摘 要：為了研究赤道幾內(nèi)亞惡性瘧原蟲多藥耐藥性蛋白1（Pfmdr1）基因和惡性瘧原蟲氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Pfcrt）基因的突變基因型和突變趨勢走向特征．從非洲赤道幾內(nèi)亞采集2011-2022年惡性瘧原蟲感染者血樣并提取基因組DNA．采用巢式PCR技術(shù)分別擴(kuò)增Pfmdr1和Pfcrt基因，結(jié)合Sanger測序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序．利用Snapgene 6.0.2對DNA序列進(jìn)行比對，篩查相關(guān)突變位點(diǎn)，并用Haploview 4.2對突變位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡（LD）分析．結(jié)果表明赤道幾內(nèi)亞惡性瘧原蟲耐藥基因Pfmdr1和Pfcrt的突變比例降低，并且野生型寄生蟲種群數(shù)量超過突變種群．由此說明赤道幾內(nèi)亞停止使用氯喹（CQ），并將青蒿琥酯-阿莫地喹（ASAQ）作為一線治療方案是有效的．

關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲；瘧疾；Pfmdr1基因；Pfcrt基因；赤道幾內(nèi)亞；耐藥性

中圖分類號：R 382.3+1" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" 文章編號：1007-6883（2024）06-0041-11

DOI：10.19986/j.cnki.1007-6883.2024.06.007

瘧疾是經(jīng)按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病，是世界三大傳染病之一．共有五種寄生蟲會導(dǎo)致人類瘧疾，其中惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲危害最大［1］．惡性瘧原蟲是最致命的瘧疾寄生蟲，在非洲大陸上最流行［2-3］．2021年全世界近一半人口面臨瘧疾風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)生2.47億例瘧疾病例，近61.9萬人死于瘧疾，其中非洲區(qū)域占瘧疾病例數(shù)的95%和瘧疾死亡人數(shù)的96%［4］．

赤道幾內(nèi)亞共和國位于非洲中西部，是全球瘧疾感染最嚴(yán)重的的國家之一．一直以來赤道幾內(nèi)亞首都馬拉博所在的比奧科島（Bioko island）地區(qū)的瘧疾傳播率很高，并且瘧疾病例大多由惡性瘧原蟲感染所導(dǎo)致［5］．氯喹（chloroquine，CQ）和磺胺多辛-乙胺嘧啶（sulfadoxine and pyrimethamine，SP）耐藥性的出現(xiàn)和傳播，使得世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法（artemisinin-based combination therapies，ACTs）作為治療惡性瘧的一線療法［1，6］．2008～2020年期間，赤道幾內(nèi)亞衛(wèi)生與社會福利部推薦將青蒿琥酯-阿莫地喹（artesunate-amodiaquine，ASAQ）作為一線藥物，蒿甲醚/苯勿醇（artemether/lumefantrine，AL）作為二線藥物，用于治療非重癥瘧疾．2020年以來，推薦將AL確定為治療非重癥瘧疾的一線藥物［5，7］．用藥方案的改變與寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生是嚴(yán)密相關(guān)的．本研究旨在了解2011～2022年非洲赤道幾內(nèi)亞的比奧科島的患者血樣的惡性瘧原蟲多藥耐藥性蛋白1基因（Plasmodium falciparum multidrug resistance protein1，Pfmdr1）和惡性瘧原蟲氯喹耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter，Pfcrt）的突變情況和趨勢走向，并結(jié)合巢式PCR技術(shù)和Sanger測序法檢測基因點(diǎn)突變，探究惡性瘧原蟲Pfmdr1和Pfcrt基因多態(tài)性及其關(guān)聯(lián)性．

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究以2011年1月至2022年12月期間赤道幾內(nèi)亞比奧科島馬拉博地區(qū)的瘧原蟲患者為研究對象，由廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療隊(duì)采集患者外周血樣本．惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)血斑由湖北醫(yī)藥學(xué)院寄生蟲研究所李健博士贈送．

1.2 樣本收集

經(jīng)患者或其家屬同意之后，采集患者外周血3 mL-5 mL，通過WHO推薦方法計(jì)算惡性瘧原蟲密度［8］，隨后經(jīng)熒光定量PCR法進(jìn)行蟲種鑒定和鏡檢確認(rèn)［9］．同時(shí)制作厚薄血膜與干血斑，血斑自然干燥后采用真空袋密封，送抵本實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃超低溫冰箱．隨機(jī)抽樣選取的惡性瘧疾陽性患者血樣共1 033例，其中2011～2012年206例，2013～2014年173例，2017～2018年201例，2019年116例，2020年101例，2021年103例，2022年133例，各年份收集的樣本差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（[Pgt;0.05]）．

1.3 倫理學(xué)聲明及知情同意

本研究已獲得馬拉博地區(qū)醫(yī)院倫理委員會、湖北醫(yī)藥學(xué)倫理委員會、湖北武漢疾控中心倫理委員會以及廣東省援助赤道幾內(nèi)亞醫(yī)療倫理委員會的倫理批準(zhǔn)，倫理編號為20211103258．病例樣本和流行病學(xué)信息采集已獲得瘧疾患者或其監(jiān)護(hù)人知情同意．

1.4 主要試劑

Chelex 100樹脂（11139-85-8，Chelex100）（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）、1.5 mL離心管和0.2 mL PCR薄壁管（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司）、PCR引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）、PC09-2×Taq PCR MasterMix、EP01-普通瓊脂糖凝膠6×RNA/DNA上樣緩沖液、EP03-50×TAE Buffer、EP06-GoldenView核酸染料（北京艾德萊生物科技有限公司）、LD DS2000 DNA Marker（廣州東盛生物科技有限公司）、BY-R0100 BIOWEST西班牙瓊脂糖（上海貝晶生物技術(shù)有限公司）．

1.5 主要儀器

Min1524高速離心機(jī)、Mini 4K掌上離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）、DH300干式恒溫器（中國杭州瑞誠儀器有限公司）、Vortex-M旋渦震蕩儀（中國上海滬析儀器）、梯度PCR基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）、DYY-6D電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、M1-L213B微波爐（中國美的集團(tuán)）、醫(yī)學(xué)智凈款生物安全柜HR1200-IIA2和DW-86L829海爾醫(yī)用超低溫冰箱-80 ℃（中國海爾生物醫(yī)療股份有限公司）．

1.6 方法

1.6.1 引物設(shè)計(jì)

參照相關(guān)文獻(xiàn)方法［10-11］，根據(jù)Pfmdr1基因［Asn86Tyr（N86Y）和Tyr184Phe（Y184F）］和Pfcrt基因［Cys72Ser（C72S）；Met74Ile（M74I）；Asn75Gla（N75E）和Lys76Thr（K76T）］的突變熱點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)．從瘧原蟲基因數(shù)據(jù)庫（https：//plasmodb.org/）下載惡性瘧原蟲3D7株P(guān)fmdr1基因（PF3D7_0523000）和Pfcrt基因（PF3D7_0709000）的標(biāo)準(zhǔn)序列．用Primer Premer 5.0軟件和Primer-BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）設(shè)計(jì)了兩對巢式PCR引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1．

1.6.2 DNA提取

根據(jù)以往的文獻(xiàn)［10，12］，采用Chelex-100樹脂法提取基因組DNA，其步驟如下：首先剪取5 mm×5 mm濾紙干血斑，加無菌水1 mL，漩渦震蕩10 s后，放入4 ℃冰箱內(nèi)浸泡24 h．隨后使用高速離心機(jī)13 000 rpm離心3 min，用超純水反復(fù)洗至無色，保留紙片和大約100 μL的無菌水．另外加入200 μL濃度為5%的Chelex-100懸濁液，旋渦震蕩使其充分混勻，置于干式恒溫器中56 ℃加熱2 h，98 ℃變性10 min．加熱結(jié)束后，13 000 rpm離心3 min，上清液即為提取出來的基因組DNA．最后將提取好的基因組DNA置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆茫?/p>

1.6.3 基因片段擴(kuò)增

采用巢式PCR擴(kuò)增目的基因片段［11］．PCR反應(yīng)體系（第一輪）：DNA模板2 μL，10 μmol/L的上/下游引物各1 μL，2×Taq PCR預(yù)混液12.5 μL，用8.5 μL的ddH2O補(bǔ)足至25 μL；PCR反應(yīng)體系（第二輪）：第一輪PCR產(chǎn)物4 μL為模板，10 μmol/L的上/下游引物各2 μL，2×Taq PCR預(yù)混液25 μL，用17 μL的ddH2O補(bǔ)足至50 μL．PCR反應(yīng)條件見表1，第二輪PCR反應(yīng)完畢后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照保存．

1.6.4 DNA測序和序列比對

將成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送往蘇州金唯智生物科技有限公司廣州分公司進(jìn)行Sanger測序，用Snapgene 6.0.2軟件將測序結(jié)果與從瘧疾基因數(shù)據(jù)庫下載的惡性瘧原蟲3D7株P(guān)fmdr1基因（PF3D7_0523000）和Pfcrt基因（PF3D7_0709000）的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，篩查堿基位點(diǎn)突變情況．利用Chromas 2.6.6軟件分析基因類型．

1.6.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將樣本信息、測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)等用Microsoft Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．分類資料的差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)．為了確定Pfmdr1和Pfcrt基因SNP之間的相關(guān)性，使用Haploview 4.2軟件計(jì)算D’值和r2值，對兩個(gè)基因中可能作為耐藥標(biāo)記的每個(gè)成對SNP進(jìn)行連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析，[Plt;0.05]認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 病例基本情況

1 033例惡性瘧感染病例全部來源于赤道幾內(nèi)亞比奧科島馬拉博地區(qū)，其中男性557例，占53.92%；女性476例，占46.08%，年齡范圍5～78歲，中位數(shù)45歲．

2.2 Pfmdr1和Pfcrt基因巢式PCR目的片段擴(kuò)增

惡性瘧患者血樣1 033份均成功擴(kuò)增出Pfmdr1和Pfcrt基因目的片段．Pfmdr1基因第86、184位點(diǎn)目的片段會在526 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖1A），Pfcrt基因第72、74～76位點(diǎn)目的片段會在145 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖1B），所有片段都符合預(yù)期．

2.3 Pfmdr1基因突變趨勢分析

全部樣本Pfmdr1基因目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均被成功測序，測序結(jié)果與惡性瘧原蟲3D7株P(guān)fmdr1基因（PF3D7_0523000）的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對．Pfmdr1基因第86、184位點(diǎn)中，檢測出9種基因型，其中NY為野生型；YY、NF和YF為純合突變型（突變位點(diǎn)用下劃線表示，下同）；N/Y Y、N/Y F、N Y/F、Y Y/F和N/Y Y/F為混合突變型（圖2A和圖2B）．9種基因型中，YY和N/Y Y的占比最低，相反NF和YF是比奧科島上主要流行的純合突變型（表2）．NF的突變率由2011～2012年的17.96%（37/206）到2022年的30.83%（41/133），呈上升趨勢，在2019年達(dá)到最大值39.66%（46/116）；而雙突變單倍型YF由2011-2012年的39.32%（81/206）持續(xù)降低到2021年的3.88%（4/103），2022年上升到6.02%（8/133）（表2）．此外，混合突變型中，Y Y/F從2019年開始就沒有被檢測出；N Y/F的突變率呈上升趨勢；雙突變混合型N/Y Y/F突變趨勢起伏不定．但總體而言Pfmdr1基因第86位點(diǎn)的總突變率（包括混合突變型）由2011～2012年的63.11%（130/206）到2022年的23.31%（31/133），呈現(xiàn)明顯的下降趨勢（圖3A）；第184位點(diǎn)的總突變率由2011～2012年的84.47%（174/206）到2022年的71.43%（95/133），下降幅度小（圖3B）．值得注意的是，所有年份都頻繁在第102位點(diǎn)檢測出一個(gè)同義突變．隨著時(shí)間的推移，野生型比例的增加使得純合突變單倍型不斷地減少（圖3D和圖3E），表明赤道幾內(nèi)亞采取的ACTs的治療方案有效，說明了Pfmdr1基因?qū)ΜF(xiàn)有抗瘧藥的敏感性提高．

2.4 Pfcrt基因突變趨勢分析

全部樣本Pfcrt基因目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均被成功測序，測序結(jié)果與惡性瘧原蟲3D7株P(guān)fcrt基因（PF3D7_0709000）的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對．Pfcrt基因第72、74～76位基因型中，全部樣本第72位點(diǎn)均未發(fā)生突變，第74～76位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變．其中野生型為CVMNK，純合突變單倍型全部為CVIET（突變位點(diǎn)用下劃線表示，下同），混合突變型全部為CVM/IN/EK/T（圖2C）．總突變率由2011～2012年的45.15%（93/206）到2022年的9.77%（13/133），2013～2014年和2021年有略微起伏，但整體呈現(xiàn)明顯的下降趨勢（圖3C）．并且純合突變單倍型CVIET的突變率在2022年已降低到1.50%（2/133）（表3），突變體種群隨著時(shí)間的推移而減少，野生種群在增加（圖3D和圖3E），這可能是由于自1999年以來停止使用CQ有關(guān)，也進(jìn)一步說明赤道幾內(nèi)亞比奧科島的野生寄生蟲種群的自然選擇正逐步恢復(fù)．

2.5 Pfmdr1和Pfcrt基因單倍型連鎖不平衡（LD）分析

所有樣本的惡性瘧原蟲分離株P(guān)fmdr1和Pfcrt基因SNP進(jìn)行LD分析．如圖4所示，Pfcrt基因的四個(gè)SNP位點(diǎn)：C72S、M74I、N75E和K76T，高度連鎖并形成一個(gè)haplotype block區(qū)（Block1），D’值均為1.0（[Plt;0.05]），說明四個(gè)SNP位點(diǎn)之間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)．并且Pfmdr1基因的N86Y和Y184F也呈顯著相關(guān)，D’值為0.76．此外Pfmdr1基因N86Y與Pfcrt基因的四個(gè)SNP位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性較弱，而Pfmdr1基因Y184F與Pfcrt基因的四個(gè)SNP位點(diǎn)之間不存在關(guān)聯(lián)．

3 討論

在非洲赤道幾內(nèi)亞，瘧疾是一項(xiàng)主要的健康問題，惡性瘧原蟲耐藥性的出現(xiàn)一直威脅著瘧疾控制和消除工作［1］．因此正確的選擇ACTs的伴侶藥物并監(jiān)測抗藥分子標(biāo)志物對評估抗瘧療效具有重要意義［13］．本文利用2011-2022年非洲赤道幾內(nèi)亞比奧科島惡性瘧患者血液樣本的基因組DNA，研究惡性瘧原蟲耐藥基因Pfmdr1和Pfcrt的相關(guān)突變熱點(diǎn)的情況，發(fā)現(xiàn)Pfmdr1和Pfcrt基因均有不同程度的突變．

Pfmdr1基因86Y和184F的總突變率存在差異，86Y總突變率下降明顯，184F總突變率在2022年達(dá)71.43%（95/133），下降幅度小，184F仍高頻存在于赤道幾內(nèi)亞比奧科島上．有研究表明，這與ACTs的一線治療策略有關(guān)［14］．與推薦ASAQ或AL/ASAQ作為一線治療方案的國家相比，采用AL為一線治療方案的國家Pfmdr1基因86Y突變率的下降速度明顯更快［14］．此外，在Pfmdr1基因被檢測出的9種基因型中，純合突變單倍型NF和混合突變型N Y/F的突變率均呈上升趨勢，這與非洲其他地區(qū)的研究結(jié)果相似［15-16］，其中有研究表明NF對苯勿醇（lumefantrine）敏感性有所降低［15］．其次，Pfmdr1基因86Y和Pfcrt基因76T的突變趨勢十分相似，并且N86Y還與CQ抗性相關(guān)，被認(rèn)為是僅此于Pfcrt基因K76T的重要抗性突變位點(diǎn)［17］．值得注意的是，所有年份都在第102位點(diǎn)頻繁出現(xiàn)一個(gè)同義突變，同樣，由非洲輸入性瘧疾的研究也有相同的發(fā)現(xiàn)，并且還檢測出更多的同義突變和非同義突變［11］．接下來需要對更多的分離株進(jìn)行特征分析，監(jiān)測這個(gè)同義突變是否會變成非同義突變，并且還需監(jiān)測其他的突變情況，這對ACTs耐藥具有臨床意義．

Pfmdr1基因之所以會引起關(guān)注，是因?yàn)槠渲蠳86Y、Y184F等多態(tài)位點(diǎn)與幾種抗瘧藥物的敏感性改變有關(guān)［18-20］．有研究表明，青蒿素衍生物阿莫地喹（amodiaquine）對Pfmdr1基因86Y和Y184產(chǎn)生了定向選擇作用，而AL和甲氟喹（mefloquine）對N86和184F產(chǎn)生了反向選擇作用［19-22］．有趣的是，以往的研究表明，Pfmdr1基因86Y對雙氫青蒿素（dihydroartemisinin）的敏感性存在地理差異［22-24］．

在Pfcrt基因第72、74-76位點(diǎn)中只檢測出一種突變單倍型（CVIET），說明赤道幾內(nèi)亞比奧科島上的突變型寄生蟲以CVIET為主，這與赤道幾內(nèi)亞其他研究結(jié)果一致［9，13］．Pfcrt基因的4個(gè)突變位點(diǎn)C72S、S72C、M74I和N75E已被多項(xiàng)研究證實(shí)與氯喹抗藥有關(guān)［17，25-26］，其中導(dǎo)致全球CQ耐藥的基因型（CVIET和SVMNT）是由野生型CVMNK進(jìn)化而來［17］．近年來的一些研究顯示與阿莫地喹耐藥有關(guān)的SVMNT單倍型在西非地區(qū)存在缺失［16，27-28］，但也有研究在喀麥隆發(fā)現(xiàn)了一例SVMNT單倍型［16］．此外，非洲大部分地區(qū)仍高頻存在CVIET單倍型，例如剛果［21，29］、尼日利亞［27，30］等國家．不僅如此，隨著ACTs的引入，CVIET演化出多種單倍型，2018-2019年剛果地區(qū)檢測出CVIKT、CVINT、CVMNT等單倍型［29］．

在本研究中，CVIET突變率隨著時(shí)間的增長呈現(xiàn)下降趨勢，與CQ抗性相關(guān)的K76T總突變率在2022年達(dá)9.77%（13/133），低于全球的突變率（41.5%）［4］；野生型CVMNK在2022年占比90.23%（120/133）．說明惡性瘧原蟲對CQ的抗性下降，并且野生寄生蟲種群的數(shù)量超過了突變寄生蟲種群，這與Pedro Berzosa等人在1999-2019年研究赤道幾內(nèi)亞耐藥基因型研究結(jié)果一致［5］，表明自從1999年CQ退出后對于恢復(fù)野生型寄生蟲的自然選擇是有效的．但是CQ敏感性恢復(fù)在不同地區(qū)并不相似，鄰國喀麥隆在2020年CVIET流行率仍是占比較高［26］，這與CQ停止使用的時(shí)間以及后續(xù)用藥治療的策略有關(guān)．

值得注意的是，在2020年赤道幾內(nèi)亞將一線抗瘧藥物ASAQ更換成AL后，野生型CVMNK占比從2020年的95.05%（96/101）下降到2021年的78.64%（81/103），同樣，在許多研究結(jié)果中也表明野生型K76位點(diǎn)的選擇與AL治療的壓力有關(guān)［5，31］．正如Pedro Berzosa［5］、Achieng［32］等人所提出的，隨著時(shí)間的推移，由于CQ的停藥時(shí)間延長以及AL的治療范圍擴(kuò)大，預(yù)計(jì)Pfcrt基因K76和Pfmdr1基因N86的增長比例會更大．因此，在至少2年的時(shí)間里，重新審視惡性瘧原蟲Pfmdr1和Pfcrt基因的突變譜，監(jiān)測二者在AL的治療下的變化情況，這是非常有意義的．

盡管，Pfmdr1和Pfcrt基因在不同的染色體上，但LD分析的結(jié)果顯示，Pfmdr1基因N86Y與Pfcrt基因的4個(gè)突變位點(diǎn)是有關(guān)聯(lián)的．Pfcrt基因的4個(gè)突變位點(diǎn)形成獨(dú)立的LD塊（D’值均為1，P＜0.05），Pfmdr1基因的N86Y和Y184F呈顯著相關(guān)，這些結(jié)果表明，Pfmdr1和Pfcrt基因的突變具有相對獨(dú)立性．當(dāng)然，本研究也存在一定的不足之處，包括LD分析所針對的SNP較少．因此，下一步應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測范圍，需要針對Pfmdr1和Pfcrt基因其他相關(guān)的突變位點(diǎn)進(jìn)行特征分析，確定這些抗藥分子標(biāo)志物的流行情況可以用于評估赤道幾內(nèi)亞瘧疾傳播程度和預(yù)防性治療對瘧疾控制的影響．

4 結(jié)論

總之，本研究結(jié)果表明2011～2022年赤道幾內(nèi)亞比奧科島惡性瘧原蟲耐藥基因Pfmdr1和Pfcrt相關(guān)突變位點(diǎn)均存在不同程度突變，并且隨著赤道幾內(nèi)亞對抗瘧治療策略的改變，Pfmdr1和Pfcrt基因的總突變率均呈現(xiàn)下降趨勢．本研究的數(shù)據(jù)可用于評估現(xiàn)有抗瘧藥物在赤道幾內(nèi)亞的敏感性恢復(fù)程度，從而有助于及時(shí)調(diào)整抗瘧藥使用方案，推進(jìn)該地區(qū)消除瘧疾的進(jìn)程．

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Ten-year Trend Analysis of Drug-Resistant Molecular

Markers Pfmdr1 and Pfcrt in Isolates of

Plasmodium falciparum in Equatorial Guinea

WEI Si-qi1，HUANG Jia-tong1，LIN Li-yun1，LIU Ya-qun1，ZHENG Yu-zhong1，

LUO Qiu-lan1，WANG Heng2，WANG Xian-yao3，LIN Min1*

（1. College of Life Sciences and Food Engineering， Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong，521041; 2. Department of Pediatrics，Chenghai People’s Hospital，Shantou，Guangdong，515800;

3. Department of Pediatrics，Shantou Central Hospital，Shantou，Guangdong，515031）

Abstract：With the aim of probing into the genotype and trend of mutations in the multidrug resistance protein 1（Pfmdr1）gene and chloroquine resistance transporter（Pfcrt）gene of Plasmodium falciparum in Equatorial Guinea，blood samples from patients with Plasmodium falciparum infections were collected between 2011 and 2022 in Equatorial Guinea，Africa，and genomic DNA was extracted. The Pfmdr1 and Pfcrt genes were amplified using a nested PCR assay，and the amplification products were sequenced with Sanger sequencing. DNA sequences were aligned to determine the presence of gene mutations with Snapgene 6.0.2 software，and linkage disequilibrium（LD）test was performed for gene mutation sites using Haploview 4.2 software. The results suggested that the proportion of mutations in the drug-resistant genes Pfmdr1 and Pfctr of Plasmodium falciparum in Equatorial Guinea decreased，and the population of wild-type parasites outnumbered the mutant population. This indicates that it is effective to withdraw the use of chloroquine（CQ）and use artesunate-amodiaquine（ASAQ）as a first-line treatment in Equatorial Guinea.

Key words：Plasmodium falciparum；malaria；Pfmdr1 gene；Pfcrt gene；Equatorial Guinea；drug resistance

責(zé)任編輯 周春娟