摘 要： 旨在通過使用恩雜魯胺探究雄激素受體（AR）對山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響。本研究首先對山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，然后利用顯微鏡觀察和CCK8探究顆粒細(xì)胞的恩雜魯胺適合培養(yǎng)濃度；之后將試驗(yàn)分為3個組，即空白對照組（不做處理）、陰性對照組（DMSO處理）和試驗(yàn)組（恩雜魯胺處理），每個組均設(shè)置3個重復(fù)；然后利用EDU檢測顆粒細(xì)胞的增殖情況，使用Caspase3活性與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測顆粒細(xì)胞的凋亡情況，并利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測顆粒細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，AR抑制劑恩雜魯胺能夠顯著地抑制顆粒細(xì)胞的增殖和降低顆粒細(xì)胞中CCND1、PCNA和MKI67基因的mRNA水平，并且還能夠顯著抑制CCND1、PCNA和β-catenin蛋白的表達(dá)；此外，恩雜魯胺還能夠促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，顯著提高山羊卵泡顆粒細(xì)胞中BAX和BCL2的mRNA水平，但不影響B(tài)AX和BCL2的蛋白表達(dá)，另外恩雜魯胺雖然沒有影響CASP3基因的mRNA水平但能夠提高Caspase 3的活性。這些結(jié)果表明，恩雜魯胺抑制AR活性后能夠影響顆粒細(xì)胞中β-catenin、PCNA、CCND1、Caspase 3等的表達(dá)，參與調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡。

關(guān)鍵詞： 山羊；顆粒細(xì)胞；AR；恩雜魯胺；增殖凋亡

中圖分類號： S827.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2022-10

收稿日期：2023-09-18

基金項目：廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2023KJCX004）；廣東省南方現(xiàn)代草牧業(yè)（羊）創(chuàng)新團(tuán)隊（2023KJ127）；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳項目（2022-XPY-00-009）；韶關(guān)市仁化縣牛羊產(chǎn)業(yè)園項目（GDSCYY2021-018）

作者簡介：董書餐（1999-），男，云南梁河人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： dsc15184989294@163.com

*通信作者：柳廣斌，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： gbliu@scau.edu.cn

The Effect of the Androgen Receptor Inhibitor Enzalutamide on Proliferation and Apoptosis of Goat Ovarian Granulosa Cells

DONG" Shucan， MAO" Shuaixiang， WU" Cuiying， LI" Yaokun， SUN" Baoli， GUO" Yongqing， DENG" Ming， LIU" Dewu， LIU" Guangbin*

（College of Animal Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the effects of androgen receptor （AR） on goat granulosa cell proliferation and apoptosis using enzalutamide. Firstly， granulosa cells from goats were isolated and subjected to in vitro culture. The suitable concentration of enzalutamide for cell culture was determined by microscopic observation and CCK8 assay. The experiment was then divided into 3 groups： blank control group （no treatment）， negative control group （treated with DMSO）， and experimental group （treated with enzalutamide）. Each group was set up with 3 replicates. Cell proliferation was detected using the EDU assay， while cell apoptosis was assessed using Caspase3 activity and apoptosis detection kits. The expression of genes and proteins related to cell proliferation and apoptosis was evaluated using quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blot analysis. The results showed that the AR inhibitor， enzalutamide， significantly inhibited cell proliferation and reduced the mRNA levels of CCND1， PCNA， and MKI67 in granulosa cells. It also suppressed the protein expression of CCND1， PCNA， and β-catenin. Additionally， enzalutamide promoted apoptosis in goat granulosa cells， as evidenced by increased mRNA levels of BAX and BCL2， without affecting their protein expression. Furthermore， enzalutamide， while not affecting the mRNA level of CASP3， enhanced Caspase3 activity. These findings suggest that enzalutamide， by inhibiting AR activity， can modulate the expression of β-catenin， PCNA， CCND1， Caspase 3， and other genes involved in the regulation of granulosa cell proliferation and apoptosis.

Key words： goat; granulosa cell; androgen receptor; enzalutamide; proliferation apoptosis

*Corresponding author：LIU Guangbin， E-mail： gbliu@scau.edu.cn

繁殖性能是衡量家畜生產(chǎn)水平的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，直接影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，提高家畜的繁殖性能對于促進(jìn)我國畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。卵泡發(fā)育是影響雌性哺乳動物繁殖性能的重要因素之一［1］。在雌性哺乳動物剛出生時，卵巢擁有大量的卵泡儲備，然而隨著動物的生長發(fā)育，體內(nèi)的卵泡逐漸凋亡閉鎖，僅有少量的優(yōu)勢卵泡能夠破裂排出可用于受精的卵母細(xì)胞，因此動物的卵泡發(fā)育并不是一個高效的過程［2-4］。了解卵泡發(fā)育的機(jī)制對于提高動物的繁殖性能具有重要意義。卵泡主要由顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及膜細(xì)胞組成［5］。顆粒細(xì)胞在卵泡的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其通過間隙連接與卵母細(xì)胞和膜細(xì)胞進(jìn)行信號傳遞和物質(zhì)交換，還可以通過旁分泌調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長［6］。此外，顆粒細(xì)胞還能夠表達(dá)促卵泡激素、黃體生成素/絨毛膜促性腺激素等多種激素的受體從而使初級卵泡對性腺軸激素具有應(yīng)答功能［7］。許多研究表明，顆粒細(xì)胞的凋亡是造成卵泡閉鎖的重要因素之一［8-9］。因此探究顆粒細(xì)胞的增殖凋亡機(jī)制對于全面了解卵泡發(fā)育具有重要意義。

雄激素受體（androgen receptor， AR）屬于核受體超家族中的類固醇受體，能夠與雄激素結(jié)合作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的表達(dá)［10］。通過對不同發(fā)育階段的卵泡進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)AR基因表達(dá)貫穿卵泡發(fā)育的全過程，并在卵泡發(fā)育不同階段呈現(xiàn)出不同表達(dá)趨勢，主要表現(xiàn)為在大卵泡中低表達(dá)，而在小卵泡中高表達(dá)，表明AR可能參與調(diào)控卵泡的發(fā)育［11-12］。卵泡顆粒細(xì)胞AR特異性敲除小鼠表現(xiàn)出卵泡閉鎖率高、繁殖力低等情況［13］。此外，在豬卵泡顆粒細(xì)胞中AR能夠與miR-126互作參與調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞中促卵泡生成素受體的表達(dá)［14］。這些結(jié)果表明AR在卵泡顆粒細(xì)胞中發(fā)揮著重要功能。恩雜魯胺（enzalutamide）是一種AR拮抗劑，能夠與雄激素競爭性結(jié)合AR使其失去轉(zhuǎn)錄活性，因此能夠被用于AR功能的探索［15］。

探究AR在卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡中的作用對于全面了解卵泡發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。本研究通過利用恩雜魯胺探索AR在卵泡發(fā)育過程中對顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響，以期為全面了解卵巢卵泡發(fā)育機(jī)制和卵泡相關(guān)疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 山羊卵泡顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

山羊屠宰后找到卵巢組織并取下卵巢，然后分別在75%的酒精和含2%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的生理鹽水中滅菌，之后放入37℃含2%雙抗溶液的生理鹽水中保存運(yùn)輸?；氐綄?shí)驗(yàn)室后在已提前30 min紫外滅菌的生物安全柜中分離卵泡顆粒細(xì)胞。簡而言之，首先，對運(yùn)輸回來的卵巢進(jìn)行消毒，結(jié)束后將卵巢放入37℃含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，然后使用注射器刺破卵泡使卵泡中的顆粒細(xì)胞釋放出來，之后收集DMEM培養(yǎng)液并過70 μm的細(xì)胞篩，過篩結(jié)束后室溫靜置15 min；然后1 000 r·min-1條件下離心10 min，離心結(jié)束后棄去上清，使用3 mL含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離心并棄上清；接著使用10 mL完全培養(yǎng)基（配方：90% DMEM/F12+10% FBS+1% 雙抗+1% 100×ITS-A）重懸細(xì)胞，并將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；最后將細(xì)胞放在5% CO2，飽和濕度和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去未貼壁的細(xì)胞并更換新的完全培養(yǎng)基，之后每48 h更換一次培養(yǎng)基直至細(xì)胞長到80%左右后進(jìn)行細(xì)胞傳代與凍存。

1.2 CCK8細(xì)胞增殖檢測

將生長狀態(tài)良好的山羊卵泡顆粒細(xì)胞接種于96孔板中，其中96孔板外圍一圈孔只加入完全培養(yǎng)基不加入細(xì)胞，防止中央液體的揮發(fā)影響試驗(yàn)結(jié)果，細(xì)胞鋪板完成后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分為試驗(yàn)組與對照組，試驗(yàn)組分為4個不同濃度梯度處理的恩雜魯胺培養(yǎng)液培養(yǎng)，恩雜魯胺濃度分別為20、40、60、80 μmol·L-1，對照組則采用恩雜魯胺的溶劑DMSO處理，每組對照組的DMSO加入量與恩雜魯胺溶液加入量相同，每個處理至少有4個生物學(xué)重復(fù)。然后在24、48、72 h時向每個細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入10 μL的CCK8試劑，1 h后用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)液450 nm處的吸光度值，吸光度值越大代表細(xì)胞的增殖活力越強(qiáng)。

1.3 EDU細(xì)胞增殖檢測

按照Cell-LightTM EDU Apollo In Vitor Kit說明書進(jìn)行EDU細(xì)胞增殖檢測。簡而言之，將配置好的EDU溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育2 h，取出培養(yǎng)液，然后使用細(xì)胞固定液對細(xì)胞進(jìn)行固定30 min，通透液通透10 min，PBS洗滌。然后進(jìn)行Apollo染色，PBS洗滌之后，使用Hoechst染料進(jìn)行細(xì)胞核DNA染色。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.4 活細(xì)胞Caspase3活性與細(xì)胞凋亡檢測

將細(xì)胞接種于24孔板中，使用恩雜魯胺處理后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS洗滌細(xì)胞。然后加入192 μL的Annexin V-mCherry Binding Buffer，5 μL的Annexin V-mCherry，2 μL的Hoechst 33342和1 μL的GreenNucTMcaspase3 Substrate，輕輕混勻，室溫避光孵育30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光發(fā)光情況。

1.5 RNA的提取與cDNA的合成

使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。首先，使用0.25%的胰酶消化、離心收集細(xì)胞，棄去上清并加入800 μL的Trizol，室溫裂解5 min，之后加入160 μL氯仿，離心收集上層水相，然后加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，離心棄去異丙醇，75%乙醇洗滌沉淀，干燥，無菌無酶水溶解，-80℃保存。細(xì)胞總RNA按照艾科瑞生物公司的EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取1μg總RNA使用gDNA Clean Reaction Mix、EVO M-MLV RT Reaction Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s。

1.6 引物的設(shè)計與合成

登錄NCBI搜索山羊PCNA、CCND1、MKI67、BAX、BCL2、CASP3和β-ACTIN基因的CDS區(qū)序列，使用NCBI中的pick primers在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計，設(shè)計時設(shè)置引物至少跨一個外顯子，以防止基因組干擾。所有引物均由生工生物工程有限公司合成，合成引物及序列見表1。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR （qRT-PCR）

以cDNA為模板，按照諾維贊ChamQ SYBR qPCR Master Mix （Low ROX Premixed）說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix （Low ROX Premixed）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。以β-Actin作為內(nèi)參，結(jié)果使用2-△△CT法進(jìn)行計算。

1.8 蛋白提取與Western blot檢測

按照RIPA裂解緩沖液Ⅲ的說明提取細(xì)胞總蛋白，然后用改良型BCA蛋白檢測試劑盒定量檢測總蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白濃度使用 RIPA裂解緩沖液Ⅲ調(diào)整每個樣品的蛋白以使各樣品濃度大概一致，然后向每個蛋白樣品中加入 4×Protein SDS PAGE loading buffer，在100℃下變性10 min。變性蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至 0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用 Quick blockTM blocking buffer for western blot封閉10 min后，使用1×TBST洗膜5次，每次5 min。洗膜結(jié)束后，向PVDF膜中加入一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜，洗膜，之后用相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h，洗膜，最后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在對應(yīng)儀器中觀察蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （SD）” 表示，至少有 3 個獨(dú)立重復(fù)。兩組或多組之間的差異分析分別采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，所有分析均在GraphPad Prism9中完成?！?”代表P＜0.05，“**”代表P＜0.01，“***”代表P＜0.001，“****”代表P＜0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AR抑制劑恩雜魯胺對顆粒細(xì)胞增殖的影響

為了探索恩雜魯胺最適細(xì)胞培養(yǎng)濃度，分別使用含20、40、60、80 μmol·L-1濃度的恩雜魯胺對山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。藥物處理48 h后，在顯微鏡下對山羊卵泡顆粒細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行觀察，由圖1可知，隨著恩雜魯胺濃度的升高，山羊卵泡顆粒細(xì)胞的密度逐漸降低，說明在該試驗(yàn)中恩雜魯胺對卵泡顆粒細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。

此外，為了探索不同時間點(diǎn)條件下恩雜魯胺對山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響，還使用CCK8對上述4個恩雜魯胺培養(yǎng)濃度條件下的山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測。由圖2可知，與對照組相比，不同濃度的恩雜魯胺均能在不同程度上抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。且隨著濃度的提升，細(xì)胞的增殖活性逐漸降低，特別在80 μmol·L-1濃度條件下，顆粒細(xì)胞的增殖活性最差，這可能是由于DMSO濃度過高影響了細(xì)胞的增殖。結(jié)合細(xì)胞生長狀態(tài)觀察及CCK8檢測結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選用40 μmol·L-1的恩雜魯胺細(xì)胞培養(yǎng)濃度對山羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在48 h時收樣。

2.2 EDU檢測結(jié)果分析

EDU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時替代胸腺嘧啶插入正在復(fù)制的DNA鏈中，通過使用Apollo熒光染料與結(jié)合到DNA雙鏈上的EDU特異性反應(yīng)，利用免疫熒光技術(shù)能夠檢測出細(xì)胞的增殖狀況，其相較于CCK8技術(shù)，能夠更直觀的反映出細(xì)胞的增殖活力。由圖3可知，在48 h時，與空白對照和DMSO對照組相比，40 μmol·L-1恩雜魯胺處理條件下山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖活力被顯著抑制（P＜0.01），表明AR活性能夠影響山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖能力。

2.3 山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)分析

細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的基因表達(dá)調(diào)控，研究測定了40 μmol·L-1恩雜魯胺培養(yǎng)液對卵泡顆粒細(xì)胞部分增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響。如圖4A所示，與空白對照和DMSO對照組相比，恩雜魯胺處理顯著降低了山羊卵泡顆粒細(xì)胞中MKI67 （P＜0.01）、CCND1 （P＜0.01）和PCNA （P＜0.01）基因mRNA水平。蛋白表達(dá)檢測結(jié)果顯示（圖4B），恩雜魯胺能夠顯著抑制PCNA （P＜0.01）和CCND1 （P＜0.05）蛋白的表達(dá)。WNT信號通路在細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要功能，β-catenin作為WNT經(jīng)典信號通路中的關(guān)鍵蛋白，能夠通過影響下游TCF/LEF家族基因的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖［16-18］。因此，研究對β-catenin的蛋白水平變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，與空白對照和DMSO對照組相比，40 μmol·L-1恩雜魯胺處理組的β-catenin蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，AR活性被抑制后，細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯會被抑制，從而使顆粒細(xì)胞的增殖受到影響。

2.4 恩雜魯胺促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

了解卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控對于理解卵泡發(fā)育具有重要意義［19］。本研究使用了活細(xì)胞Caspase3活性與Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒來探究AR抑制劑對顆粒細(xì)胞凋亡的影響。由圖5可知，與空白對照和DMSO處理組相比，恩雜魯胺處理組的山羊卵泡顆粒細(xì)胞擁有較多的綠色熒光與紅色熒光，Caspase3活化比率顯著上升（P＜0.05），表明AR抑制劑恩雜魯胺能夠誘導(dǎo)山羊卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析

使用qRT-PCR探究恩雜魯胺對山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因BAX、BCL2和CASP3基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖6A所示，與空白對照相比，恩雜魯胺處能夠顯著提高BAX（P＜0.01）基因的mRNA水平，并降低BCL2（P＜0.01）基因的mRNA表達(dá)；而與DMSO對照相比，恩雜魯胺能夠同時提高BAX （P＜0.01）和BCL2（P＜0.01）基因的mRNA表達(dá)水平；此外，結(jié)果顯示，CASP3基因的mRNA水平在3組間無顯著差異。研究還對BAX和BCL2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測（圖6B），發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，DMSO和恩雜魯胺處理條件下BCL2蛋白表達(dá)均顯著下降，但與DMSO處理組相比，恩雜魯胺處理對BCL2蛋白表達(dá)無顯著影響，表明，DMSO的存在可能能夠影響B(tài)CL2蛋白的表達(dá)。BAX蛋白檢測結(jié)果表明，BAX蛋白的表達(dá)在3組間差異不顯著。總的來說，這些結(jié)果表明，40μmol·L-1的恩雜魯胺培養(yǎng)液并不顯著影響山羊卵泡顆粒細(xì)胞中BAX和BCL2蛋白表達(dá)。

3 討 論

卵泡的發(fā)育是一個十分復(fù)雜的過程，在這個過程中，顆粒細(xì)胞在不斷的增殖分化與凋亡，從而響應(yīng)卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞的增殖凋亡受到眾多基因的調(diào)控［20-22］。研究發(fā)現(xiàn)，AR的表達(dá)貫穿卵泡發(fā)育的整個過程，但在小卵泡中表達(dá)量高，在大卵泡中表達(dá)量較低。此外，異常的AR活性可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙和多囊卵巢的形成［23］。因此，這些研究表明，AR可能參與卵泡發(fā)育的調(diào)控，且在其中發(fā)揮重要作用。

AR在動物的生理活動中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。在雄性動物中，AR能夠調(diào)節(jié)精子的生成、睪丸功能的維持以及調(diào)控骨骼肌肉的發(fā)育等［24-26］；在雌性動物中，AR參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵過程，還在子宮內(nèi)膜和子宮平滑肌中發(fā)揮作用，并參與調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、子宮收縮和妊娠等重要生理過程［27-29］。AR的功能發(fā)揮依賴于雄激素的存在，作為類固醇受體，其通過與雄激素結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與受體形成復(fù)合物，這個復(fù)合物進(jìn)一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而影響細(xì)胞的功能和表型［30-31］。恩雜魯胺是一種AR抑制劑，其能夠阻斷雄激素與AR的結(jié)合，抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性并促進(jìn)AR的降解。在這項研究中，利用恩雜魯胺抑制卵泡顆粒細(xì)胞中的AR的活性后，CCK8和EDU結(jié)果顯示卵泡顆粒細(xì)胞的增殖活性被抑制，表明AR能夠參與調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的增殖活性。MKI67是一種標(biāo)志細(xì)胞增殖的核蛋白，高M(jìn)KI67表達(dá)通常表示細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，而低MKI67表達(dá)則可能表示細(xì)胞停止或減緩增殖［32］。抑制AR活性后，細(xì)胞增殖相關(guān)基因MKI67的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，表明細(xì)胞的增殖狀態(tài)受到抑制，這與EDU和CCK8的檢測結(jié)果是一致的。說明顆粒細(xì)胞中AR的活性能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活性。

細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期的調(diào)控。研究表明，細(xì)胞周期進(jìn)程由一個復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中PCNA在細(xì)胞周期中起到了重要的調(diào)控作用［33］。PCNA是DNA聚合酶δ和ε的輔助因子，在S期DNA復(fù)制過程中，PCNA結(jié)合到DNA鏈上形成一個滑動夾持結(jié)構(gòu)，促進(jìn)DNA聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合并提高其活性［34-35］。此外，PCNA還能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶、細(xì)胞周期抑制蛋白等蛋白相相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程［36-37］。本研究發(fā)現(xiàn)抑制AR活性能夠降低PCNA和CCND1基因的表達(dá)，說明AR能夠調(diào)節(jié)PCNA和CCND1基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而參與調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖。細(xì)胞的增殖還受到多條信號通路的調(diào)控，其中WNT信號通路在卵泡發(fā)育過程中扮演重要角色，抑制WNT信號通路會導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良，早期閉鎖卵泡增多，同時還會造成卵母細(xì)胞分化異常，影響卵泡質(zhì)量［38-40］。β-catenin是經(jīng)典WNT信號通路的中心蛋白，當(dāng)WNT信號被激活時，β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，促進(jìn)CCND1、c-MYC等基因的表達(dá)從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，調(diào)控卵泡的生長發(fā)育［41］。使用恩雜魯胺抑制AR活性后，山羊卵泡顆粒細(xì)胞中的β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，表明AR可能參與經(jīng)典WNT信號通路的調(diào)控，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

卵泡發(fā)育的過程中常常伴隨著顆粒細(xì)胞的凋亡，適度的顆粒細(xì)胞凋亡對于優(yōu)勢卵泡的選擇、營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)以及生長因子的調(diào)節(jié)具有積極作用，但凋亡過多或凋亡缺失都可能會對卵泡發(fā)育產(chǎn)生不利影響［42-43］。因此，維持適度的顆粒細(xì)胞凋亡水平是卵泡發(fā)育正常進(jìn)行的關(guān)鍵之一。研究表明，AR在細(xì)胞的生存和死亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Huang等［44］發(fā)現(xiàn)沉默AR的表達(dá)能夠促進(jìn)腎缺血再灌注模型小鼠的腎臟Caspase 3的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而Lin等［45］研究表明AR能夠通過PIRH2-p53-p21促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，AR對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)受到細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞外刺激影響。在我們的研究中，恩雜魯胺抑制AR活性后，山羊卵泡顆粒細(xì)胞中Caspase 3蛋白活性增加，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻變多，細(xì)胞凋亡比率升高，表明恩雜魯胺抑制AR活性后能夠促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。但AR對山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控似乎并不依賴于BCL2家族成員介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，這是因?yàn)橐种艫R活性后雖然上調(diào)了BAX和BCL2的mRNA水平，但并沒有改變BAX和BCL2蛋白的表達(dá)。因此，AR可能通過死亡受體凋亡途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑調(diào)控山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞中AR的活性能夠影響β-catenin、PCNA、CCND1和Caspase 3等基因的表達(dá)從而抑制山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

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（編輯 郭云雁）