摘要：為探究紫薇品種‘銀輝’葉綠體基因組特征、密碼子使用模式及影響因素，采用高通量測序技術(shù)對‘銀輝’紫薇葉綠體基因組測序，篩選出47條蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行密碼子偏好性分析。結(jié)果顯示：‘銀輝’紫薇葉綠體基因組為典型的四分體結(jié)構(gòu)，總長度為152 174 bp，GC含量為37.6%；基因組的有效密碼子數(shù)（ENC）為35.73～61.00，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）為0.55～0.65，表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因組密碼子偏好性較弱；基因組的最優(yōu)密碼子有11個(gè)（AAU、ACA、AGA、AGU、CAU、CGA、CUU、GGA、UAU、UUG和UUU），表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因組的密碼子偏好以A或U結(jié)尾；中性繪圖的回歸系數(shù)為0.261 6，

且有效密碼子繪圖顯示實(shí)際ENC和理論ENC差異較大，表明自然選擇是影響密碼子偏好性的主要因素。

關(guān)鍵詞：‘銀輝’紫薇；密碼子偏好性；葉綠體基因組；最優(yōu)密碼子

中圖分類號：S685.99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1006-060X（2024）12-0001-08

Codon Usage Bias of the Chloroplast Genome in Lagerstroemia indica 'Ebony Glow'

LI Mei1，QIN Bo2，LIU Yu-jun1，HUANG Xin2，LIU Li1，SUN Kai-dao2，HUANG Yao-heng2，LUO Yi-min1

（1. Nanning Arboretum， Nanning 530031， PRC; 2. Guangxi Forestry Research Institute， Guangxi Laboratory of Forestry， Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation amp; Utilization， Nanning 530002， PRC）

Abstract： This study aims to explore the characteristics as well as the codon usage pattern and influencing factors of the chloroplast genome in Lagerstroemia indica 'Ebony Glow'. High-throughput sequencing was employed to sequence the genome of this plant. Forty-seven coding sequences were selected for the analysis of codon usage bias. The results revealed that the chloroplast genome of L. indica 'Ebony Glow' exhibited a typical tetrad structure， with a total length of 152 174 bp and the average GC content of 37.6%. The effective number of codons （ENC） ranged from 35.73 to 61.00， and the codon adaptation index （CAI） ranged from 0.55 to 0.65， which indicated a weak preference for specific codons in the chloroplast genome of L. indica 'Ebony Glow'. The genome contained 11 optimal codons （AAU， ACA， AGA， AGU， CAU， CGA， CUU， GGA， UAU， UUG， and UUU）， which suggested a preference for ending with A/U. The neutral mapping demonstrated a linear regression slope of 0.261 6 and the ENC plotting showed a large difference between measured ENC and theoretical ENC， which suggested that natural selection was the primary factor influencing codon usage bias.

Key words： Lagerstroemia indica 'Ebony Glow'; codon usage bias; chloroplast genome; optimal codon

葉綠體是植物將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的重要細(xì)胞器[1]，具有獨(dú)立的基因組，其基因組是一個(gè)典型的雙鏈閉環(huán)DNA分子[2]。與植物核基因組相比，葉綠體基因組具有單親遺傳、結(jié)構(gòu)簡單保守和演化速率緩慢等特征，被廣泛運(yùn)用于植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[3-6]和光合作用調(diào)控機(jī)制[7-8]等研究。密碼子是連接生物體中氨基酸、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)的重要橋梁[2]。了解葉綠體基因組中的密碼子使用模式，例如密碼子偏差[9]，有助于研究基因遺傳進(jìn)化規(guī)律和表達(dá)特征，為葉綠體基因工程、分子育種和遺傳改良提供理論支撐[10-11]。

‘銀輝’紫薇（Lagerstroemia indica 'Ebony Glow'）

是千屈菜科紫薇屬植物，其成熟葉片呈黑棕色，花朵為白色，是花葉共賞的優(yōu)良紫薇品種，具有花期長、花量大和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用于街道綠化和園林造景[12-14]。然而，目前關(guān)于紫薇葉綠體基因組密碼子使用模式的研究報(bào)道較少?；诖耍撗芯坎捎酶咄繙y序技術(shù)對‘銀輝’紫薇進(jìn)行葉綠體基因組測序，探究‘銀輝’紫薇的葉綠體基因組特征、密碼子使用模式及相關(guān)成因，以期為該品種及紫薇屬物種葉綠體基因組的密碼子優(yōu)化、遺傳修飾及葉綠體工程等研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院紫薇種質(zhì)資源圃（108°22′E，22°55′N）的紫薇品種‘銀輝’，采集其新鮮嫩葉，用硅膠干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取與高通量測序 采用改良的CTAB法提取植物葉片總DNA，使用Illumina NovaSeq 6000

平臺(tái)（2×150 bp）進(jìn)行測序。

1.2.2 葉綠體基因組組裝和注釋 使用默認(rèn)參數(shù)的FastQC v0.11.9軟件對每個(gè)樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾。使用GetOrganelle（https：//github.com/Kinggerm/

GetOrganelle）將高質(zhì)量成對末端reads組裝成contigs，參數(shù)設(shè)置R為15，k（k-mers）為75、85、95、105和115。使用Bandage[15]對組裝好的質(zhì)體進(jìn)行目視檢查和編輯，評估組裝情況。以紫薇（L. indica；登陸號：NC_030484）為參考基因組，使用PGA[16]軟件對質(zhì)體基因進(jìn)行注釋，在Geneious v11.1.5[17]中進(jìn)行目視檢查和手工編輯。使用在線工具OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制紫薇葉綠體基因組圖譜。

1.2.3 密碼子偏好性參數(shù) 為了避免采樣偏差，參考過往研究[18-20]對葉綠體基因組中的每個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行篩選，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：序列長度大于300 bp；以AUG為起始密碼子，并以UGA、UAG或UAA為終止密碼子；序列中間無終止密碼子出現(xiàn)。使用CodonW v1.4.2軟件和在線工具EMBOSS（https：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cusp）計(jì)算相對同

義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，

RSCU）、有效密碼子數(shù)（Effective number of codon，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）以及密碼子各位點(diǎn)的GC含量（GC1、GC2、GC3）和總含量（GCall）。若RSCU等于1，表明密碼子的使用沒有偏好性；若RSCU大于1，則表明密碼子的使用頻率相對較高[21]。ENC的取值范圍為20（每個(gè)氨基酸只使用1個(gè)密碼子）到61（每個(gè)密碼子都被平均使用）[22]，通常將35作為區(qū)分值來評估密碼子偏倚的強(qiáng)度，ENC越小說明密碼子的使用偏好性越強(qiáng)，越大說明密碼子偏好性越弱[20]。CAI的取值范圍為0～1，CAI越接近1表示密碼子使用偏好性越強(qiáng)，越接近0則表示偏好性越弱[23]。

1.2.4 中性繪圖分析 繪制每個(gè)基因GC1和GC2平均值（GC12）與GC3的散點(diǎn)圖并進(jìn)行線性回歸，判斷自然選擇和突變壓力對密碼子使用的影響。若回歸系數(shù)趨于0，表明密碼子使用偏好性受自然選擇的影響較大；若回歸系數(shù)趨于1，則表明密碼子使用偏好性受突變壓力的影響較大[24]。

1.2.5 有效密碼子繪圖分析 如果ENC位于預(yù)期ENC曲線附近，表明突變壓力對密碼子的使用影響較大；如果ENC離預(yù)期ENC曲線較遠(yuǎn)，表明密碼子的使用受自然選擇的限制較多[25]。為衡量實(shí)際ENC（ENCobs）和理論ENC（ENCexp）的差異程度，根據(jù)[（ENCexp-ENCobs）/ENCexp]計(jì)算比值并以其分布確定影響密碼子偏好性的主要因素[18，20，26]。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析 將樣本的實(shí)際有效密碼子數(shù)從小到大進(jìn)行排序，分別選取排序前5和排序后5的基因，構(gòu)建高表達(dá)基因庫和低表達(dá)基因庫，并計(jì)算兩者的RSCU差值（ΔRSCU）。如果密碼子滿足

ΔRSCU≥0.08，則該密碼子為高表達(dá)密碼子；如果密碼子滿足RSCU＞1，則該密碼子為高頻率密碼子；如果兩者同時(shí)滿足，則該密碼子為‘銀輝’紫薇葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組特征

基于全基因組鳥槍法測序，最終獲得6.0 Gb原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過濾后獲得4.0 Gb clean data。由圖1可知，‘銀輝’紫薇葉綠體基因組全長為152 174 bp，GC含量為37.6%。其基因組為典型的四分體結(jié)構(gòu)，包括大單拷貝區(qū)（Large single-copy，LSC），小單拷貝區(qū)（Small single-copy，SSC）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（Inverted repeats）IRa和IRb。其中大單拷貝區(qū)長度為84 006 bp，GC含量為35.9%；小單拷貝區(qū)長度為16 918 bp，GC含量為31.0%；反向重復(fù)區(qū)長度為51 250

bp，GC含量為42.5%。

以紫薇（NC_030484）為參考基因組，經(jīng)測序可知共有131個(gè)基因被成功注釋，包括86個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、37個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因。由表1可知，這些基因主要參與了光系統(tǒng)II（psbA、psbB、psbC、psbD、psbE和psbF等）、NADH脫氫（ndhA、ndhB、ndhC、ndhD和ndhE等）和ATP合成（atpA、atpB、atpE和atpF等）等功能過程。將最終獲得的‘銀輝’紫薇葉綠體基因組序列上傳至NCBI公共數(shù)據(jù)庫，登錄號為PQ014275。

2.2 密碼子偏好性參數(shù)分析

經(jīng)過篩選過濾，最后保留47條蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行密碼子偏好性分析。由表2可知，共有30個(gè)密碼子的RSCU小于1，2個(gè)密碼子的RSCU等于1，29個(gè)密碼子的RSCU大于1。除UUG外，其余RSCU大于1的密碼子均以A或U結(jié)尾。

由表3可知，47個(gè)基因中，GCall最低值為31.56%

（ccsA），最高值為46.04%（rps11），平均值為38.38%；GC1、GC2和GC3最高值分別為57.14%（rbcL）、

58.99%（rps11）和37.84%（ycf4），最低值分別為32.81%（ccsA）、28.70%（cemA）和21.79%（ndhF），均值分別為47.05%、39.32%和28.76%。所有基因的ENC均大于區(qū)分值35，最低為35.73（rps18），最高為61.00（ycf3）；ENC大于45的基因有35個(gè)，占總基因數(shù)的74.47%，表明‘銀輝’紫薇的密碼子偏好性相對較弱。CAI為0.55～0.65，平均值為0.61，表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因在使用特定密碼子時(shí)偏好性并不明顯。

2.3 中性繪圖分析結(jié)果

由圖2可知，GC12為34.35%～56.84%，R2為0.041 6，

回歸系數(shù)為0.261 6，表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因組密碼子偏好性受自然選擇的影響大于受突變壓力的影響。

圖2 ‘銀輝’紫薇葉綠體基因組中性繪圖

2.4 有效密碼子繪圖分析結(jié)果

由圖3可知，僅有少數(shù)基因沿預(yù)期ENC曲線分布或落在曲線附近，而大部分基因散亂分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方。計(jì)算實(shí)際ENC和理論ENC的差異程度（表4），發(fā)現(xiàn)差異程度分布在（-0.05，0.05）區(qū)間的基因有15個(gè)，占基因總數(shù)的31.91%，表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因ENC的實(shí)際值與期望值普遍存在較大差異，說明影響其密碼子偏好性的主要因素并不是堿基突變，而是自然選擇。

2.5 最優(yōu)密碼子分析結(jié)果

由表3可知，根據(jù)有效密碼子數(shù)從小到大進(jìn)行排序，數(shù)值排名前5的基因?yàn)閞ps18、psbA、ndhI、rps14和ndhA，排名后5的基因?yàn)閥cf2（rps4）、clpP、ycf4、rpl2和ycf3。由表5和表2可知，高表達(dá)密碼子（ΔRSCU≥0.08）有26個(gè)，高頻率密碼子（RSCU＞

1）有29個(gè)，同時(shí)滿足2個(gè)條件（ΔRSCU≥0.08且RSCU＞1）的最優(yōu)密碼子共11個(gè)，即AAU、ACA、AGA、AGU、CAU、CGA、CUU、GGA、UAU、UUG和UUU。除UUG外，其他密碼子均以A或U結(jié)尾，表明‘銀輝’紫薇葉綠體基因組的密碼子偏好以A或U結(jié)尾。

3 討論與結(jié)論

葉綠體基因組承載著編碼葉綠體內(nèi)蛋白質(zhì)的遺傳信息，包含光合作用過程所必需的全部機(jī)制[27]。在大多數(shù)進(jìn)行光合作用的陸地植物中，葉綠體基因組的大小為140～160 kb，通常分為4個(gè)區(qū)域，包括1個(gè)大單拷貝區(qū)、1個(gè)小單拷貝和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)[28]。

研究表明‘銀輝’紫薇基因組也為四分體結(jié)構(gòu)，總長度為152 174 bp，GC含量為37.6%，與大多數(shù)紫薇屬植物相似[14]，說明紫薇屬植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。紫薇葉綠體基因組不同區(qū)域的GC含量差異明顯，呈現(xiàn)反向重復(fù)區(qū)（42.5%）＞大單拷貝區(qū)（35.9%）＞小單拷貝區(qū)（31.0%）的情況，這種差異可能與IR區(qū)域包含有較高GC含量的rRNA基因有關(guān)[29]。

密碼子是遺傳信息表達(dá)過程中的重要橋梁[30]，不同植物可能具有不同的密碼子偏好性，即對某一種或幾種特定密碼子的使用頻率超過其他同義密碼子[26]。該研究發(fā)現(xiàn)‘銀輝’紫薇葉綠體基因組對特定密碼子的偏好性普遍較低，這可能與其在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了不同的選擇壓力和環(huán)境適應(yīng)有關(guān)[31]。此外，該研究發(fā)現(xiàn)密碼子不同位點(diǎn)的GC含量不同，且‘銀輝’紫薇葉綠體基因組更傾向于使用以A或U結(jié)尾的密碼子，與RSCU分析結(jié)果一致，這可能與密碼子以A或U結(jié)尾更有助于提高翻譯準(zhǔn)確性和效率有關(guān)[32]。

評估植物基因組的密碼子使用情況和特點(diǎn)，有助于了解植物對環(huán)境的適應(yīng)性演化過程。影響不同物種密碼子偏好性的原因主要有自然選擇和突變壓力兩個(gè)因素[31]，可通過中性繪圖和有效密碼子繪圖等分析框架來識(shí)別主要成因。該研究發(fā)現(xiàn)中性繪圖的回歸系數(shù)為0.261 6，且有效密碼子繪圖顯示實(shí)際ENC和理論ENC差異較大，表明突變壓力并不是影響密碼子偏好性的主要因素，‘銀輝’紫薇葉綠體基因組密碼子偏好性可能更受自然選擇的影響，這與黃藥大頭茶[33]、建始槭[20]、南五味子[34]等植物的研究結(jié)果相似。該研究探究了‘銀輝’紫薇葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、密碼子使用偏好性及其影響因素，可為后續(xù)紫薇屬植物的種質(zhì)資源開發(fā)及葉綠體基因工程等研究提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] HUA Z Y，TIAN D M，JIANG C，et al. Towards comprehensive integration and curation of chloroplast genomes[J]. Plant Biotechnology Journal，2022，20（12）：2239-2241.

[2] WANG Z J，CAI Q W，WANG Y，et al. Comparative analysis of Codon bias in the chloroplast genomes of Theaceae species[J]. Frontiers in Genetics，2022，13：824610.

[3] WANG T，LI T Z，CHEN S S，et al. Untying the Gordian knot of plastid phylogenomic conflict：a case from ferns[J]. Frontiers in Plant Science，2022，13：918155.

[4] CHEN S S，WANG T，SHU J P，et al. Plastid phylogenomics and plastomic diversity of the extant lycophytes[J]. Genes，2022，13（7）：1280.

[5] WANG Y H，WANG J Y，GARRAN T A，et al. Genetic diversity and population divergence of Leonurus japonicus and its distribution dynamic changes from the last interglacial to the present in China[J]. BMC Plant Biology，2023，23（1）：276.

[6] GU C H，TEMBROCK L R，JOHNSON N G，et al. The complete plastid genome of Lagerstroemia fauriei and loss of rpl2 intron from Lagerstroemia（Lythraceae）[J]. PLoS One，2016，11（3）：e0150752.

[7] SUN Y，YAO Z J，YE Y T，et al. Ubiquitin-based pathway acts inside chloroplasts to regulate photosynthesis[J]. Science Advances，2022，8（46）：eabq7352.

[8] KAFRI M，PATENA W，MARTIN L，et al. Systematic identification and characterization of genes in the regulation and biogenesis of photosynthetic machinery[J]. Cell，2023，186（25）：5638-5655.e25.

[9] SHARP P M，LI W H. The codon adaptation index-a measure of directional synonymous codon usage bias，and its potential applications[J]. Nucleic Acids Research，1987，15（3）：1281-1295.

[10] WANG X T，KARKI U，ABEYGUNARATNE H，et al. Plant cell-secreted stem cell factor stimulates expansion and differentiation of hematopoietic stem cells[J]. Process Biochemistry，2021，100：39-48.

[11] WU S X，XU L L，HUANG R，et al. Improved biohydrogen production with an expression of codon-optimized hemH and lba genes in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii[J]. Bioresource Technology，2011，102（3）：2610-2616.

[12] 李霞. 5種彩葉美國紫薇在滄州市引種適應(yīng)性研究[J]. 現(xiàn)代園藝，2019（13）：49-50.

[13] 李永欣，王曉明，喬中全，等. 紫葉紫薇引種試驗(yàn)[J]. 湖南林業(yè)科技，2018，45（6）：68-71.

[14] 黃建睿，陳濤，繆紳裕. 紫薇屬植物葉綠體基因組研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，49（10）：52-61.

[15] WICK R R，SCHULTZ M B，ZOBEL J，et al. Bandage：interactive visualization of de novo genome assemblies[J]. Bioinformatics，2015，31（20）：3350-3352.

[16] QU X J，MOORE M J，LI D Z，et al. PGA：a software package for rapid，accurate，and flexible batch annotation of plastomes[J]. Plant Methods，2019，15：50.

[17] KEARSE M，MOIR R，WILSON A，et al. Geneious Basic：an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data[J]. Bioinformatics，2012，28（12）：1647-1649.

[18] 萬美暄，黃顯俊，李雪，等. 須彌葛葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（21）：102-107.

[19] 高燦，樊智豐，馬長樂，等. 菠蘿蜜葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）：2023，52（6）：776-784.

[20] 趙月梅，楊貴清，徐其碧，等. 建始槭葉綠體基因組密碼子使用偏性分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，51（6）：792-799.

[21] DEB B，UDDIN A，CHAKRABORTY S. Composition，codon usage pattern，protein properties，and influencing factors in the genomes of members of the family Anelloviridae[J]. Archives of Virology，2021，166（2）：461-474.

[22] FUGLSANG A. Estimating the“effective number of codons”：the Wright way of determining codon homozygosity leads to superior estimates[J]. Genetics，2006，172（2）：1301-1307.

[23] XIE C Z，ZHANG P，TAO Y M，et al. Codon usage and evolutionary dynamics of genetic diversity of novel imported porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J]. One Health Advances，2023，1（1）：31.

[24] KHANDIA R，SINGHAL S，KUMAR U，et al. Analysis of Nipah virus codon usage and adaptation to hosts[J]. Frontiers in Microbiology，2019，10：886.

[25] NOVEMBRE J A. Accounting for background nucleotide composition when measuring codon usage bias[J]. Molecular Biology and Evolution，2002，19（8）：1390-1394.

[26] 洪森榮，張牧彤，徐子林，等. ‘懷玉山’高山馬鈴薯葉綠體基因組特征及密碼子使用偏好性分析[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，41（X）：1-12.

[27] SUGIURA M. The chloroplast genome[J]. Plant Molecular Biology，1992，19（1）：149-168.

[28] HU C，JIAO Z B，DENG X Y，et al. The ecological adaptation of the unparalleled plastome character evolution in slipper orchids[J]. Frontiers in Plant Science，2022，13：1075098.

[29] ZHENG G，WEI L L，MA L，et al. Comparative analyses of chloroplast genomes from 13 Lagerstroemia（Lythraceae）species：identification of highly divergent regions and inference of phylogenetic relationships[J]. Plant Molecular Biology，2020，102（6）：659-676.

[30] SUNDARARAJAN A，DUKOWIC-SCHULZE S，KWICKLIS M，et al. Gene evolutionary trajectories and GC patterns driven by recombination in Zea mays[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1433.

[31] MAJEED A，KAUR H，BHARDWAJ P. Selection constraints determine preference for A/U-ending codons in Taxus contorta[J]. Genome，2020，63（4）：215-224.

[32] DE OLIVEIRA J L，MORALES A C，HURST L D，et al. Inferring adaptive codon preference to understand sources of selection shaping codon usage bias[J]. Molecular Biology and Evolution，2021，38（8）：3247-3266.

[33] 高燦，樊智豐，馬長樂. 黃藥大頭茶葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2023，43（5）：66-76.

[34] 劉濤，尹登攀，金吉芬，等. 南五味子屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，38（5）：102-109.

（責(zé)任編輯：王婷）