摘要：研究采用藥效基團(tuán)融合策略，設(shè)計(jì)合成了25個(gè)α， β-不飽和羧酸芐酯化合物，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了其對(duì)6種植物病原真菌的抑菌活性，并對(duì)抑菌活性較強(qiáng)的化合物進(jìn)行了小麥幼苗安全性試驗(yàn)。結(jié)果表明：大多數(shù)化合物對(duì)供試真菌表現(xiàn)出較高的抑制率，化合物B9和B16對(duì)所有供試真菌的抑制率都大于80%，B2對(duì)5種供試真菌的抑制率大于80%。選取抑菌活性較強(qiáng)的化合物B9進(jìn)行小麥幼苗安全性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)B9對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，總體表現(xiàn)出較高的安全性。構(gòu)效分析表明，苯環(huán)上引入鹵素原子有利于提高化合物的抑菌活性。

關(guān)鍵詞：α， β-不飽和羧酸芐酯；植物病原真菌；抑菌活性；構(gòu)效關(guān)系；芐酯

中圖分類號(hào)：O621.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）12-0072-05

Synthesis and Antifungal Activity of α，β-Unsaturated Benzyl Carboxylates

SHA Yun-ying1，YANG Shan-shan1，YAN Wei-ting1，ZHANG Zhuo-zhou1，WANG Li-zhong1，

ZHAI Zi-jun1，LIU Zhu-yun1，2

（1. School of Intelligent Pharmacy and New Chemical Materials， Taizhou Polytechnic College， Taizhou 225300， PRC;

2. School of Pharmaceutical Sciences， Nanjing Tech University， Nanjing 211816， PRC）

Abstract： Twenty-five unsaturated benzyl carboxylates were designed and synthesized according to the principle of active group splicing. The mycelial growth rate was determined to evaluate the inhibition rates of the compounds on 6 species of phytopathogenic fungi. Furthermore， the compound with the strongest antifungal activity was tested for the safe application in wheat seedlings. The results showed that most of the compounds had obvious inhibitory activity on the tested fungi. The inhibition rates of B9 and B16 on all tested fungi were more than 80%， and the inhibition rates of B2 on 5 species of tested fungi were more than 80%. Compound B9 showed no significant effect on the growth of wheat seedlings， demonstrating high safety. The structure-activity relationship analysis showed that the introduction of halogen atoms in the benzene ring was beneficial to improving the antifungal activity of the compounds.

Key words： α，β-unsaturated benzyl carboxylates; phytopathogenic fungi; antifungal activity; structure-activity relationship; benzyl ester

植物病原真菌嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量，是造成作物減產(chǎn)的主要原因之一[1]。據(jù)報(bào)道，超過(guò)19 000

種真菌可引起植物病害，每年給全球經(jīng)濟(jì)造成的損失超過(guò)2 000億美元[2-3]。不僅如此，許多真菌還會(huì)產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物——真菌毒素，危害人類和動(dòng)物的健康[4]。目前，使用化學(xué)殺菌劑是控制真菌病害的有效措施[5]，但是容易污染環(huán)境和影響非目標(biāo)生物，而且過(guò)量使用會(huì)增加植物病原真菌的耐藥性。因此，開(kāi)發(fā)新的植物抗菌劑迫在眉睫[6]。

藥效基團(tuán)融合策略是將兩個(gè)或兩個(gè)以上的活性部位融入單個(gè)分子結(jié)構(gòu)中，以提高其生物活性[7]。天然產(chǎn)物具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和豐富的生物活性，是新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的寶貴資源[8]。α，β-不飽和基團(tuán)廣泛存在于黃酮類、香豆素類和肉桂醛等天然產(chǎn)物中[9]，這些天然產(chǎn)物表現(xiàn)出抗腫瘤、抗炎、抗細(xì)菌和抗真菌等生物活性[10]。α，β-不飽和羰基化合物可作為線粒體毒素[11]，也能夠與酶的巰基或生物靶標(biāo)進(jìn)行Michael加成反應(yīng)，合成靶向共價(jià)抑制劑[12]。此外，擬除蟲(chóng)菊酯類化合物廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和家庭害蟲(chóng)防治，具有殺蟲(chóng)譜廣、效力高、擊倒快和毒性低等特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)中包含的?芐基酯結(jié)構(gòu)片段起到了關(guān)鍵作用。陳棟棟[13]發(fā)現(xiàn)苯環(huán)與酯基之間連有1個(gè)亞甲基，即化合物為芐酯時(shí)，芳香酸脂肪醇類化合物對(duì)兔癢螨具有最高的抑制活性。該研究將α，β-不飽和基團(tuán)與芐基酯結(jié)合，設(shè)計(jì)了一系列α，β-不飽和羧酸芐酯化合物，并探究了其對(duì)6種植物病原真菌的抑制活性，以期為植物抗菌劑的開(kāi)發(fā)提供資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試真菌為西瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporium f. sp. niveum）、馬鈴薯干腐病病原菌茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、番茄早疫病病原菌茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、玉米彎孢病病原菌新月彎孢菌（Curvularia lunata）和蘋(píng)果腐爛病病原菌蘋(píng)果黑腐皮殼菌（Valsa mali）6種常見(jiàn)植物病原真菌，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥中心提供。主要試劑包括丙烯酸、異戊烯酸、惕格酸、氯乙酸芐酯、三苯基膦、山梨酸、取代芐溴/氯、無(wú)水碳酸鉀、石油醚、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和嘧菌酯（≥98%），所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA C-MAG HS 7型磁力攪拌器（德國(guó)IKA集團(tuán)），AVANCE III 400/500 MHz核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司），SGWX-4A型顯微熔點(diǎn)儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司），PRX-4500型智能培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），SW-CJ-1BC型潔凈操作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 目標(biāo)化合物的合成 設(shè)計(jì)合成了A1～A8和B1～B17共25個(gè)不飽和羧酸芐酯化合物，除A3～A5以外，其余化合物均由羧酸鹽與取代芐溴/氯發(fā)生親核取代反應(yīng)制得，總體產(chǎn)率較為理想，且合成條件比較溫和。

1.3.2 化合物A3～A5的合成 采用Wittig反應(yīng)合成A3～A5化合物。鑒于產(chǎn)物為酯類化合物，對(duì)強(qiáng)堿較為敏感，為防止堿性過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致產(chǎn)物水解，采用氟化鉀進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)步驟如下：將9.13 g氯乙酸芐酯溶于300 mL苯中，加入13.1 g三苯基膦攪拌，將反應(yīng)液升溫至80℃回流約24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫并轉(zhuǎn)移至布氏漏斗進(jìn)行抽濾，濾餅經(jīng)乙酸乙酯多次洗滌后，得到中間體。將5.36 g中間體與0.7 g氟化鉀在50 mL環(huán)己烷中超聲混合均勻1 h，將體系加熱至65℃攪拌0.5 h，再緩慢滴加含有10 mmol正丙醛/正丁醛/正戊醛的環(huán)己烷溶液。TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫并緩慢加入50 mL水，所得溶液用乙酸乙酯萃取，所得有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗滌，再經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，將殘余物通過(guò)硅膠柱層析（200～300目）分離純化，即可得到純度較高的目標(biāo)化合物，洗脫劑為V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=30∶1。

1.3.3 其他化合物的合成 化合物A1的合成步驟如下：將0.43 g丙烯酸溶于30 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，0℃下攪拌加入0.83 g碳酸鉀，反應(yīng)20 min后，緩慢滴加含有0.63 g氯化芐的N，N-二甲基甲酰胺溶液，滴加完畢后將反應(yīng)體系自然升至室溫并加熱至70℃。待TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后（約2 h），反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取。所得有機(jī)相經(jīng)飽和食鹽水洗滌，再經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，將殘余物通過(guò)硅膠柱層析（200～300目）分離純化得到目標(biāo)產(chǎn)物，洗脫劑為V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=

30∶1[14]?；衔顰2、A6～A8和B1～B17的合成方法與A1相同，化合物A2和B13由6 mmol巴豆酸、6 mmol碳酸鉀與5 mmol取代芐氯/芐溴反應(yīng)合成，化合物B14由6 mmol山梨酸、6 mmol碳酸鉀與5 mmol取代芐溴反應(yīng)合，其他化合物由6 mmol丙烯酸/異戊烯酸/惕格酸、6 mmol碳酸鉀與5 mmol取代芐氯/芐溴反應(yīng)合成。

1.3.4 抑菌活性測(cè)定 通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法[15]測(cè)定化合物對(duì)供試真菌的體外抑制活性。將待測(cè)化合物溶于5%二甲基亞砜中，將所得溶液與滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基混勻制得帶藥培養(yǎng)基，藥物濃度為60 μg/mL。以5%二甲基亞砜作為空白對(duì)照，相同濃度的嘧菌酯作為陽(yáng)性對(duì)照。將直徑5 mm的菌餅放置于各處理的培養(yǎng)皿中央，每次試驗(yàn)進(jìn)行3次平行重復(fù)，隨后將接種好的培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，根據(jù)公式（1）計(jì)算抑制率。

（1）

式中：dc為空白對(duì)照組菌餅平均直徑（mm），ds為樣品組菌餅平均直徑（mm），d0為菌餅直徑（5 mm）。

1.3.5 幼苗安全性試驗(yàn) 挑選約100粒小麥種子，置于溫度28℃、濕度90%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)好的幼苗待用，此時(shí)小麥幼苗高度約為5 cm。用5%二甲基亞砜將待測(cè)化合物配制成12.5、25、50和100 μg/mL的藥液，選取生長(zhǎng)情況一致的幼苗，用無(wú)菌水洗凈根部，移入不同濃度的供試藥液中，以5%二甲基亞砜為對(duì)照，在20～25℃自然光下培養(yǎng)，分別于3、12、24、48、72和96 h觀察并拍照記錄化合物對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物產(chǎn)率與性狀

合成的25個(gè)化合物的名稱及性狀見(jiàn)表1，其中B11、B12、B14、B15、B16和B17為新化合物。

2.2 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

由表2可知，25個(gè)化合物中，B2、B9和B16表現(xiàn)出較高的抑菌活性，其中B2對(duì)5種供試真菌的抑制率超過(guò)80%，對(duì)小麥赤霉病病原菌的抑制率達(dá)到98.7%；B9對(duì)所有供試真菌的抑制率均超過(guò)80%，對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制率為98.5%（圖1），且對(duì)6種供試真菌的抑制活性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照嘧菌酯；B16對(duì)所有供試真菌的抑制率均大于80%，且對(duì)所有供試真菌的抑制率都高于嘧菌酯。此外，A3、A7、B3、B11、B13、B15和B17這7個(gè)化合物至少對(duì)2個(gè)供試真菌的抑制率高于80%，也表現(xiàn)出較高的抗菌活性。特別地，番茄早疫病病原菌對(duì)應(yīng)的高活性化合物（抑制率≥80%）有11個(gè)，可認(rèn)為是該類化合物的敏感菌株。

2.3 幼苗安全性試驗(yàn)結(jié)果

選取抑菌活性較強(qiáng)的化合物B9進(jìn)行小麥幼苗安全性試驗(yàn)，由圖2可知，與對(duì)照組相比，隨著藥液濃度提高和試驗(yàn)時(shí)間增加，各試驗(yàn)組的幼苗葉片沒(méi)有發(fā)生萎蔫，且幼苗生長(zhǎng)情況與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明B9對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，總體表現(xiàn)出較高的安全性。

3 結(jié)論

采用藥效基團(tuán)融合策略，設(shè)計(jì)合成了25個(gè)α，β-不飽和羧酸芐酯，其中包括6個(gè)新化合物。通過(guò)抑菌活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)B2、B9和B16對(duì)供試病原真菌有較高的抑菌活性，可認(rèn)為這3個(gè)化合物具有較高的抗菌潛力。構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)苯環(huán)上引入鹵素原子可提高化合物的抑菌活性。以上研究結(jié)果證實(shí)了α，β-不飽和羧酸芐酯類化合物具有較強(qiáng)的抑菌活性，此外，新化合物的合成豐富了該類化合物的分子庫(kù)，構(gòu)效關(guān)系研究也為該類化合物后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了基礎(chǔ)，后續(xù)將繼續(xù)探索該類化合物的初步作用機(jī)制及其他生物活性。

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（責(zé)任編輯：王婷）