]。2013年，Hyde ER 等[16]在腐敗的口腔中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落主要以厚壁菌門和變形菌門為主；放線菌通過(guò)分解作用和腐殖質(zhì)的形成，在難降解生物成分的再循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，2015年，Cobaugh KL等[23]和Damann FE等[24]的研究證明，一組絲狀放線菌是重要的多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解者，通過(guò)產(chǎn)生胞外酶，并在墳?zāi)雇寥篮褪w腐爛晚期的骨頭中發(fā)現(xiàn)。

在科水平上，Muribaculaceae 在海水溺死組和死后入水組中的相對(duì)豐度均保持較高水平，Muribaculaceae含量顯著性升高，該菌屬為新確立的菌屬名，曾被稱為S24-7家族，在鼠腸道中含量較高，屬于擬桿菌門，Muribaculaceae 的變化主要與各種飲食治療、宿主條件或嚙齒動(dòng)物定殖過(guò)程有關(guān)[25]。此外，毛螺菌科（Lachnospiraceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae）的相對(duì)豐度也保持較高水平。在厚壁菌門中，毛螺菌科、乳桿菌科水解淀粉和其他糖以產(chǎn)生丁酸鹽和其他短鏈脂肪酸。毛螺菌科是一種潛在的有益菌，參與多種碳水化合物的代謝，比如水果中果膠的代謝，發(fā)酵導(dǎo)致乙酸和丁酸的產(chǎn)生，為宿主提供能量的主要來(lái)源[26]。食用富含纖維的植物性飲食與毛螺菌科（Lachnospiraceae）、Roseburia 和Prevotella的豐度增加可能與短鏈脂肪酸產(chǎn)量增加相關(guān)。本研究顯示出的48h后，兩組別的Muribaculaceae、毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相對(duì)豐度均出現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，這種現(xiàn)象也出現(xiàn)于淡水和陸地環(huán)境中人體和小鼠尸體腐敗過(guò)程[27-29]。有研究表明，梭菌科和梭菌屬是陸地和水生環(huán)境中尸體分解的關(guān)鍵物種[16-17，30]，在本研究中同樣可觀察到其較高的相對(duì)豐度。同時(shí)，也可觀察到海水溺死組乳桿菌科（lactobacillus）相對(duì)豐度在48～72 h間略升高，與上述陸地尸體情況相反。

在屬的分類水平上，海水溺死組和死后入水組的物種相對(duì)豐度存在顯著差異，并且阿克曼氏菌（Akkermansia）和Alloprevotella 在海水溺死組中的相對(duì)豐度明顯高于死后入水組，這2種菌主要常見(jiàn)于腸道內(nèi)，其中阿克曼氏菌又稱為嗜粘蛋白-阿克曼氏菌，這種菌是在2004年從人類糞便中發(fā)現(xiàn)的，是一種革蘭氏陰性菌[31]。隨著PMSI的延長(zhǎng)，物種組成和相對(duì)物種豐度的變化使得微生物群落發(fā)生演替。在本研究中，海水溺死組和死后入水組的乳桿菌屬（Lactobacillus）在0 h時(shí)差異明顯，表明水源性細(xì)菌進(jìn)入胃腸道，對(duì)盲腸微生物群落產(chǎn)生影響。

在Alpha多樣性分析中，12～36 h間，死后入水組微生物的多樣性差異顯著（Plt;0.05）。結(jié)合上述微生物群落物種豐度分析，且0 h時(shí)海水溺死組的物種豐富度明顯高于死后入水組，同樣表明海水溺死組的盲腸微生物群落受到了水源性細(xì)菌的影響。

3.2 隨機(jī)森林預(yù)測(cè)PMSI的相關(guān)分析

RF是一種機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，該模型通過(guò)隨機(jī)特征選擇和未修剪分類樹集合進(jìn)行分類或回歸[32]。它基于獨(dú)立決策樹，通過(guò)多數(shù)投票得出結(jié)果，旨在最大化樣本間的區(qū)分度[33-34]。作為有監(jiān)督學(xué)習(xí)算法，RF通過(guò)構(gòu)建分類標(biāo)簽分布模型，利用預(yù)測(cè)器特征對(duì)測(cè)試實(shí)例分類，其中預(yù)測(cè)器特征已知但類標(biāo)簽未知。RF具有快速訓(xùn)練、易調(diào)整、抗噪聲和防止過(guò)擬合的特點(diǎn)[35]。

以往學(xué)者曾利用類或門級(jí)分類數(shù)據(jù)集用機(jī)器學(xué)習(xí)方法預(yù)測(cè)PMI 或PMSI。2013 年，Metcalf JL等[36]利用皮膚微生物數(shù)據(jù)集建立RF模型，在34 d內(nèi)估計(jì)PMI 誤差為2.52～3.30 d；2016 年，Johnson HR等[37]結(jié)合微生物樣本，用k近鄰回歸器預(yù)測(cè)PMI平均誤差約3 d；Wallace JR等[38]研究豬尸體表面細(xì)菌群落演替，建立PMSI 推斷模型解釋77.2% 變異；2022年，Zhang FY等[39]基于腸道微生物群落建立的模型能夠解釋93.42%的變異，進(jìn)一步證明了利用水中尸體的菌群微生物群落結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)建立死亡時(shí)間推斷模型的可行性。

在本研究中，首先運(yùn)用隨機(jī)森林分析，篩選出了16 種可能用于PMSI 推斷的細(xì)菌作為生物標(biāo)志物，并基于這些生物標(biāo)志物來(lái)建立海水中的大鼠尸體PMSI推斷模型，并分為海水溺死組和死后入水組。首先，基于以下原則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，本研究剔除了分解過(guò)程中相對(duì)豐度低、相對(duì)豐度方差較小的OTU，這些OTU在本研究中被認(rèn)為是噪聲和低貢獻(xiàn)特征。因此，經(jīng)過(guò)篩選和剔除，14種細(xì)菌用于海水溺死組PMSI模型的建立，16種細(xì)菌用于死后入水組PMSI模型的建立。在所得到的結(jié)果中，海水溺死組預(yù)測(cè)模型所得到的MAE=13.272 h，R2=0.798；死后入水組預(yù)測(cè)模型所得到的MAE=9.956 h，R2=0.793。本研究拓展了水中尸體腸道微生物推斷死亡時(shí)間的場(chǎng)景，為更全面了解水中尸體的腐敗過(guò)程提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。當(dāng)前的研究仍存在一定的局限性，目前所得數(shù)據(jù)僅使用了相應(yīng)生物標(biāo)志物進(jìn)行RF機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)PMSI推斷的預(yù)測(cè)，后續(xù)仍需要對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，以及采用更大或更優(yōu)的微生物群落進(jìn)行分析。

目前，在開(kāi)發(fā)用于預(yù)測(cè)PMI或PMSI的可推廣微生物模型方面，最大的障礙是尸體相關(guān)數(shù)據(jù)集的規(guī)模限制和采樣頻率低。因此，在未來(lái)的工作中，需要完善和建立更長(zhǎng)的時(shí)間體系來(lái)研究微生物群落的變化對(duì)微生物演替的影響[40-41]。此外，本研究中的盲腸內(nèi)容物微生物群落僅反映了死后內(nèi)部的微生物演替。外界環(huán)境（水體環(huán)境、空氣、不同溫度）的影響以及與宿主之間復(fù)雜的相互作用是今后研究的重點(diǎn)。目前的實(shí)驗(yàn)研究工作為今后對(duì)水中尸體的微生物相關(guān)調(diào)查奠定了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，如何將本研究結(jié)果運(yùn)用到實(shí)際的水中尸體法醫(yī)調(diào)查中，還需要進(jìn)一步的研究。

3.3 16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序現(xiàn)存局限性

目前，大多數(shù)使用微生物組推斷死亡時(shí)間的研究常采用16s rDNA擴(kuò)增子測(cè)序分析。此外，基于宏基因組測(cè)序的新NGS技術(shù)也可應(yīng)用于微生物物種鑒定。然而，此方法成本更高，需要更復(fù)雜的儀器和復(fù)雜操作才能獲得可信的結(jié)果。但是，采用傳統(tǒng)的擴(kuò)增子測(cè)序方法，也存在以下不足：鑒定微生物物種時(shí)需要將序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考基因組進(jìn)行對(duì)比，然而現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的差異可能會(huì)影響已識(shí)別微生物的數(shù)量和類型，且未知微生物可能無(wú)法識(shí)別；其分類能力只能精確到屬水平，雖然本研究嘗試對(duì)已分析出的物種進(jìn)行種水平的Top10的相對(duì)豐度分析（圖3F和圖3I），但是對(duì)種水平的分類能力有限；單樣本研究通?？梢越鉀Q和識(shí)別個(gè)體之間的差異以及法醫(yī)學(xué)問(wèn)題，但無(wú)法探索多元數(shù)據(jù)間的變量。盡管收集的微生物組樣本數(shù)量正在增加，但用于采樣的方法和報(bào)告數(shù)據(jù)的方式的多樣性和差異性也妨礙分析信息的完整性和作為一個(gè)同質(zhì)實(shí)體的客觀性[42]。

4 小 結(jié)

本研究基于海南島的高溫高濕環(huán)境，研究在腐敗過(guò)程中，大鼠盲腸微生物群落演替對(duì)不同死因的影響，為水中尸體腐敗的死因診斷研究提供相應(yīng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究分析了海水中不同死因的大鼠盲腸微生物群落演替，發(fā)現(xiàn)與以往的淡水中尸體和陸上尸體的研究有相互印證的部分，同時(shí)也存在差異，海水溺死組和死后入水組的乳桿菌屬（Lactobacillus）的差異明顯，具有作為PMSI推斷的生物標(biāo)志物的潛能。此外，本研究對(duì)微生物菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)森林分析，并篩選出甲烷球形菌屬（Methanosphaera）、異桿菌屬（Allobaculum）、巴氏桿菌（Barnesiella）等16類菌株，這些菌株具有作為生物標(biāo)志物的潛能，有助于PMSI預(yù)測(cè)模型的建立?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和相應(yīng)潛在生物標(biāo)志物，本研究利用RF機(jī)器學(xué)習(xí)算法成功建立了海水溺死組和死后入水組的PMSI推斷模型，來(lái)評(píng)估2種不同死因的數(shù)據(jù)集推斷PMSI的效果。本研究表明了海水溺死和死后入水2種死因的盲腸微生物群落存在規(guī)律性差異，同時(shí)為進(jìn)一步研究利用基于微生物群落數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)模型來(lái)估計(jì)PMSI提供了方向和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：周一青）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：82060341、81560304）；海南省院士創(chuàng)新平臺(tái)科研資助項(xiàng)目（編號(hào)：YSPTZX202134）；海南省研究生創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目（編號(hào)：Qhys2023-474）。