【摘 要】目的：研究不同DNA提取試劑盒對水中溺死尸體器官組織中硅藻的分子生物學檢測后續(xù)分析的影響。方法：本研究選取經案件偵查、病理學檢驗，并在電子顯微鏡下進行硅藻形態(tài)學檢驗確認為溺水死亡的組織及水樣，本研究選擇了4種不同原理的DNA提取試劑盒，從該死者的肺、肝、脾、腎組織及水樣中提取DNA。首先，本研究測量了4 種試劑盒提取產品的核酸含量和測定260 nm和280 nm下吸光度（absorbance，A）值，以評估DNA提取的質量；其次，使用真核18S rDNA V4區(qū)域通用引物對提取的產物進行高通量測序，以比較不同DNA提取試劑盒提取的硅藻種類和數(shù)量；第三，應用硅藻特異性引物對不同的目的基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，以顯示不同試劑盒提取不同來源DNA的效果。結果：水樣和組織的硅藻形態(tài)學檢驗共鑒定出19屬硅藻。4種DNA提取試劑盒的提取產物A260 nm/A280 nm均低于1.8，PowerSoil試劑盒的相對DNA含量高于其他試劑盒，最低的是BioTeKe試劑盒。高通量測序顯示共有49種硅藻，不同試劑盒提取的硅藻DNA的質量和數(shù)量不同，不同試劑盒獲得的硅藻物種豐富度和優(yōu)勢種群也不同，在4種試劑盒中，PowerSoil試劑盒在水樣中提取的硅藻最多，TIANGEN試劑盒從水樣中提取的硅藻種類最多，有38種。電泳結果表明，不同試劑盒對提取產物的擴增效果不同，同一試劑盒對不同的樣本和不同的目標基因也有不同的擴增效果。結論：不同原理的試劑盒對后續(xù)硅藻分子學水平分析也存在不同效果，在法醫(yī)學實踐中應根據(jù)后續(xù)分析需求選擇最適合的DNA提取試劑盒。

【關鍵詞】DNA提??；溺水；硅藻；高通量測序

【中圖分類號】R114 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-08-19

硅藻檢驗已被廣泛用于鑒別水中尸體是否因溺水死亡[1-2]。硅藻檢驗方法主要分2 種，即形態(tài)學方法和分子生物學方法，形態(tài)學檢查雖直觀，但其結果可能受到生物發(fā)育階段和遺傳變異的影響，且硅藻種類極多，專業(yè)分類生物學家稀缺，進一步限制了形態(tài)學方法的應用[3]。而硅藻分子生物學檢測方法無需硝酸消化，省時環(huán)保，分類也不依賴于形態(tài)特征，因此，硅藻分子生物學檢測具有較高的靈敏度、特異性和檢出率。近年來，高通量測序的快速發(fā)展更使硅藻研究中的檢測、分類及后續(xù)分析變得更加容易[4]。但在硅藻分子檢測中，成功提取硅藻DNA是所有分析的基礎。然而，由于硅藻的特殊結構——細胞被含有二氧化硅的細胞壁覆蓋，致使硅藻的硅質硬殼不能被普通的DNA提取試劑盒破壞，在沒有物理撞擊的情況下較難破壞細胞壁，因此，從硅藻中提取DNA 相對困難[5]。同時，硅藻DNA提取會受到人體組織的干擾，這使得水中尸體硅藻DNA提取比其他樣本更困難[1]。在目前的法醫(yī)實踐中，市場上沒有用于硅藻DNA提取的專用試劑盒，根據(jù)已發(fā)表的文獻，多選用土壤DNA提取試劑盒提取硅藻DNA，土壤DNA 提取試劑盒已成為相關法醫(yī)學研究中硅藻DNA檢測的標準技術方案[6-9]，而一些實驗使用了植物或血液DNA提取試劑盒[10]。那么，不同的DNA提取試劑盒會影響分子生物學后續(xù)研究并導致結果差異嗎？

本研究通過現(xiàn)場調查和法醫(yī)尸檢確定其溺死于河中，選取不同器官組織，同時收集了溺死處水樣。本研究使用掃描電鏡來確定組織和水樣中是否有硅藻，再次驗證死者因溺水死亡，并應用形態(tài)學方法確定樣品中的硅藻種類。本研究選擇了4種常用于硅藻分子檢測但基于不同技術原理的DNA提取試劑盒，包括1種土壤DNA提取試劑盒、2種植物DNA提取試劑盒和一種血液DNA提取試劑盒，應用玻璃珠-渦旋振蕩法來提高DNA提取試劑盒的效率[11]，同時避免因物理擊打效果不足導致提取結果的差異。為了評估4種不同原理的DNA試劑盒獲得的提取物是否會影響后續(xù)的分子實驗，首先，通過分別測量DNA 濃度和DNA 純度評價不同試劑盒的DNA 提取效率：測定4 種試劑盒提取產物的總DNA 濃度，測定260 nm 和280 nm 下吸光度（absorbance，A）值（A260 nm/A280 nm）以獲得提取DNA 的純度。其次，通過高通量測序獲得不同試劑盒提取的硅藻物種豐富度。第三，通過PCR擴增硅藻特異性產物，以闡明不同試劑盒提取硅藻核DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA的效率和產量。以上結果可以為溺水案件中的硅藻分子檢驗提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

選取溺死者的組織及溺水現(xiàn)場采集的水樣。在尸檢過程中，仔細收集肺、肝、腎和脾等組織材料，嚴格避免污染。

1.1.2 儀器和試劑

MIX-30S迷你混合儀（杭州米歐儀器有限公司）、SCILOGEX D3024離心機（美國SCILOGEX有限公司）、Qubit4.0 熒光定量儀（賽默飛世爾科學有限公司），Heme 9600基因擴增儀（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司），BGsubMIDI電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），Tanon 3500R凝膠成像儀（上海天能科技有限公司），VEGA3掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN有限公司）。引物由北京中美泰和生物科技有限公司合成。

德國QIAGEN 的DNeasy?Power Soil?PRO 試劑盒（以下簡稱“Power Soil 試劑盒”）；北京天根生化科技有限公司TIANGEN DNAsecure Plant 新型植物基因組DNA 提取試劑盒（以下簡稱“TIANGEN試劑盒”）；成都福際生物技術有限公司的FOREGENE? Plant DNA Isolation 試劑盒（以下簡稱“FOREGENE 試劑盒”）；北京百泰克生物技術有限公司的BioTeKe?全血基因組DNA提取試劑盒（以下簡稱“BioTeKe試劑盒”）。

1.2 掃描電鏡法的硅藻形態(tài)學檢測

按照中華人民共和國公共安全行業(yè)標準《GA/T1662-2019法庭科學硅藻檢驗技術規(guī)范 微波消解-真空抽濾-顯微鏡法》進行硅藻形態(tài)學檢驗。將每個器官的10 g人體組織（肝、肺、腎和脾）切成薄片及10 mL水樣，微波消解后抽濾烘干、噴金鍍膜，采用VEGA3掃描電子顯微鏡對水中硅藻進行定性定量分析，參照硅藻分類相關專業(yè)書籍對采集水樣中的硅藻種屬進行鑒定識別。

1.3 高通量測序法的硅藻分子生物學檢測

1.3.1 硅藻DNA 的提取

樣品制備：取肺、肝、腎、脾組織0.5 g，充分剪碎。將 10 mL水樣以13 400 g直接離心5 min，棄去上清液，留置底部液體200 μL。隨后在全部水樣及組織樣品中分別加入0.35 g 2種尺寸的玻璃珠——大玻璃珠的直徑為1.5～2.0 mm，小玻璃珠為0.4～0.6 mm，并以最大速度進行渦旋振蕩4 min。4 種試劑盒提取DNA 的原理和步驟（圖1）。

DNA提取：嚴格按照4種DNA提取試劑盒提供的操作說明書[12-15]，分別對水樣及組織進行DNA提取。每種試劑盒分別對水、肺、肝、腎、脾5個樣本的DNA進行提取。應用酶標儀測定A260 nm/A280 nm值和核酸濃度，比較DNA純度。用QubitAssay Protocol確定DNA的總濃度，計算DNA在總核酸中所占的比例[c（DNA）/c（核酸）]。

1.3.2 高通量測序

應用4種不同的DNA提取試劑盒提取DNA后，將提取產物進行PCR擴增，選取18S rDNA V4區(qū)域引物擴增提取物，加入Phusion High-Fidelity PCR Master Mix和引物進行擴增；每一種擴增產物用Gene Tool Analysis Software上進行濃度對比，按等質量原則計算所需體積后將擴增產物混勻；用E. Z. N. A? Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產物；依據(jù)NEB Next? Ultra? DNA LibraryPrep Kit for Illumina?標準流程構建文庫。在TAG序列用于樣品鑒別后，合格的文庫使用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺進行測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH 軟件對樣本的reads 進行拼接，得到RAW Tags，使用fastp 軟件進行質控，得到高質量的CleanTags。最后使用Usearch軟件將Clean Tags與數(shù)據(jù)庫進行比對以檢測嵌合體并進行去除，從而得到最終的Effective Tags即有效數(shù)據(jù)。對以上得到的Effective Tags，使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進行降噪，并過濾掉豐度lt;5的序列[16]，從而獲得最終的特征序列（Amplicon Sequence Variants，ASVs）。采用QIIME2的classify-sklearn算法對每個ASV使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進行物種注釋[17-18]。結合不同試劑盒提取的不同樣品，得出硅藻種類的相對豐度和硅藻數(shù)量。

1.3.3 擴增不同來源的硅藻DNA

考慮到樣品中硅藻DNA含量較少，因此使用PCR 對硅藻DNA 進行擴增。應用BLAST對引物的硅藻特異性進行檢驗，同時排除該引物擴增人類基因組的可能。選擇能特異性擴增不同來源的硅藻DNA 引物：核DNA 引物D512/D978，線粒體DNA 引物DiamF3/KFdtmR，葉綠體DNA 引物UPA159-R/UPA159-F。對4個試劑盒的20個提取物進行PCR擴增，以確定DNA提取產物中是否含有硅藻DNA。具體引物信息如表1所示。

選擇了可以特異性擴增不同來源硅藻DNA的引物，核DNA 引物D512 和D978，線粒體DNA 引物DiamF3 和KFdtmR，葉綠體DNA 引物UPA159-R 和UPA159-F。引物的詳細信息，見表1。

PCR反應總體積為25 μL。包括：模板DNA 2 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 17.75 μL，10×buffer2.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1.25 μL。所有引物擴增條件如下。

D512/D978擴增條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

UPA159F/R擴增條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

DiamF3/KEdtmR擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，45 ℃60 s，70 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

所有樣品的PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后Goldview 顯色，在Tanon 3500R 凝膠成像儀下進行觀察和分析。

2 結 果

2.1 水體及器官中硅藻的電鏡觀察結果

電鏡下觀察共5個樣品，1個水樣和4個不同器官組織樣品中均含有硅藻，共有19種硅藻，其中，水樣中可見17種硅藻，肺中可見17種硅藻，在其他組織中僅能觀察到少數(shù)幾種，且硅藻含量低。脾臟中的8種硅藻在所有樣品中均存在。肺中硅藻的含量遠高于其他組織，10 g肺組織樣本中有770 168個硅藻。5個樣品中硅藻的詳細種類和數(shù)量見表2。圖2為不同樣品中部分硅藻的電鏡照片。

2.2 各試劑盒提取的DNA總濃度和質量

肝組織核酸含量在各試劑盒所提取產物中均表現(xiàn)為最高；水樣中DNA 的總濃度低于組織。PowerSoil 試劑盒和BioTeKe試劑盒提取的水樣DNA濃度低于檢測線（0.5 ng/mL），無法檢測出濃度值；在所有樣品中，BioTeKe試劑盒提取的DNA濃度低于其他試劑盒；所有樣品的A260 nm/A280 nm 數(shù)據(jù)均低于1.8，其中PowerSoil試劑盒提取的水樣A260 nm/A280 nm數(shù)值最高為1.698，F(xiàn)OREGENE 試劑盒提取的腎臟數(shù)值最低為0.595。因此本研究計算DNA在總核酸中的比例[c（DNA）/c（核酸）]，PowerSoil 試劑盒的相對DNA 含量高于其他試劑盒，BioTeKe試劑盒最低。所有數(shù)據(jù)如表3所示。

2.3 各試劑盒提取的硅藻物種的相對豐度

根據(jù)高通量測序結果分析，對比數(shù)據(jù)庫中的已知序列，4 個試劑盒提取的硅藻DNA 來自3綱4目6科33屬49種。其中，Power Soil 試劑盒可以從水樣中的30種硅藻中提取出6 170個硅藻DNA的ASV，相對豐度最高，其中2 239個硅藻為弧眼藻屬。TIANGEN試劑盒可提取水樣中最多38種硅藻DNA。BioTeKe試劑盒可從腎臟樣本中的7種硅藻中提取出3 019個硅藻DNA的ASVs，其中骨條藻屬的硅藻有2 830個。BioTeKe提取的肝、肺、脾樣本中弧眼藻屬分別為1 561個、1 209 個和571 個，硅藻的物種豐富度排名第3 至第5。4種DNA試劑盒所提取的硅藻種類最多的是弧眼藻屬，其他含量較高的硅藻有骨條藻、直鏈藻、舟形藻?；⊙墼逡彩欠魏透沃凶疃嗟奈锓N（表4）。圖3所示，按照4個試劑盒所提取的不同樣本的硅藻總數(shù)排列，同時顯示優(yōu)勢種硅藻的數(shù)量及不同試劑盒提取的硅藻物種數(shù)。

2.4 不同試劑盒應用不同區(qū)域引物擴增及電泳結果

用引物D512/D978擴增硅藻18S rDNA時，在所有樣品中，4 種試劑盒提取的擴增產物均出現(xiàn)條帶，條帶長度在250～400 bp。Power Soil試劑盒，所提取的腎臟中硅藻 DNA的擴增產物電泳條帶比其他條帶更暗（圖4A）。BioTeKe試劑盒提取物的整體電泳條帶均有顯示但較暗（圖4B）。FORGENE試劑盒提取的水樣中硅藻DNA的電泳條帶明顯亮于其他組織的條帶（圖4C）。TIANGEN劑盒提取的肝和腎組織中硅藻DNA擴增條帶稍暗（圖4D）

使用引物DiamF3/KEdtmR擴增線粒體COI-5P區(qū)域的硅藻DNA時，所有電泳條帶均可見，條帶長度在500～750 bp。但所有組織的擴增產物電泳條帶均比水樣亮，BioTeKe提取的水樣中硅藻DNA的電泳條帶最暗（圖5）。

使用引物UPA159F/UPA159R 擴增葉綠體UPA 區(qū)域的硅藻DNA時，只有水樣的擴增產物電泳條帶可見，且正確的長度位于100～200 bp。BioTeKe 試劑盒提取的水樣中硅藻DNA條帶暗于其他條帶。UPA159F/UPA159R擴增產物電泳條帶均比其他目的基因引物擴增的條帶暗（圖6）。

3 討 論

在硅藻檢驗中，分子生物學方法的優(yōu)勢不言而喻，安全、環(huán)保、快速、準確，且結果更客觀。在本研究中，高通量測序法在物種鑒定的精確度上明顯優(yōu)于掃描電鏡法，掃描電鏡法僅在屬水平上進行分類，檢測出19屬硅藻，且每屬硅藻的數(shù)量是通過公式換算進行的估算；通過高通量測序則檢驗出33屬49種的硅藻，遠多于掃描電鏡的結果，每一種硅藻的數(shù)量是根據(jù)測序的DNA數(shù)量進行計數(shù)。

掃描電鏡法在水樣中檢測到17種硅藻，在肺組織中檢測到2種未發(fā)現(xiàn)的硅藻，這可能是因為水中這兩種硅藻的含量較低，伴隨肺的硅藻富集作用而在肺中被發(fā)現(xiàn)；同時，電子顯微鏡的視野范圍非常有限，一些硅藻可能在肉眼觀察中無法被準確發(fā)現(xiàn)[22]，同時，形態(tài)學檢驗依賴于硅藻外殼的完整性，這也可能是電子顯微鏡結果低于高通量測序結果的原因。但分析高通量測序的結果中，水樣中硅藻的數(shù)量及物種均高于其他組織，且水樣中的硅藻物種均涵蓋各組織中的硅藻物種。

然而，高通量測序的結果對數(shù)據(jù)庫有很強的依賴性。目前，高通量測序技術用于法醫(yī)硅藻檢驗和分類的參考數(shù)據(jù)庫并不完整，數(shù)據(jù)庫中硅藻物種的全面覆蓋尚未實現(xiàn)。藻類的分類也存在一些錯誤，這可能會導致不正確的分類結果[23]。雖然掃描電鏡的檢測結果具有很高的可靠性，但檢測時間較長、樣本需求量大，檢測靈敏度低于高通量測序，同時，掃描電鏡法要求硅藻外殼完整，微波消解法可能一定程度上會破壞硅藻的外殼，這也可能是電子顯微鏡結果低于高通量測序結果的原因[24]。然而，它們都不能進行完全準確的定量分析。電子顯微鏡的含量可以通過隨機選擇視野來計算，而高通量測序仍舊依賴于對全部的硅藻DNA進行提取，但可以保證提取比例的一致性[25]。這需要科學技術的不斷發(fā)展來解決更精確的定量問題[26]。

在硅藻相關領域的研究中，研究主要針對水樣和底棲硅藻樣品的檢測展開，因此硅藻DNA提取的主要方法是使用為植物或土壤樣品開發(fā)的商業(yè)化試劑盒。在法醫(yī)學中涉及溺水的硅藻檢測中，不僅需要檢測水樣和肺組織，還需要從肝、脾、腎等組織中提取硅藻DNA。然而，到目前為止，還沒有對不同原理試劑盒從法醫(yī)溺水樣本中提取硅藻DNA的效果進行比較研究。

本研究選擇了4種具有不同原理的DNA提取試劑盒，在4種試劑盒中，Power Soil試劑盒使用物理擊打和化學裂解法提取DNA；BioTeKe試劑盒使用蛋白酶K消化蛋白質；FOREGENE試劑盒使用專利蛋白酶消化；TIANGEN 劑盒DNA提取采用非蛋白酶法提取植物DNA，以上試劑盒部分專利試劑保密，更為詳細的原理本研究也無法得知。由于硅藻的硅質外殼，通過物理擊打破壞硅藻細胞壁更有利于DNA 釋放，也為排除因PowerSoil 試劑盒由于物理擊打效果較好的可能，在之前的研究中，本研究應用玻璃珠-渦旋振蕩法對不同試劑盒進行改良，提取硅藻DNA均取得了良好的效果[11]。應用改良法后，本研究一方面需研究不同組織中是否因硅藻濃度不同而影響分子檢驗效果，另一方面不同原理DNA提取試劑盒是否影響后續(xù)硅藻分子學分析仍需進行比較研究。另外，市面上有多種DNA提取試劑盒，本實驗的4個試劑盒并不能代表所有試劑盒，但選取了基于4種不同裂解原理的試劑盒作為實驗對象。

根據(jù)A260 nm/A280 nm值可以判斷DNA純度，但本實驗中所有的結果均低于1.8，可能因為所提取的樣品中含有蛋白質、酚類等物質。核酸含量和DNA濃度也不代表硅藻的數(shù)量，核酸含量包括DNA 和RNA，DNA濃度包括所有生物的DNA，但DNA在總核酸中的比例能表明不同DNA試劑盒純化DNA的效能，至少展示了去除RNA的能力。此外，DNA濃度也不會完全影響擴增效果，理論上PCR僅需一個基因組即可完成擴增[27]。因此本研究能確認的是所有試劑盒提取的DNA 都與RNA、蛋白質或其他物質混合，而許多研究表明手提法結合試劑盒法可以提高DNA純度。

通過高通量測序計算提取硅藻的相對豐度，可發(fā)現(xiàn)4 種試劑盒從水樣中提取硅藻的相對豐度通常高于組織，肺組織中硅藻的相對豐度也遠高于其他組織，主要原因是硅藻在水體中和肺中種類較多。一方面因為溺水時，溺水者在溺水過程中的劇烈呼吸使水由呼吸作用直接進入肺部；另一方面，硅藻通過血液循環(huán)進入其他器官，有些硅藻的直徑比血管大，造成硅藻在肺內富集，數(shù)量及種類均較高[28]。但本研究也無法將水樣和組織樣本進行比較，因為它們檢測的單位量不同。通過血液DNA提取試劑盒從組織中提取硅藻物種的相對豐度高于其他試劑盒。這種現(xiàn)象的可能原因還是BioTeKe試劑盒基于蛋白酶K具有很強的消化組織的能力[29]。

擴增產物電泳結果也反映了硅藻的物種豐富度，但不能在提取物中直接表示硅藻DNA含量，其中一個原因是PCR的優(yōu)勢擴增，不同的硅藻對不同的引物可能有不同的擴增效果[30]。目前尚不能解決混合物的DNA定量問題。在此研究中，本研究選擇了細胞核、線粒體和葉綠體不同區(qū)域的引物，它們在擴增結果上展示了較大的差距。（1）使用相同DNA提取試劑盒時，細胞核和線粒體引物在所有樣本中均有擴增條帶，但葉綠體引物僅擴增出水樣中硅藻DNA，一個原因是葉綠體DNA 總量少于細胞核和線粒體DNA總量；另一個原因可能是沒有立即發(fā)現(xiàn)尸體，即硅藻已經進入組織一段時間，因此葉綠體（包括葉綠體DNA）在沒有光線的情況下會發(fā)生降解，且DNA提取時間更晚于尸體發(fā)現(xiàn)時間。因此，在應用葉綠體的引物對硅藻DNA進行擴增時，必須考慮葉綠體降解的因素，較晚發(fā)現(xiàn)的尸體最好選擇細胞核線粒體引物進行PCR擴增，不應選用葉綠體DNA的引物。通過玻璃珠-渦旋振蕩法改進的所有4 種試劑盒提取產物可用于PCR擴增。（2）在不同的試劑盒中，BioTeKe提取產物中，水樣的硅藻DNA擴增產物電泳條帶亮度略低于其他試劑盒，但是組織中硅藻DNA擴增產物的電泳條帶亮度差距不大，這一結果與高通量測序的結果是一致的。在高通量測序的分析結果中，具有不同原理的不同試劑盒可能對特定硅藻具有更好的提取效果。例如，一些硅藻的細胞壁上有孔，而另一些則沒有，這導致蛋白酶K不能進入所有硅藻殼進行消化裂解[24]。PowerSoil試劑盒在每個樣本中提取最多的硅藻均是Arcocellus，這可能因為河流中Arcocellulus 的含量最初比其他硅藻多，而一些硅藻的直徑小于血管直徑，這些硅藻更容易進入器官并在器官中富集。

本研究只選擇了1個案例來研究從不同試劑盒中提取硅藻DNA的差異，因其目的不是研究溺死樣本間的差異性，而是研究不同DNA提取試劑盒對法醫(yī)學硅藻DNA提取的影響，并且通過DNA提取的基本原理可以合理化差異，保證了結果的一致性和可比較性，雖這種差異是否普遍仍具有一定風險，特別是物種豐度低的硅藻，提取時也可能未被抓取，導致結果的區(qū)別，但這種風險的影響較小，對優(yōu)勢物種的影響不大；另外，對于不同水域發(fā)生的溺死，即硅藻群落結構發(fā)生變化，特別是對基于蛋白酶K消化的DNA提取試劑盒影響也許會較大，是否具有相同的結果也是下一步繼續(xù)研究的內容。因此，在后續(xù)研究中需增加溺死模型及樣本量進行多次重復實驗。

綜上所述，應根據(jù)后續(xù)分析的需求，合理選用不同原理的DNA提取試劑盒對硅藻樣本進行分子生物學檢驗，也期待硅藻專用DNA提取試劑盒的研發(fā)，以方便法醫(yī)實踐中的應用。

參考文獻

[1] Zhou YY，Cao YJ，Huang J，et al. Research advances in forensicdiatom testing[J]. Forensic Sci Res，2020，5（2）：98-105．

[2] Piette MHA，De Letter EA. Drowning：still a difficult autopsy diagnosis[J]. Forensic Sci Int，2006，163（1/2）：1-9．

[3] Sánchez C，Cristóbal G，Bueno G. Diatom identification includinglife cycle stages through morphological and texture descriptors[J]. PeerJ，2019，7：e6770．

[4] Liu MY，Zhao Y，Sun YZ，et al. Comparative study on diatom morphologyand molecular identification in drowning cases[J]. Forensic SciInt，2020，317：110552．

[5] 付志鑫. 長白山地區(qū)橋彎藻科（Cymbellaceae）和舟形藻科（Naviculaceae）植物的分類學研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱師范大學，2018．

Fu ZX. Taxonomic Study on Cymbellaceae and Naviculaceae Plants inChangbai Mountain Area[D]. Harbin：Harbin Normal University，2018．

[6] Hu D，Pi ZY，Zhang ZR，et al. Application of 18S rDNA clone libraryto detect diatom population diversity in Dianchi[J]. Fa Yi Xue ZaZhi，2019，35（4）：444-447．

[7] Han JG，Wang CB，Li XB，et al. Comparative analysis between diatomnitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method[J]. Fa Yi Xue Za Zhi，2013，29（5）：356-359．

[8] Xiao C，Xu QY，Li H，et al. Development and application of a multiplexPCR system for drowning diagnosis[J]. Electrophoresis，2021，42（11）：1270-1278．

[9] Yu ZH，Xu QY，Xiao C，et al. SYBR Green real-time qPCRmethod：Diagnose drowning more rapidly and accurately[J]. Forensic SciInt，2021，321：110720．

[10] Vasselon V，Domaizon I，Rimet F，et al. Application of highthroughputsequencing（HTS） metabarcoding to diatom biomonitoring：do DNA extraction methods matter？[J]. Freshw Sci，2017，36（1）：162-177．

[11] 蔡 杰，王 博，胡孫林，等. 玻璃珠-渦旋振蕩改良法用于硅藻DNA提取[J]. 法醫(yī)學雜志，2022，38（1）：119-126．

Cai J，Wang B，Hu SL，et al. Improved glass bead-Vortex oscillationmethod for DNA extraction from diatom[J]. J Forensic Med，2022，38（1）：119-126．

[12] Yuan J，Li MZ，Lin SJ. An improved DNA extraction method forefficient and quantitative recovery of phytoplankton diversity in naturalassemblages[J]. PLoS One，2015，10（7）：e0133060．

[13] 天根DNAsecure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒說明書.tiangen.com/upload/file/20230423/20230423163431_79728.pdf [EB/OL].北京天根生化科技有限公司.

Tiangen DNAsecure New Plant Genomic DNA Extraction Kit Instruction.tiangen.com/upload/file/20230423/20230423163431_79728.pdf[EB/OL].TIANGEN Biotech（ Beijing） Co.，Ltd.

[14] 福際植物基因組DNA提取試劑盒說明書[EB/OL].（ 2021-07-01）[2024-05-01]. http：//www.foregene.com/Uploadfiles/Files/2021-7-1/2021711447549519.pdf.

Plant DNAIsolation Kit Instruction[EB/OL]. （2021-07-01）[2024-05-01]. http：//www.foregene.com/Uploadfiles/Files/2021-7-1/2021711447549519.pdf.

[15] 全血基因組DNA提取試劑盒（溶液型）[EB/OL].（ 2020-06-30）[2024-06-01]. http：//www.bioteke.com/product-show-aid-431.

Whole blood genomic DNA extraction kit（solution type）[EB/OL].（2020-06-30）[2024-06-01]. http：//www. bioteke. com/product-showaid-431.

[16] Callahan BJ，McMurdie PJ，Rosen MJ，et al. DADA2：highresolutionsample inference from Illumina amplicon data[J]. Nat Methods，2016，13（7）：581-583．

[17] Amir A，McDonald D，Navas-Molina JA，et al. Deblur rapidly resolvessingle-nucleotide community sequence patterns[J]. mSystems，2017，2（2）：e00191-e00116．

[18] Bokulich NA，Kaehler BD，Rideout JR，et al. Optimizing taxonomicclassification of marker-gene amplicon sequences with QIIME 2’sq2-feature-classifier plugin[J]. Microbiome，2018，6（1）：90．

[19] Zimmermann J，Jahn R，Gemeinholzer B. Barcoding diatoms：evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene，including newprimers and protocols[J]. Org Divers Evol，2011，11（3）：173-192．

[20] Evans KM，Wortley AH，Mann DG. An assessment of potentialdiatom “barcode” genes（cox1，rbcL，18S and ITS rDNA） and theireffectiveness in determining relationships in Sellaphora（Bacillariophyta）[J]. Protist，2007，158（3）：349-364．

[21] 徐曲毅. 溺死相關浮游生物DNA檢測技術研究[D]. 廣州：廣東工業(yè)大學，2018．

Xu QY. Study on DNA detection technology of plankton associated withdrowning[D]. Guangzhou：Guangdong University of Technology，2018．

[22] Zhang PP，Kang XD，Zhang SR，et al. The length and width of diatomsin drowning cases as the evidence of diatoms penetrating thealveoli-capillary barrier[J]. Int J Legal Med，2020，134（3）：1037-1042．

[23] Vasselon V，Rimet F，Tapolczai K，et al. Assessing ecological statuswith diatoms DNA metabarcoding：scaling-up on a WFD monitoringnetwork（Mayotte island，F(xiàn)rance）[J]. Ecol Indic，2017，82：1-12．

[24] Zg?obicka I，Gluch J，Liao ZQ，et al. Insight into diatom frustulestructures using various imaging techniques[J]. Sci Rep，2021，11：14555．

[25] 張丁予，章婷曦，王國祥. 第二代測序技術的發(fā)展及應用[J]. 環(huán)境科學與技術，2016，39（9）：96-102．

Zhang DY，Zhang TX，Wang GX. Development and application ofsecond-generation sequencing technology[J]. Environ Sci Technol，2016，39（9）：96-102．

[26] 田 李，張 穎，趙云峰. 新一代測序技術的發(fā)展和應用[J]. 生物技術通報，2015（11）：1-8．

Tian L，Zhang Y，Zhao YF. The next generation sequencing technologyand its applications[J]. Biotechnol Bull，2015（11）：1-8．

[27] Gryp T，Glorieux G，Joossens M，et al. Comparison of five assaysfor DNA extraction from bacterial cells in human faecal samples[J]. JAppl Microbiol，2020，129（2）：378-388．

[28] Research status and prospects of DNA barcoding technology intea varieties identification[J]. Bot Res，2021，10（5）：734-738．

[29] Ming M，Meng XZ，Wang EY. Evaluation of four digestive methodsfor extracting diatoms[J]. Forensic Sci Int，2007，170（1）：29-34．

[30] 毛啟迪，楊蘇文，金位棟，等. DNA條形碼技術在藻類分類學中的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 水生態(tài)學雜志，2020，41（6）：9-18．

Mao QD，Yang SW，Jin WD，et al. Research status and prospects forDNA barcode technology in algal taxonomy[J]. J Hydroecology，2020，41（6）：9-18．

（責任編輯：周一青）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：82060341，81560304）；海南省院士創(chuàng)新平臺科研資助項目（編號：YSPTZX202134）；海南醫(yī)學院研究生創(chuàng)新科研課題資助項目（編號：Qhys2023-444）。