摘要：為有效解決土壤鉛污染的問題，實(shí)現(xiàn)土壤重金屬污染的高效修復(fù)，通過測定菌株鉛耐受性、拮抗關(guān)系、產(chǎn)IAA能力、AAC脫氫酶活性、產(chǎn)鐵載體和固氮能力從10種根際促生菌株兩兩組合中篩選到MR2-TS8、MR2-ZR1、ZS1-ZR1和TS8-ZR1這4種復(fù)合菌群。以菌群生物量和產(chǎn)IAA能力為指標(biāo)，對其最佳發(fā)酵條件碳源、氮源、pH值和溫度進(jìn)行了探究。結(jié)果表明：復(fù)合菌株最佳碳源為果糖，最佳氮源為牛肉膏，最適pH值為7.2，最適溫度為25℃，為根際促生菌群修復(fù)土壤重金屬污染提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

關(guān)鍵詞：降解鉛；根際促生菌群；菌群篩選；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號：X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）12-0042-07

Screening of Plant Growth Promoting Rhizobacteria for Remediation of Pb-Contaminated Soil and Optimization of Fermentation Conditions

YANG Fan

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： This study aims to effectively solve the lead （Pb） contamination in soil and realize the efficient remediation of heavy metal-contaminated soil. Four strain combinations， namely MR2-TS8， MR2-ZR1， ZS1-ZR1， and TS8-ZR1， were screened from 10 strains of plant growth promoting rhizobacteria based on the Pb tolerance， antagonistic relationship， indole-3-acetic acid （IAA）-producing capacity， AAC dehydrogenase activity， siderophore-producing capacity， and nitrogen-fixing capacity. The fermentation conditions （carbon source， nitrogen source， pH， and temperature） were optimized with the biomass and IAA production capacity of strain combinations as indicators. The results showed that the optimal fermentation conditions were fructose as the carbon source， beef extract as the nitrogen source， pH 7.2， and 25 °C. This study provides a theoretical basis and practical reference for the remediation of heavy metal-contaminated soil by plant growth promoting rhizobacteria.

Key words： Pb degradation; plant growth promoting rhizobacteria; flora screening; optimization of fermentation conditions

隨著工業(yè)化和城市化的發(fā)展，土壤重金屬污染已成為嚴(yán)重影響人類健康和生態(tài)環(huán)境的重大問題[1-4]。

植物修復(fù)是當(dāng)今土壤重金屬污染修復(fù)的常用方法，涉及利用植物和根際微生物清除有機(jī)污染物和重金屬污染物，是現(xiàn)在土壤重金屬污染修復(fù)的常用方法，因?yàn)橹参锔泻写龠M(jìn)植物生長的根際細(xì)菌[5-7]。根際促生細(xì)菌（PGPR，plant growth promoting rhizobacteria）是指在根圈內(nèi)存在某些能促進(jìn)植物生長的細(xì)菌[8]，可以促進(jìn)植物生長，并促進(jìn)營養(yǎng)的吸收，營養(yǎng)供給有利于增強(qiáng)植物對重金屬的吸收[9]。Azosperillium，Azotobacter和Pseudomonas 這3個菌株顯著改善了鉛脅迫下小麥的形態(tài)和產(chǎn)量相關(guān)性狀[10]，抗重金屬的PGPR可以顯著改善Pb和Cd等重金屬在土壤中的溶解度，從而增強(qiáng)植物的吸收[11]。Paxillus involutus顯著增強(qiáng)了Populus canescens對Pb的耐受性和穩(wěn)定性，接種后植物的干重比未接種植物的干重高217％[12]。此外根際細(xì)菌還可使植物產(chǎn)生吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素等植物激素，保護(hù)植物免受病原體侵襲，并修復(fù)土壤中的污染物[13-14]。PGPR促進(jìn)植物生長的直接的機(jī)制包括鐵載體的產(chǎn)生、磷酸鹽的溶解和1–氨基環(huán)丙烷–1–羧酸脫氨酶的合成，使植物能夠通過降低乙烯水平來抵御非生物脅迫條件，并提高植物生長激素的生產(chǎn)[15-17]。因此如何篩選高效降解金屬污染的復(fù)合菌群，探索其最佳發(fā)酵條件成為熱點(diǎn)，優(yōu)化發(fā)酵過程可以充分挖掘菌株潛力，提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本[18]。Thavamani等[19]發(fā)現(xiàn)Consortium–5可在Cd金屬污染下對多環(huán)芳烴（PAH）污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。Ju等[20]發(fā)現(xiàn)接種PGPRs降低了土壤中Cu和NO3–，且顯著增強(qiáng)了植物生物量。Gao等[21]發(fā)現(xiàn)PGPR可促進(jìn)Juncus effusus的生長和養(yǎng)分吸收，且對芘–鎳污染土壤有較好的修復(fù)效果。由于PGPR對重金屬的耐受能力存在差異，不同菌群之間的關(guān)系存在拮抗關(guān)系，產(chǎn)生生長素能力，ACC脫氨酶活性，產(chǎn)生鐵載體和固氮能力存在異質(zhì)性。目前，關(guān)于降解土壤中Pb菌株的篩選研究較少，其發(fā)酵條件也不具有普遍性。因此，筆者通過鉛耐受性、拮抗關(guān)系、產(chǎn)生生長素能力等測定篩選降解鉛的功能菌群，并優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期為解決土壤金屬污染，提高土壤的利用效率和促進(jìn)植物生長提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株來源于實(shí)驗(yàn)室保藏的功能菌株，主要篩自芒草、婆婆納、唐菖蒲和苧麻等根際土壤，包括以下10株功能菌：MR2（Lelliottia），MS3（Serratia marcescens），MR3（Serratia marcescens），PR4（Klebsiella oxytoca），PS3（Serratia marcescens），ZS1（Klebsiella oxytoca），ZS3（Enterobacter cloacae），ZS4（Klebsiella oxytoca），TS8（Klebsiella oxytoca）和ZR1（Klebsiella oxytoca）。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

試驗(yàn)試劑主要有酵母提取物，硝酸鉛，胰蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，高氯酸，氯化鐵，L–色氨酸，葡萄糖，葡萄糖酸鈉，檸檬酸，鹽酸，甲苯，2， 4–二硝基苯肼，氫氧化鈉，考馬斯亮藍(lán)G250，牛血清白蛋白（BSA），KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4，（NH4）2SO4，ACC，CAS，F(xiàn)eCl3·6H2O，HDTMA（十六烷基三甲基溴化銨）。

試驗(yàn)儀器包括高壓滅菌鍋（GR60DA），潔凈工作臺（SW–CJ–1FD），振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY–180S），霉菌培養(yǎng)箱（MJX–250BIII），紫外可見分光光度計(jì)（UV–1000），臺式高速冷凍離心機(jī)（CT15RE）。

1.3 培養(yǎng)基及配方

（1）LB培養(yǎng)基，即酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH值7.2。滅菌條件為121℃滅菌25 min。（2）DF培養(yǎng)基，即KH2PO4 4 g，（NH4）2SO4 2 g，Na2HPO4 6 g，MgSO4 0.2 g，

葡萄糖2 g，葡萄糖酸鈉2 g，檸檬酸2 g，去離子水1 L，pH值7.2。（3）ADF培養(yǎng)基，即DF培養(yǎng)基+ACC 0.3 g。

（4）Ashby培養(yǎng)基。

1.4 10株功能菌株對于鉛的耐受性試驗(yàn)

對10株功能菌株進(jìn)行重金屬離子Pb2+耐受試驗(yàn)，確定每種菌株對重金屬鉛離子的最大耐受濃度。

1.5 10株功能菌株間的拮抗試驗(yàn)

將10株根際細(xì)菌編號分別為MR2、MS3、MR3、

PR4、PS3、ZS1、ZS3、ZS4、TS8和ZR1，進(jìn)行組合復(fù)配。采用牛津杯法和十字交叉劃線法驗(yàn)證兩者之間是否存在拮抗作用，以篩選出沒有拮抗作用的組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 功能菌群的產(chǎn)IAA能力測定

采用Salkowski比色法進(jìn)行定量檢測：將上述無拮抗作用的菌群接種于含有100 mg/L L–色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌懸液10 000 r/min離心10 min，

然后將菌懸液的上清液與Salkowski顯色劑按照1∶2的比例混勻后于暗處反應(yīng)30 min，使用紫外分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液OD530，采用分析純級的IAA進(jìn)行梯度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得菌株分泌IAA量。

1.7 功能菌群的ACC脫氨酶活性測定

將上述篩選出的復(fù)合菌群進(jìn)行菌種活化，LB培養(yǎng)基30℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，取1.5 mL菌液到離心管中10 000 r/min，4℃離心10 min，離心后用不含（NH4）2SO4的DF培養(yǎng)基洗滌2次，重懸于ADF培養(yǎng)基，30℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h。

1.8 功能菌群鐵載體定量測定

將篩選出來的復(fù)合菌株于LB液體培養(yǎng)基中30℃

培養(yǎng)24 h后，10 000 r/min離心10 min，將上清液稀釋10倍，加入等體積CAS檢測液并混合，靜置60 min后于630 nm檢測吸光度A。將培養(yǎng)基稀釋10倍后，與CAS等體積混勻測得吸光度Ar。對微生物產(chǎn)鐵載體的能力進(jìn)行劃分，A/Ar從1.0～0之間以0.2為間隔，每減少0.2增加一個“+”。鐵載體活性單位（siderophore unit，SU）=[（Ar-A）/Ar]×100。

1.9 功能菌群固氮能力測定

將篩選的功能菌群制成菌懸液，接種于Ashby培養(yǎng)基上，點(diǎn)涂，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，能夠在培養(yǎng)基上生長視為具有固氮功能，根據(jù)菌落生長大小判斷其固氮能力大小。

1.10 最佳發(fā)酵條件篩選

篩選出4組復(fù)合菌群的發(fā)酵條件，其中碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉和甘露醇，氮源包括氯化銨（無機(jī)氮）、硫酸銨、蛋白胨、胰蛋白胨以及牛肉膏；用不同碳源來替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基里的碳源；應(yīng)用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值

分別調(diào)至6.4、6.8、7.2、7.6和8.0；分別在溫度25、28、31、34和37℃發(fā)酵復(fù)合菌群。復(fù)合菌群的2個菌種的種子液按1∶1的比例進(jìn)行接種于30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，測定IAA含量和菌群生長量OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株的鉛耐受性結(jié)果

在Pb2+濃度為500～1 500 mg/L條件下，10株功能菌株表現(xiàn)出不同的鉛耐受性（表1）。10株功能菌在Pb2+濃度為1 000 mg/L上均有菌落生長，而在Pb2+濃度為1 500 mg/L的培養(yǎng)皿上均未發(fā)現(xiàn)有微生物生長。結(jié)果表明，MS3、PR4、ZS3、TS8和ZR1對Pb2+的最高耐受濃度為1 000 mg/L，MR2、MR3、PS3、ZS1和ZS4對Pb2+的最高耐受濃度為1 250 mg/L。

2.2 功能菌株間拮抗關(guān)系

不同功能菌株組合之間的拮抗性驗(yàn)證結(jié)果如表2所示，共26組無拮抗作用，復(fù)合菌群組合如下：MR2–MS3，MR2–TS8，MR2–ZR1，MS3–MR3，MS3–ZS3，MS3–ZR1，MR3–PR4，MR3–PS3，MR3–ZS1，MR3–ZS3，MR3–TS8，MR3–ZR1，PR4–ZS3，PR4–TS8，PR4–ZR1，PS3–ZS1，PS3–ZS4，PS3–TS8，PS3–ZR1，ZS1–ZS3，ZS1–ZS4，ZS1–TS8，ZS1–ZR1，ZS4–TS8，ZS4–ZR1，TS8–ZR1。對上述組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 功能菌群產(chǎn)生長素IAA能力

將上述26組無拮抗作用的復(fù)合菌群進(jìn)行產(chǎn)IAA定量測定，如圖1所示，26組功能菌群均具有分泌IAA的能力，IAA的產(chǎn)量在5.16～61.43 mg/L之間，IAA產(chǎn)生量差異顯著（P＜0.05），通過鑒定篩選

出IAA產(chǎn)量高于且等于PS3–ZS4的菌群，其含量為19.55 mg/L，共篩選出16組復(fù)合菌群（MR2–TS8，MR2–ZR1，MS3–ZS3，MS3–ZR1，MR3–ZS3，MR3–ZR1，PR4–ZS3，PR4–ZR1，PS3–ZS4，PS3–ZR1，ZS1–ZS3，ZS1–ZS4，ZS1–ZR1，ZS4–TS8，ZS4–ZR1，TS8–ZR1）。

2.4 功能菌群的ACC脫氨酶活性

將上述16組IAA產(chǎn)生量較好的復(fù)合菌群進(jìn)行ACC脫氨酶活性測定，結(jié)果如圖2所示，篩選的16組功能菌群均具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，ACC脫氨酶活性在0.13～3.77 μmol α-丁銅酸/（h·mg蛋白）之間，ACC脫氨酶活性差異顯著（P＜0.05），通過鑒定篩選出ACC脫氨酶活性高于且等于PR4–ZR1的菌群，其含量為1.16 μmol α-丁銅酸/（h·mg蛋白）。此外MR2–TS8菌群被保留用于后續(xù)試驗(yàn)，雖然其ACC脫氨酶活性最低，僅為0.13 μmol α-丁銅酸/（h·mg蛋白），但是為了探討該菌群的其他能力暫且保留。因此ACC脫氨酶活性比較共篩選出11組復(fù)合菌群（MR2–TS8，MR2–ZR1，MS3–ZS3，MS3–ZR1，PR4–ZS3，PS3–ZR1，ZS1–ZS3，ZS1–ZS4，ZS1–ZR1，ZS4–ZR1，TS8–ZR1）用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 功能菌群的鐵載體定量測定

將上述11組ACC脫氨酶活較好的復(fù)合菌群進(jìn)行鐵載體定量測定結(jié)果如圖3所示。11組功能菌群均能分泌鐵載體，鐵載體的SU值在2%～29.1%之間，鐵載體產(chǎn)生量差異顯著（P＜0.05），ZS1–ZS3鐵載體產(chǎn)生量最高，SU值達(dá)到29.1%，其次是TS8–ZR1，ZS1–ZR1和MS3–ZS3，SU值在15.17%～18.56%之間，鐵載體產(chǎn)生量最少的菌群是MS3–ZR1，SU值僅為2%。綜合IAA產(chǎn)生量以及ACC脫氨酶活性考慮，共篩選出7個功能菌群（MR2–TS8，MR2–ZR1，MS3–ZS3，PR4–ZS3，ZS1–ZS3，ZS1–ZR1，TS8–ZR1）供后面試驗(yàn)使用。

2.6 功能菌群的固氮能力

對上述篩選出的7個功能菌群固氮能力進(jìn)行分析（表3），固氮圈直徑比越大說明菌群固氮能力越強(qiáng)，TS8–ZR1的直徑比最大，D/d值為3.13 cm，其次是MR2–TS8、MR2–ZR1和ZS1–ZR1，直徑比分別為2.8、2.78和2.7 cm。因此選擇MR2–TS8，MR2–ZR1，ZS1–ZR1和TS8–ZR1這4個菌群進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

菌群生長量結(jié)果和IAA產(chǎn)生量結(jié)果如圖4和圖5顯示，5種碳源均對4組菌群生長有促進(jìn)作用，其中，當(dāng)蔗糖作為MR2–TS8這個菌群供給碳源時，菌體生長量最大，與其他4種碳源間形成顯著性差異（P＜

0.05），5種碳源對MR2–TS8生長的促進(jìn)作用由大到小依次為蔗糖、果糖、甘露醇、淀粉和葡萄糖；就IAA產(chǎn)生量而言，5種碳源對該菌群分泌IAA的影響由大到小依次為果糖、淀粉、甘露醇、蔗糖和葡萄糖。綜合分析不同碳源種類對4組菌群生長和IAA產(chǎn)生量的影響，確定最適碳源為果糖。

菌群生長量結(jié)果如圖6顯示，IAA產(chǎn)生量如圖7顯示，牛肉膏對4組菌群分泌IAA的影響都是最大的，與其他4種氮源形成顯著性差異（P＜0.05）。綜合分析不同氮源種類對4組菌群生長和IAA產(chǎn)生量的影響，確定最適氮源為牛肉膏。

菌群生長量結(jié)果和IAA產(chǎn)生量結(jié)果如圖8和圖9顯示，4組菌群在pH值為6.4～7.2時，測定的OD值并沒有太多差異，pH值為7.2時相應(yīng)地IAA產(chǎn)生量也最多，由此可見菌群的最適初始pH值為7.2。

菌群生長量結(jié)果和IAA產(chǎn)生量結(jié)果如圖10和圖11顯示，對于MR2–TS8、MR2–ZR1和TS8–ZR1這3組菌群而言溫度為25℃時，OD值最大，菌體濃度最高。IAA產(chǎn)生量結(jié)果表明，MR2–TS8和MR2–ZR1這2組菌群在31℃時IAA產(chǎn)生量最高，但ZS1–ZR1和TS8–ZR1 這2組菌群的IAA產(chǎn)生量都是在25℃時最高。綜合考慮，菌群的最適發(fā)酵溫度為25℃。

通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，4組功能菌群的最適碳源為果糖，OD 600和IAA產(chǎn)生量相比其他4種碳源效果較好；最適氮源為牛肉膏，在IAA產(chǎn)生量上牛肉膏在5種氮源中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，發(fā)酵條件最優(yōu)組合是pH值為7.2，發(fā)酵溫度為25℃。

3 討論與結(jié)論

研究表明PGPR不僅可以提高植物在鉛污染土壤上的生物量，而且有助于修復(fù)鉛污染土壤。目前，關(guān)于PGPR篩選的研究較多，對于降解鉛污染的較為缺乏，因此試驗(yàn)篩選降解土壤鉛污染，促進(jìn)植物生長的PGPR，探索其最佳發(fā)酵條件。PGPR可以合成植物生長所需的植物激素，例如吲哚乙酸IAA、赤霉素等來促進(jìn)植物生長，從而改善根系生長，增強(qiáng)植物對水分和養(yǎng)分的吸收[22]。Puente等[23]研究了IAA對大豆與Bradyrhizobium和A.brasilense共同接種后的影響，并證明根系生長的增加是植物激素IAA作用的結(jié)果，改善了大豆與Bradyrhizobium之間的相互作用。同時ACC對植物也有促進(jìn)作用，ACC能在根部滲出，用于合成乙烯，并作為細(xì)菌生長的碳源和氮源，通過這種方式，產(chǎn)生ACC脫氨酶的PGPR有助于利用ACC降低植物外部的ACC水平，使其與內(nèi)部水平相等[24]。ACC脫氨酶調(diào)節(jié)乙烯濃度，提高了植物對土壤中高濃度重金屬的耐受性[25]。

除此之外，PGPR還能夠溶解磷酸鹽，產(chǎn)生鐵載體，修復(fù)氮?dú)獠p輕生物和非生物脅迫[26]。Barzanti等[27]從貝托洛尼冰藻中回收的細(xì)菌分離物中有81%的菌株在鎳脅迫下能夠產(chǎn)生鐵載體并促進(jìn)植物生長。試驗(yàn)通過對產(chǎn)IAA能力、ACC酶活性、產(chǎn)生鐵載體能力等從26種復(fù)合菌群組合種篩選到MR2–TS8、MR2–ZR1、ZS1–ZR1和TS8–ZR1優(yōu)勢菌群。

復(fù)合菌群的發(fā)酵條件對其應(yīng)用具有重要影響，試驗(yàn)將篩選到的MR2–TS8、MR2–ZR1、ZS1–ZR1和TS8–ZR1這4個菌群進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，通過對碳源、氮源、初始pH值和溫度進(jìn)行探究，確定復(fù)合菌群的最佳發(fā)酵條件。關(guān)于多種碳源和氮源在微生物生存中的作用，已經(jīng)有許多報(bào)道[28]，除菌群的生長量結(jié)果表明最優(yōu)碳源依次為蔗糖、果糖，其余菌群生長量和IAA產(chǎn)量結(jié)果均顯示果糖為最優(yōu)碳源，因此果糖為最合適的碳源。菌群生長和IAA產(chǎn)量結(jié)果均表明，牛肉膏為最適合的氮源。微生物的生長和代謝不僅受到包括碳源、氮源和微量元素在內(nèi)的培養(yǎng)基成分的影響，而且還受到包括酸堿度，溫度等培養(yǎng)條件的影響。pH值會影響微生物細(xì)胞中的酶活性和微生物細(xì)胞膜的電荷，以及培養(yǎng)基中某些重要營養(yǎng)素和中間代謝物的解離[29]。菌群生長量結(jié)果表明pH值在6.4～7.4時無顯著差異，但在pH值為7.2時IAA產(chǎn)量最高，因此最適pH值為7.2。溫度是微生物生長發(fā)育和代謝過程中的關(guān)鍵因素，可以直接影響發(fā)酵過程中的酶活性[30]，除MR2–TS8和MR2–ZR1在31℃條件下IAA產(chǎn)量稍有優(yōu)勢，其余菌群生長量和IAA產(chǎn)量均顯示25℃為最佳溫度，綜合考慮最佳溫度為25℃。

研究將10株單個功能菌種進(jìn)行兩兩組合，通過功能菌群產(chǎn)IAA能力、ACC脫氨酶活性的測定、鐵載體的定量測定以及固氮能力的檢測篩選出4組促生能力較好的功能菌群（MR2–TS8，MR2–ZR1，ZS1–ZR1和TS8–ZR1），通過對菌株的發(fā)酵的碳源、氮源、酸堿度和溫度進(jìn)行探究得到最優(yōu)發(fā)酵條件碳源為果糖，氮源為牛肉膏，pH值為7.2，溫度為25℃。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）