摘要：為了明確陜南地區(qū)自交系油菜材料間的親緣關(guān)系，為油菜自交系材料的合理利用、優(yōu)良雜交親本選配、提高油菜育種效率提供理論依據(jù)，以72份高油油菜自交系材料為試驗(yàn)材料，運(yùn)用筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選的28條多態(tài)性高、條帶清晰的SCoT引物，進(jìn)行遺傳多樣性分析。采用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA法構(gòu)建聚類圖，用Structure軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，28條SCoT引物共擴(kuò)增出327條條帶，其中多態(tài)性條帶為289條，多態(tài)性條帶占比為88.38%，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.70～0.94，平均為0.85。Structure群體結(jié)構(gòu)分析與UPGMA聚類結(jié)果的一致性較高，說明SCoT標(biāo)記能有效揭示油菜材料間的親緣關(guān)系。72份油菜自交系材料在遺傳相似系數(shù)0.64處被分為3類，遺傳相似系數(shù)主要分布在0.62～0.78之間，占86.85%。表明供試油菜材料間親緣關(guān)系較近，應(yīng)進(jìn)一步發(fā)掘新的自交系材料，豐富現(xiàn)有油菜材料的遺傳多樣性，為油菜雜交育種提供優(yōu)良的遺傳資源。

關(guān)鍵詞：油菜；SCoT標(biāo)記；遺傳多樣性；自交系；高油油菜

中圖分類號(hào)：S634.303.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）21-0109-07

收稿日期：2024-09-24

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：2023-YBNY-070）；陜西理工大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：SLGRCQD2115）。

作者簡介：張曉娟（1982—），女，陜西咸陽人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事油菜分子遺傳研究。E-mail：zxj12162001@163.com。

油菜是我國第一大油料作物，也是國產(chǎn)植物油的最大油源。提升油菜產(chǎn)量對(duì)我國食用油供給、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及國民經(jīng)濟(jì)具有重要意義。利用雜種優(yōu)勢(shì)可以有效提升油菜產(chǎn)量。油菜雜交育種實(shí)踐表明，雙親間適宜的遺傳差異有助于提高雜交后代的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性。因此，明確油菜自交系材料的遺傳背景，分析材料間的遺傳差異及親緣關(guān)系，科學(xué)地進(jìn)行油菜雜交親本的選配，有助于優(yōu)異油菜自交系材料的挖掘及合理利用^［1］，對(duì)于油菜雜交育種具有重要意義。由于國內(nèi)各育種單位間材料的頻繁交流，導(dǎo)致油菜材料的系譜關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，傳統(tǒng)分類方式難以準(zhǔn)確區(qū)分育種材料。DNA分子標(biāo)記為油菜種質(zhì)資源的遺傳背景和多樣性分析提供了有利工具。DNA分子標(biāo)記是根據(jù)不同個(gè)體遺傳物質(zhì)DNA序列多態(tài)性開發(fā)的遺傳標(biāo)記，能準(zhǔn)確反映不同個(gè)體的遺傳差異，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定、快速等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于遺傳基礎(chǔ)分析、基因定位與克隆、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定及遺傳育種等研究^［2］。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記，即SCoT（start codon targeted polymorphism）標(biāo)記是由Collard等開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)^［3］。該標(biāo)記屬于目的基因分子標(biāo)記，根據(jù)基因起始序列的保守性設(shè)計(jì)引物對(duì)2個(gè)基因間的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其原理是基因翻譯的起始區(qū)都有7個(gè)固定不變的核苷酸，即起始密碼子ATG（+1、+2、+3）以及接下來+4位的G，+7位的A，+8、+9位的2個(gè)C；其余位置為填充序列，體現(xiàn)了不同個(gè)體的多態(tài)性。與SSR等二代DNA分子標(biāo)記相比^［4］，該標(biāo)記的多態(tài)性更高。此外，SCoT標(biāo)記還具有穩(wěn)定性好、引物通用性高等優(yōu)點(diǎn)。

目前，SCoT分子標(biāo)記已成功應(yīng)用于多種植物，如茶樹^［5］、獼猴桃^［6］、梔子^［7］、龍眼^［8］、枸杞^［9］、月季^［10］等的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系、基因作圖及遺傳多樣性研究^［11］。張羽等對(duì)油菜資源遺傳分析的結(jié)果表明，SCoT標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)量高于SRAP標(biāo)記和SSR標(biāo)記^［12］；SCoT標(biāo)記的聚類結(jié)果和SRAP標(biāo)記近似，SCoT標(biāo)記的多態(tài)性高于SRAP標(biāo)記，且SCoT標(biāo)記比SRAP標(biāo)記更能準(zhǔn)確反映材料的親緣關(guān)系^［13］。

陜南地區(qū)是陜西省油菜高產(chǎn)及優(yōu)生區(qū)，其油菜種植面積約占陜西省油菜種植總面積的一半。該地區(qū)油菜種質(zhì)資源的鑒定分析以及油菜新品種的選育對(duì)于陜西省油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分重要。本研究以漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（即漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心）選育的72份油菜高油自交系材料為研究對(duì)象，利用28條多態(tài)性良好的SCoT引物，進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為油菜雜交育種、自交系材料的利用及優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

72份油菜高油自交系材料由漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，材料于2022年9月種植于漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)田（33°09′30.38″N，106°58′53.95″E），分小區(qū)種植，行長為2 m，行寬為40 cm，株距為15 cm。供試材料基本信息見表1。

主要試劑：2×Taq Master Mix（Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）、40% Arc-Bis、AgNO₃、過硫酸銨、TEMED、NaOH、甲醛、CTAB、Tris、硼酸、EDTA、瓊脂糖等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改良的CTAB法提取油菜基因組DNA

2023年3月30日采集供試油菜材料幼嫩葉片，-80 ℃ 保存。通過改良CTAB法提取油菜基因組DNA^［14］，分別使用0.8%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的完整性和濃度。

1.2.2 SCoT引物擴(kuò)增

利用28條SCoT引物對(duì)供試72份油菜自交系材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SCoT引物序列見表2。

PCR反應(yīng)總體系10 μL：2×Taq Master Mix 5 μL，10 μmol/L的引物1 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，ddH₂O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增采用復(fù)性變溫法，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 電泳及染色

SCoT引物擴(kuò)增產(chǎn)物分離采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將凝膠下角切去少許以標(biāo)記方向，置于硝酸銀染色液中搖床染色8 min，蒸餾水漂洗3次，加入顯色液搖床顯色至有清晰條帶，倒去顯色液后拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)SCoT標(biāo)記電泳圖譜中的清晰、可重復(fù)條帶。圖譜中每條引物擴(kuò)增的每個(gè)位點(diǎn)，有帶標(biāo)記為“1”，無帶標(biāo)記為“0”，建立數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)矩陣計(jì)算簡單匹配系數(shù)（SMC），SMC=a/（n-d），其中a是2個(gè)種質(zhì)之間共有的條帶數(shù)，n是矩陣中的條帶數(shù)，d是2個(gè)種質(zhì)中不存在的條帶數(shù)^［15］。根據(jù)Smith等報(bào)道的方法^［16］計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）值。利用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA算法^［17］繪制樹狀聚類圖，使用Dcenter、Eigen程序進(jìn)行主成分分析（PCA）。運(yùn)用軟件Structure 2.3.4對(duì)72份油菜自交系材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析^［18］，將MCMC（markov chain monte carlo）、Burn-in均設(shè)為10 000次，K=1～10，每個(gè)K值重復(fù)5次，運(yùn)行結(jié)果上傳至Structure Harvester在線網(wǎng)站得到最佳K值。采用Popgene 1.32軟件^［19］對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，計(jì)算等位基因數(shù)（N_a）、有效等位基因數(shù)（N_e）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果

SCoT引物對(duì)供試油菜自交系材料擴(kuò)增的電泳圖譜清晰、結(jié)果穩(wěn)定（圖1）。28條SCoT引物在72份供試油菜自交系材料中共檢測(cè)出327個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶為289條，多態(tài)性條帶占比為88.38%。SCoT引物的PIC值范圍為0.70～0.94，平均為0.85。根據(jù)Botstein等^［20］提出的觀點(diǎn)，當(dāng)PICgt;0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)基因座，表明本試驗(yàn)的SCoT引物多態(tài)性豐富。引物的N_a值在1.33～2.00之間，平均為1.86；N_e值在1.09～1.73之間，平均為1.35；H值在0.13～0.56之間，平均為0.34；I值在0.07～0.40之間，平均為0.22（表3）。遺傳多樣性的相關(guān)指數(shù)可反映基因的多樣性及分化程度^［21］，其中，I值主要反映物種的居群遺傳多樣性的高低，該值越大，則居群遺傳多樣性越高。由此得出，供試油菜自交系材料的遺傳多樣性水平不高。

2.2 材料間遺傳相似系數(shù)分析

SCoT標(biāo)記分析得出，供試的72份油菜自交系材料間遺傳相似系數(shù)介于0.31～0.95之間，平均值為0.68。其中，材料14號(hào)與72號(hào)的遺傳相似系數(shù)最?。?.310），材料25號(hào)與26號(hào)的遺傳相似系數(shù)最大（0.946）。

對(duì)供試材料的兩兩遺傳相似系數(shù)共計(jì) 2 556 個(gè)數(shù)值進(jìn)行次數(shù)分布分析，得出遺傳相似系數(shù)在0.69處分布密度最大（圖2）。遺傳相似系數(shù)≥0.69的有1 436個(gè)（占56.18%），＜0.69的有1 120個(gè)（占43.82%）。遺傳相似系數(shù)主要集中在0.62～0.78之間，占86.85%。

2.3 SCoT標(biāo)記的聚類分析

SCoT標(biāo)記構(gòu)建的聚類圖如圖3所示，在相似系數(shù)為0.64處分為3類。第Ⅰ類為最大的一類，包含69個(gè)材料。第Ⅱ類只含72號(hào)這1個(gè)材料。第Ⅲ類包含2個(gè)材料（13、14）。第Ⅰ類中，具有中雙11背景的材料優(yōu)先聚在一起，如材料51號(hào)與58號(hào)、2號(hào)與3號(hào)、35號(hào)與54號(hào)、44號(hào)與63號(hào)；有共同親本來源的4、20號(hào)材料聚在一起，這2個(gè)材料都來源于浙72、滬16。親緣關(guān)系近的材料在聚類圖中相距較近，說明SCoT標(biāo)記準(zhǔn)確揭示了油菜自交系材料之間的親緣關(guān)系。第Ⅱ類只有72號(hào)材料，該材料為引進(jìn)的抗根腫病材料，在聚類圖中與其他自交系材料得以區(qū)分。聚類結(jié)果顯示，72號(hào)材料與第Ⅰ類材料的親緣關(guān)系較第Ⅲ類材料近。第Ⅲ類中的13、14號(hào)材料，分別為漢中小青菜、白菜型油菜，因與其他自交系油菜遺傳背景較遠(yuǎn)，在聚類圖中單獨(dú)聚為一類。這2個(gè)材料可用于新自交系材料的創(chuàng)制，以提高油菜自交系材料的遺傳差異。

2.4 SCoT標(biāo)記的主成分分析

主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，第1主成分占總變異的9.17%，第2主成分占總變異的6.31%（圖4）。PCA圖中13、14號(hào)材料聚為一類，與其他材料明顯區(qū)分開來，對(duì)應(yīng)于聚類分析中第Ⅲ類。聚類圖第Ⅰ類中的材料在PCA圖中也聚在一起。主成分分析中，聚類圖第Ⅱ類中唯一的72號(hào)材料與聚類圖中第Ⅲ類材料（13、14號(hào)）區(qū)分， 但未能與第Ⅰ類材料區(qū)分，這是由于72號(hào)材料與聚類圖中的第Ⅰ類材料親緣關(guān)系較近導(dǎo)致。主成分分析結(jié)果與NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建的聚類結(jié)果基本一致。

2.5 群體結(jié)構(gòu)分析

當(dāng)K=4時(shí)，ΔK值最大，表明72份油菜材料聚為4類合適（圖5）。 第Ⅰ類包括7份材料， 第Ⅱ類包含20份材料，第Ⅲ類包含43份材料。第Ⅳ類包含2個(gè)材料（13、14號(hào)），這2個(gè)材料在聚類分析中也歸為一類。Structrue分析中，第Ⅰ類（7號(hào)材料除外）對(duì)應(yīng)于聚類分析圖中第Ⅰ類中紅色線條標(biāo)記部分，第Ⅲ類主要對(duì)應(yīng)于聚類圖第Ⅰ類中藍(lán)色線條標(biāo)記部分。綜上所述，Structure群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果一致性較高。

3 討論與結(jié)論

油菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，有助于挖掘優(yōu)異的油菜育種材料，擴(kuò)充現(xiàn)有油菜遺傳背景。分析油菜自交系材料的親緣關(guān)系及遺傳差異，有效利用油菜雜種優(yōu)勢(shì)，具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值。目前，油菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析主要采用SSR、SRAP、RAPD等分子標(biāo)記^［22］。新型分子標(biāo)記——SCoT標(biāo)記是針對(duì)基因的開放閱讀框設(shè)計(jì)的，相對(duì)于主要分布于非編碼區(qū)（包括著絲粒、端粒以及內(nèi)含子、3′UTR等）的SSR標(biāo)記，與表型更為相關(guān)，更容易成為功能標(biāo)記。SCoT分子標(biāo)記為單引物，成本低廉、操作簡便，非常適合種質(zhì)資源的篩選、鑒定和遺傳背景分析等。研究表明，SCoT標(biāo)記在多態(tài)性條帶數(shù)量（NPB）、多態(tài)條帶百分比（PPB）、分辨能力（Rp）、有效多重比率（EMR）、標(biāo)記指數(shù)（MI）方面，較EST-SSR標(biāo)記、SRAP標(biāo)記更具優(yōu)勢(shì)^［23］。

本研究所用28條SCoT引物的平均PIC值為0.85，多態(tài)性信息含量均＞0.5，說明本研究選用的SCoT引物多態(tài)性豐富，可用于油菜遺傳多樣性分析?；谶z傳距離的聚類分析將供試油菜材料分為3類。第Ⅰ類包含材料最多，分析這些材料來源發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ類中很多材料具有中雙11或者其衍生系背景，材料間遺傳基礎(chǔ)較為接近。第Ⅲ類的13、14號(hào)材料分別為漢中小青菜、白菜型油菜，與其他自交系油菜遺傳背景差異較大，因此單獨(dú)聚為一類。在油菜雜交育種中，應(yīng)避免在同一類親緣關(guān)系較近的材料中挑選父母本。雜交親本應(yīng)選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2個(gè)材料。例如，可選擇第Ⅲ類中的材料與第Ⅰ類中的材料進(jìn)行雜交。此外，為避免油菜骨干親本反復(fù)多次利用而導(dǎo)致的油菜育種資源遺傳背景變窄，可適當(dāng)引入與現(xiàn)有育種材料遺傳背景差異大的油菜材料，將其作為親本，通過雜交，豐富后代的遺傳背景。本研究中，主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果符合度較好，說明NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建的聚類結(jié)果能有效反映材料間的親緣關(guān)系，可為油菜育種實(shí)踐提供理論參考。

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