[關(guān)鍵詞]聚乳酸；復(fù)合材料；骨組織修復(fù)工程；下頜骨；缺損；動物實驗

目前引導(dǎo)骨再生術(shù)（guidedboneregeneration，GBR）是最常用的骨增量方法之一，它解決了臨床上很多骨量不足的問題。GBR屏障膜對促進種植體周圍新生骨的形成有重要作用。理想的GBR屏障膜應(yīng)具有足夠的剛性，能承受覆蓋軟組織的壓迫，可為硬組織形成提供空間又能被機體降解[1]。人工合成的高分子材料聚乳酸（polylacticacid，PLA）由于優(yōu)異的生物相容性和機械性能，被廣泛用于組織工程中受損組織的功能恢復(fù)[2-4]。與此同時，PLA材料在諸如體液之類的水性環(huán)境中能靠酯鍵的簡單水解而進行降解，降解的產(chǎn)物能夠被人體新陳代謝最終生成CO2和水排出體外，避免二次手術(shù)取出給患者帶來痛苦[5]。PLA根據(jù)旋光性的不同可分為左旋聚乳酸（L-PLA，PLLA）、右旋聚乳酸（D-PLA，PDLA）和外消旋聚乳酸（DL-PLA，PDLLA）。其中PDLLA為非晶態(tài)，可塑性強，但降解較快、強度低；PLLA有較高的結(jié)晶度和機械強度，降解較慢[6-7]。本實驗選用PDLLA和PLLA共聚形成的一款新型PLA膜，兩種材料的優(yōu)缺點互補。PDLLA的高韌性和柔韌性能夠提高PLLA膜的抗撕裂性能，而PLLA的高結(jié)晶度和光穩(wěn)定性能夠提高PDLLA膜的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。此外，這種新型PLA膜具有較好的可塑性，能夠更好地適應(yīng)不同形狀的骨缺損，更好地貼合組織表面，與各種骨替代材料聯(lián)合使用形成所需的牙槽嵴形態(tài)，提高了手術(shù)的精度和效果。為探究該型PLA膜的生物相容性、體內(nèi)降解性、骨傳導(dǎo)性和引導(dǎo)骨組織再生能力，本動物實驗以同類型已上市的聚乳酸膜Guidor作為對照組，為其將來應(yīng)用于臨床治療提供一些實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物

成年健康的新西蘭兔24只，雌雄各半，體重2.5～3.0kg，均由四川大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗主要材料試劑與儀器

PDLLA/PLLA膜由廣州市弘健生物醫(yī)用制品科技有限公司提供，將其制成15mm×20mm大小，厚度0.2mm，特性黏數(shù)2.4dl/g，拉伸強度10.94Mpa，經(jīng)鈷60輻照滅菌（Φ：0.5mm×0.2mm，美蘭標記）。Guidor可吸收基質(zhì)屏障膜（Sunstar公司，美國）、Bio-oss骨粉（Geistlich公司，瑞士）、3%戊巴比妥（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司）、HH-420型恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）、RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）、DM2500型硬組織切片機、DM2500B正立顯微鏡（Leica公司，德國）。

1.3動物模型建立和分組處理

實驗動物稱重，用3%戊巴比妥鈉按體重1mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射行全身麻醉。常規(guī)術(shù)區(qū)備皮，消毒鋪巾。麻醉起效后，隨機選取兔一側(cè)下頜骨，平行于下頜骨下緣逐層切開皮膚分離筋膜、咬肌、骨膜，注意保護神經(jīng)，充分顯露后在咬肌前緣下頜骨頰側(cè)，距下頜骨下緣上3mm處，在大量生理鹽水沖洗降溫下，用細裂鉆在制備長×寬×深為10mm×5mm×3mm的箱狀骨缺損。

將24只實驗動物隨機平均分為實驗組、對照組和空白組，每組8只。所有動物缺損處充分止血，實驗組動物于骨缺損處填Bio-oss骨粉，然后將PDLLA/PLLA膜覆蓋于缺損表面，嚴密縫合組織；對照組動物于骨缺損處填Bio-oss骨粉，然后將Guidor聚乳酸膜覆蓋于缺損表面，嚴密縫合組織；空白組動物制備骨缺損后不作處理。術(shù)后所有動物給予常規(guī)顆粒飼料，分籠喂養(yǎng)，每日肌內(nèi)注射慶大霉素40000U預(yù)防感染，連續(xù)3d。

1.4標本采集與檢測

1.4.1 標本采集 術(shù)后8、12周兩個時間點，分別安樂死3組動物各4只，下頜骨完整分離后固定于中性甲醛溶液24h。

1.4.2 標本檢測 1）大體觀察。觀察實驗區(qū)下頜骨新生骨組織的顏色、質(zhì)地，骨缺損周圍有無炎癥壞死及軟硬組織生長愈合情況。2）Micro-CT檢查。標本固定后進行Micro-CT掃描，層厚設(shè)置為10μm，設(shè)置下頜骨標本缺損區(qū)為感興趣區(qū)（regionofinterest，ROI）取缺損區(qū)最完整的層面約100層，進行三維重建并定量分析測量缺損區(qū)新生骨的相對骨體積分數(shù)（bonevolume/tissuevolume，BV/TV）、骨密度（bonemineraldensity，BMD）和骨小梁數(shù)量（trabecularnumber，Tb.N）。3）組織學(xué)檢查和計算機圖像分析。取下頜骨于10%的中性甲醛溶液固定后脫鈣3個月，沿骨缺損矢狀面切開露出骨愈合界面，然后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，在數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性分布的條件下采用配對t檢驗，Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大體觀察

實驗動物全部存活，術(shù)后1d即可正常進食，局部傷口未出現(xiàn)感染化膿。所有實驗動物均按時分批處死并獲得標本。

術(shù)后8周，實驗組可見PDLLA/PLLA膜與植入前顏色一致表面光滑呈透明狀，邊緣略有吸收，與周圍組織界限較清，連接緊密；骨缺損區(qū)新生骨組織與周圍正常骨質(zhì)界限模糊，顏色為較淺的紅色，表面粗糙，充填大半骨缺損區(qū)。對照組膜材料已降解完全，骨缺損深度變淺，骨缺損直徑無明顯改變。空白組骨缺損區(qū)內(nèi)有纖維組織充填。術(shù)后12周，實驗組可見PDLLA/PLLA膜顏色呈白堊色半透明狀且表面粗糙有點凹狀吸收，膜邊緣進一步吸收，整體較完整，質(zhì)韌；骨缺損區(qū)基本愈合，新生骨與正常骨組織邊界難以區(qū)分，新生骨顏色較正常骨組織偏紅。對照組骨組織也基本愈合，新生骨組織高度略低于正常骨，表面軟組織易分離。空白組骨缺損變淺但較前兩組深，軟組織不易分離。

2.2Micro-CT三維重建分析及骨微觀參數(shù)比較

Micro-CT對感興趣區(qū)域進行三維重建，可以觀察到實驗組和對照組缺損區(qū)域新生骨明顯多于空白組（圖1）。

術(shù)后8周，實驗組和對照組新生骨BV/TV、BMD和Tb.N顯著高于空白組（Plt;0.05），且實驗組新生骨BV/TV顯著高于對照組（Plt;0.05）。術(shù)后12周，實驗組和對照組新生骨BV/TV、BMD和Tb.N顯著高于空白組（Plt;0.05），但是實驗組與對照組新生骨BV/TV、BMD和Tb.N比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）（圖2）。

2.3 組織切片觀察

實驗組下頜骨缺損區(qū)域經(jīng)HE染色顯示，骨缺損區(qū)骨小梁的量遠遠大于空白組，且骨小梁間排列緊密。具體表現(xiàn)為：術(shù)后8周，缺損區(qū)有偽足狀或釘突狀新生骨小梁長入其中，新生骨小梁周邊細胞生長活躍，并可見少量成骨細胞及破骨細胞；術(shù)后12周，骨小梁周圍可見大量成骨細胞及破骨細胞，骨缺損部位骨組織密度接近周邊正常骨組織（圖3）。

3 討論

近年來，引導(dǎo)骨再生的外科手術(shù)已經(jīng)比較成熟，屏障膜材料的選擇和使用是GBR的關(guān)鍵。Scantlebury[8]提出，應(yīng)用于口腔中引導(dǎo)骨再生的膜材料應(yīng)滿足以下5個條件，即生物相容性、細胞阻擋性、維持骨生成空間、組織親和性和臨床上易操作性。目前臨床上應(yīng)用較多的屏障膜材料是可吸收膠原膜，其有利于創(chuàng)口愈合和血管的再生，但是由于巨噬細胞和多形核白細胞的快速酶降解導(dǎo)致膠原膜的機械性能下降和屏障功能下降，屏障膜的過早降解可能會影響骨再生的結(jié)果，不利于較大骨缺損的臨床應(yīng)用[9-10]?，F(xiàn)有的其他高分子可吸收屏障膜通常由合成聚合物組成，如聚丙交酯、聚己內(nèi)酯，這些材料普遍存在機械強度差、對空間維持能力欠缺、膜植入后易移位或塌陷等問題。以上屏蔽膜材料存在的問題可能是由于膜的降解速率過快，導(dǎo)致剛性不足有關(guān)，這類屏蔽膜通常需要額外的支撐，可能會限制新骨的形成。如何克服現(xiàn)有材料的缺點，研制出效果更佳的高分子可吸收材料膜是該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢和亟待解決的問題。

PLA因其具有較好的生物相容性、生物降解性、機械強度以及可加工塑形的特點，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物遞送、植入物、縫合和組織工程等[2]。Annunziata等[11]肯定了PDLLA材料的理化及生物學(xué)特性，并初步應(yīng)用到引導(dǎo)骨再生技術(shù)中，展現(xiàn)了PDLLA膜操作簡單、無恢復(fù)期、良好的可塑性和軟組織反應(yīng)等特點，但現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)較少。PLA的一些材料特性，如剛性、滲透性、結(jié)晶度、熱穩(wěn)定性、疏水性/親水性等，可以通過共聚、共混和生產(chǎn)聚合物復(fù)合材料等工藝得到改善，使其適合于牙科或骨科植入物的潛在用途[12]。本研究中實驗組使用的新型PLA膜即是由PLA的兩種不同構(gòu)型PDLLA和PLLA共聚而成。廖凱榮等[13]對PDLLA/PLLA共聚物的力學(xué)性能及體外降解特性進行了研究，結(jié)果顯示共聚物有較高力學(xué)強度，且由于共聚物的總結(jié)晶度降低，其降解速度相比于PLLA增大，說明共聚物的生物相容性更好。除此之外，有研究[14-15]顯示通過調(diào)節(jié)PDLLA和PLLA兩種材料的比例和控制其結(jié)晶度，使其前期具有較好的完整性，為骨缺損部位提供機械支持、為成骨及破骨細胞等提供附著位點，在治療的后期，材料的降解速率與骨組織的修復(fù)速率相匹配，有效減少了對骨愈合過程的干預(yù)。本研究所使用的新型PLA膜相比較于傳統(tǒng)屏障膜擁有較好的可塑性，能夠使其更好地適應(yīng)牙槽骨缺損，從而有助于形成再生骨的輪廓外形。此外，新型PLA膜具有一定的機械強度，能夠承受一定的外力和壓力，不易破裂或變形。殼樣塑形能夠為再生骨組織提供支撐和保護作用，防止其移位或受損，即使在軟組織或者機械力的壓迫下，新型PLA膜依然為預(yù)期的骨再生提供合適的空間，促進組織的愈合和修復(fù)。

本研究以目前臨床常用的Guidor可吸收膜作為對照，探究PDLLA/PLLA膜在引導(dǎo)骨組織再生中的效果。Guidor可吸收膜的主要成分也是PLA，其膜屏障功能至少維持6周，降解產(chǎn)物不影響組織愈合與再生，具有良好的韌性和貼服性，廣泛應(yīng)用于GBR手術(shù)[16]。結(jié)果顯示，手術(shù)后8周Guidor可吸收膜已經(jīng)完全降解，而PDLLA/PLLA膜僅邊緣略有吸收，12周骨缺損區(qū)基本愈合時PDLLA/PLLA膜中心部分仍完好，也未引起實驗動物出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，提示PDLLA/PLLA膜降解速度相對更慢，能在缺損區(qū)愈合過程中提供良好的支撐屏蔽和成骨空間而不引起炎癥反應(yīng)，安全性較好。Micro-CT三維重建結(jié)果顯示，手術(shù)后8周和12周，實驗組動物和對照組動物缺損區(qū)域新生骨多于空白組，骨微觀參數(shù)BV/TV、BMD和Tb.N明顯高于空白組，證明PLA膜能促進下頜骨骨缺損愈合。手術(shù)后8周，實驗組動物新生骨BV/TV、BMD高于對照組動物，且隨著時間推移至手術(shù)后12周時，實驗組動物和對照組動物新生骨的成骨量有顯著性的增加，提示PLA膜有明顯的刺激成骨作用，有利于促進骨創(chuàng)愈合。手術(shù)后12周時兩組BV/TV、BMD和Tb.N無顯著差異，提示PDLLA/PLLA膜的促進骨創(chuàng)愈合效果與目前臨床廣泛應(yīng)用的Guidor可吸收膜相當(dāng)。組織學(xué)HE染色觀察到，手術(shù)后8周、12周實驗組動物缺損區(qū)新生骨小梁周圍細胞多于空白組動物，且實驗組動物缺損區(qū)觀察到血管生成，提示PDLLA/PLLA膜具有良好的促成骨細胞、破骨細胞和血管生成的作用。但同時，HE染色也觀察到在12周時，實驗組動物缺損區(qū)中央仍能見到少量未降解完全的PDLLA/PLLA膜材料，其降解速率比預(yù)期稍慢，因此需要做進一步調(diào)整，如調(diào)整PDLLA和PLLA混合比例或加入改性劑等。同時，相比于Guidor膜，PDLLA/PLLA膜具有更好的可塑性，方便根據(jù)骨缺損出情況進行塑形，使之與骨缺損處更加貼合。

需要指出的是，PLA膜的成骨機制是主要是骨傳導(dǎo)作用，一般認為可降解生物材料其本身結(jié)構(gòu)或降解產(chǎn)物所產(chǎn)生的骨誘導(dǎo)效果微乎其微，主要起骨誘導(dǎo)作用的是生長因子、激素和藥物。因此，以PLA膜為載體應(yīng)用于GBR手術(shù)的效果值得研究?？偟恼f來，本研究對可降解新型PDLLA/PLLA膜進行了初步動物體內(nèi)實驗研究，證實該材料具備良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，維持了骨缺損空間，促進了骨缺損修復(fù)，但作為膜材料用于臨床還有待進一步研究。

綜上所述，PDLLA/PLLA膜呈現(xiàn)出了良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，是一種良好的屏障膜材料，具有臨床應(yīng)用前景。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。