摘要:為了明確陜南地區(qū)自交系油菜材料間的親緣關(guān)系,為油菜自交系材料的合理利用、優(yōu)良雜交親本選配、提高油菜育種效率提供理論依據(jù),以72份高油油菜自交系材料為試驗(yàn)材料,運(yùn)用筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選的28條多態(tài)性高、條帶清晰的SCoT引物,進(jìn)行遺傳多樣性分析。采用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA法構(gòu)建聚類圖,用Structure軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示,28條SCoT引物共擴(kuò)增出327條條帶,其中多態(tài)性條帶為289條,多態(tài)性條帶占比為88.38%,多態(tài)性信息含量(PIC)為0.70~0.94,平均為0.85。Structure群體結(jié)構(gòu)分析與UPGMA聚類結(jié)果的一致性較高,說明SCoT標(biāo)記能有效揭示油菜材料間的親緣關(guān)系。72份油菜自交系材料在遺傳相似系數(shù)0.64處被分為3類,遺傳相似系數(shù)主要分布在0.62~0.78之間,占86.85%。表明供試油菜材料間親緣關(guān)系較近,應(yīng)進(jìn)一步發(fā)掘新的自交系材料,豐富現(xiàn)有油菜材料的遺傳多樣性,為油菜雜交育種提供優(yōu)良的遺傳資源。
關(guān)鍵詞:油菜;SCoT標(biāo)記;遺傳多樣性;自交系;高油油菜
中圖分類號(hào):S634.303.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2024)21-0109-07
收稿日期:2024-09-24
基金項(xiàng)目:陜西省科技廳項(xiàng)目(編號(hào):2023-YBNY-070);陜西理工大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):SLGRCQD2115)。
作者簡介:張曉娟(1982—),女,陜西咸陽人,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事油菜分子遺傳研究。E-mail:zxj12162001@163.com。
油菜是我國第一大油料作物,也是國產(chǎn)植物油的最大油源。提升油菜產(chǎn)量對(duì)我國食用油供給、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及國民經(jīng)濟(jì)具有重要意義。利用雜種優(yōu)勢(shì)可以有效提升油菜產(chǎn)量。油菜雜交育種實(shí)踐表明,雙親間適宜的遺傳差異有助于提高雜交后代的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性。因此,明確油菜自交系材料的遺傳背景,分析材料間的遺傳差異及親緣關(guān)系,科學(xué)地進(jìn)行油菜雜交親本的選配,有助于優(yōu)異油菜自交系材料的挖掘及合理利用[1],對(duì)于油菜雜交育種具有重要意義。由于國內(nèi)各育種單位間材料的頻繁交流,導(dǎo)致油菜材料的系譜關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,傳統(tǒng)分類方式難以準(zhǔn)確區(qū)分育種材料。DNA分子標(biāo)記為油菜種質(zhì)資源的遺傳背景和多樣性分析提供了有利工具。DNA分子標(biāo)記是根據(jù)不同個(gè)體遺傳物質(zhì)DNA序列多態(tài)性開發(fā)的遺傳標(biāo)記,能準(zhǔn)確反映不同個(gè)體的遺傳差異,具有多態(tài)性高、穩(wěn)定、快速等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于遺傳基礎(chǔ)分析、基因定位與克隆、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定及遺傳育種等研究[2]。
目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記,即SCoT(start codon targeted polymorphism)標(biāo)記是由Collard等開發(fā)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]。該標(biāo)記屬于目的基因分子標(biāo)記,根據(jù)基因起始序列的保守性設(shè)計(jì)引物對(duì)2個(gè)基因間的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其原理是基因翻譯的起始區(qū)都有7個(gè)固定不變的核苷酸,即起始密碼子ATG(+1、+2、+3)以及接下來+4位的G,+7位的A,+8、+9位的2個(gè)C;其余位置為填充序列,體現(xiàn)了不同個(gè)體的多態(tài)性。與SSR等二代DNA分子標(biāo)記相比[4],該標(biāo)記的多態(tài)性更高。此外,SCoT標(biāo)記還具有穩(wěn)定性好、引物通用性高等優(yōu)點(diǎn)。
目前,SCoT分子標(biāo)記已成功應(yīng)用于多種植物,如茶樹[5]、獼猴桃[6]、梔子[7]、龍眼[8]、枸杞[9]、月季[10]等的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系、基因作圖及遺傳多樣性研究[11]。張羽等對(duì)油菜資源遺傳分析的結(jié)果表明,SCoT標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性條帶數(shù)量高于SRAP標(biāo)記和SSR標(biāo)記[12];SCoT標(biāo)記的聚類結(jié)果和SRAP標(biāo)記近似,SCoT標(biāo)記的多態(tài)性高于SRAP標(biāo)記,且SCoT標(biāo)記比SRAP標(biāo)記更能準(zhǔn)確反映材料的親緣關(guān)系[13]。
陜南地區(qū)是陜西省油菜高產(chǎn)及優(yōu)生區(qū),其油菜種植面積約占陜西省油菜種植總面積的一半。該地區(qū)油菜種質(zhì)資源的鑒定分析以及油菜新品種的選育對(duì)于陜西省油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分重要。本研究以漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(即漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心)選育的72份油菜高油自交系材料為研究對(duì)象,利用28條多態(tài)性良好的SCoT引物,進(jìn)行遺傳多樣性分析,旨在為油菜雜交育種、自交系材料的利用及優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料及試劑
72份油菜高油自交系材料由漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供,材料于2022年9月種植于漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)田(33°09′30.38″N,106°58′53.95″E),分小區(qū)種植,行長為2 m,行寬為40 cm,株距為15 cm。供試材料基本信息見表1。
主要試劑:2×Taq Master Mix(Dye)(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、40% Arc-Bis、AgNO3、過硫酸銨、TEMED、NaOH、甲醛、CTAB、Tris、硼酸、EDTA、瓊脂糖等。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 改良的CTAB法提取油菜基因組DNA
2023年3月30日采集供試油菜材料幼嫩葉片,-80 ℃ 保存。通過改良CTAB法提取油菜基因組DNA[14],分別使用0.8%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的完整性和濃度。
1.2.2 SCoT引物擴(kuò)增
利用28條SCoT引物對(duì)供試72份油菜自交系材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SCoT引物序列見表2。
PCR反應(yīng)總體系10 μL:2×Taq Master Mix 5 μL,10 μmol/L的引物1 μL,100 ng/μL DNA模板1 μL,ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增采用復(fù)性變溫法,程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,50 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min,10個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。
1.2.3 電泳及染色
SCoT引物擴(kuò)增產(chǎn)物分離采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將凝膠下角切去少許以標(biāo)記方向,置于硝酸銀染色液中搖床染色8 min,蒸餾水漂洗3次,加入顯色液搖床顯色至有清晰條帶,倒去顯色液后拍照。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
統(tǒng)計(jì)SCoT標(biāo)記電泳圖譜中的清晰、可重復(fù)條帶。圖譜中每條引物擴(kuò)增的每個(gè)位點(diǎn),有帶標(biāo)記為“1”,無帶標(biāo)記為“0”,建立數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)矩陣計(jì)算簡單匹配系數(shù)(SMC),SMC=a/(n-d),其中a是2個(gè)種質(zhì)之間共有的條帶數(shù),n是矩陣中的條帶數(shù),d是2個(gè)種質(zhì)中不存在的條帶數(shù)[15]。根據(jù)Smith等報(bào)道的方法[16]計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)值。利用NTSYS-pc2.10e軟件中的UPGMA算法[17]繪制樹狀聚類圖,使用Dcenter、Eigen程序進(jìn)行主成分分析(PCA)。運(yùn)用軟件Structure 2.3.4對(duì)72份油菜自交系材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析[18],將MCMC(markov chain monte carlo)、Burn-in均設(shè)為10 000次,K=1~10,每個(gè)K值重復(fù)5次,運(yùn)行結(jié)果上傳至Structure Harvester在線網(wǎng)站得到最佳K值。采用Popgene 1.32軟件[19]對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析,計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。
2 結(jié)果與分析
2.1 SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果
SCoT引物對(duì)供試油菜自交系材料擴(kuò)增的電泳圖譜清晰、結(jié)果穩(wěn)定(圖1)。28條SCoT引物在72份供試油菜自交系材料中共檢測(cè)出327個(gè)條帶,其中多態(tài)性條帶為289條,多態(tài)性條帶占比為88.38%。SCoT引物的PIC值范圍為0.70~0.94,平均為0.85。根據(jù)Botstein等[20]提出的觀點(diǎn),當(dāng)PICgt;0.5時(shí),該基因座為高度多態(tài)基因座,表明本試驗(yàn)的SCoT引物多態(tài)性豐富。引物的Na值在1.33~2.00之間,平均為1.86;Ne值在1.09~1.73之間,平均為1.35;H值在0.13~0.56之間,平均為0.34;I值在0.07~0.40之間,平均為0.22(表3)。遺傳多樣性的相關(guān)指數(shù)可反映基因的多樣性及分化程度[21],其中,I值主要反映物種的居群遺傳多樣性的高低,該值越大,則居群遺傳多樣性越高。由此得出,供試油菜自交系材料的遺傳多樣性水平不高。
2.2 材料間遺傳相似系數(shù)分析
SCoT標(biāo)記分析得出,供試的72份油菜自交系材料間遺傳相似系數(shù)介于0.31~0.95之間,平均值為0.68。其中,材料14號(hào)與72號(hào)的遺傳相似系數(shù)最?。?.310),材料25號(hào)與26號(hào)的遺傳相似系數(shù)最大(0.946)。
對(duì)供試材料的兩兩遺傳相似系數(shù)共計(jì) 2 556 個(gè)數(shù)值進(jìn)行次數(shù)分布分析,得出遺傳相似系數(shù)在0.69處分布密度最大(圖2)。遺傳相似系數(shù)≥0.69的有1 436個(gè)(占56.18%),<0.69的有1 120個(gè)(占43.82%)。遺傳相似系數(shù)主要集中在0.62~0.78之間,占86.85%。
2.3 SCoT標(biāo)記的聚類分析
SCoT標(biāo)記構(gòu)建的聚類圖如圖3所示,在相似系數(shù)為0.64處分為3類。第Ⅰ類為最大的一類,包含69個(gè)材料。第Ⅱ類只含72號(hào)這1個(gè)材料。第Ⅲ類包含2個(gè)材料(13、14)。第Ⅰ類中,具有中雙11背景的材料優(yōu)先聚在一起,如材料51號(hào)與58號(hào)、2號(hào)與3號(hào)、35號(hào)與54號(hào)、44號(hào)與63號(hào);有共同親本來源的4、20號(hào)材料聚在一起,這2個(gè)材料都來源于浙72、滬16。親緣關(guān)系近的材料在聚類圖中相距較近,說明SCoT標(biāo)記準(zhǔn)確揭示了油菜自交系材料之間的親緣關(guān)系。第Ⅱ類只有72號(hào)材料,該材料為引進(jìn)的抗根腫病材料,在聚類圖中與其他自交系材料得以區(qū)分。聚類結(jié)果顯示,72號(hào)材料與第Ⅰ類材料的親緣關(guān)系較第Ⅲ類材料近。第Ⅲ類中的13、14號(hào)材料,分別為漢中小青菜、白菜型油菜,因與其他自交系油菜遺傳背景較遠(yuǎn),在聚類圖中單獨(dú)聚為一類。這2個(gè)材料可用于新自交系材料的創(chuàng)制,以提高油菜自交系材料的遺傳差異。
2.4 SCoT標(biāo)記的主成分分析
主成分分析(PCA)結(jié)果顯示,第1主成分占總變異的9.17%,第2主成分占總變異的6.31%(圖4)。PCA圖中13、14號(hào)材料聚為一類,與其他材料明顯區(qū)分開來,對(duì)應(yīng)于聚類分析中第Ⅲ類。聚類圖第Ⅰ類中的材料在PCA圖中也聚在一起。主成分分析中,聚類圖第Ⅱ類中唯一的72號(hào)材料與聚類圖中第Ⅲ類材料(13、14號(hào))區(qū)分, 但未能與第Ⅰ類材料區(qū)分,這是由于72號(hào)材料與聚類圖中的第Ⅰ類材料親緣關(guān)系較近導(dǎo)致。主成分分析結(jié)果與NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建的聚類結(jié)果基本一致。
2.5 群體結(jié)構(gòu)分析
當(dāng)K=4時(shí),ΔK值最大,表明72份油菜材料聚為4類合適(圖5)。 第Ⅰ類包括7份材料, 第Ⅱ類包含20份材料,第Ⅲ類包含43份材料。第Ⅳ類包含2個(gè)材料(13、14號(hào)),這2個(gè)材料在聚類分析中也歸為一類。Structrue分析中,第Ⅰ類(7號(hào)材料除外)對(duì)應(yīng)于聚類分析圖中第Ⅰ類中紅色線條標(biāo)記部分,第Ⅲ類主要對(duì)應(yīng)于聚類圖第Ⅰ類中藍(lán)色線條標(biāo)記部分。綜上所述,Structure群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果一致性較高。
3 討論與結(jié)論
油菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析,有助于挖掘優(yōu)異的油菜育種材料,擴(kuò)充現(xiàn)有油菜遺傳背景。分析油菜自交系材料的親緣關(guān)系及遺傳差異,有效利用油菜雜種優(yōu)勢(shì),具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值。目前,油菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析主要采用SSR、SRAP、RAPD等分子標(biāo)記[22]。新型分子標(biāo)記——SCoT標(biāo)記是針對(duì)基因的開放閱讀框設(shè)計(jì)的,相對(duì)于主要分布于非編碼區(qū)(包括著絲粒、端粒以及內(nèi)含子、3′UTR等)的SSR標(biāo)記,與表型更為相關(guān),更容易成為功能標(biāo)記。SCoT分子標(biāo)記為單引物,成本低廉、操作簡便,非常適合種質(zhì)資源的篩選、鑒定和遺傳背景分析等。研究表明,SCoT標(biāo)記在多態(tài)性條帶數(shù)量(NPB)、多態(tài)條帶百分比(PPB)、分辨能力(Rp)、有效多重比率(EMR)、標(biāo)記指數(shù)(MI)方面,較EST-SSR標(biāo)記、SRAP標(biāo)記更具優(yōu)勢(shì)[23]。
本研究所用28條SCoT引物的平均PIC值為0.85,多態(tài)性信息含量均>0.5,說明本研究選用的SCoT引物多態(tài)性豐富,可用于油菜遺傳多樣性分析?;谶z傳距離的聚類分析將供試油菜材料分為3類。第Ⅰ類包含材料最多,分析這些材料來源發(fā)現(xiàn),第Ⅰ類中很多材料具有中雙11或者其衍生系背景,材料間遺傳基礎(chǔ)較為接近。第Ⅲ類的13、14號(hào)材料分別為漢中小青菜、白菜型油菜,與其他自交系油菜遺傳背景差異較大,因此單獨(dú)聚為一類。在油菜雜交育種中,應(yīng)避免在同一類親緣關(guān)系較近的材料中挑選父母本。雜交親本應(yīng)選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2個(gè)材料。例如,可選擇第Ⅲ類中的材料與第Ⅰ類中的材料進(jìn)行雜交。此外,為避免油菜骨干親本反復(fù)多次利用而導(dǎo)致的油菜育種資源遺傳背景變窄,可適當(dāng)引入與現(xiàn)有育種材料遺傳背景差異大的油菜材料,將其作為親本,通過雜交,豐富后代的遺傳背景。本研究中,主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果符合度較好,說明NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建的聚類結(jié)果能有效反映材料間的親緣關(guān)系,可為油菜育種實(shí)踐提供理論參考。
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