摘 要： 旨在通過分析鵝胚心臟在綠光光照刺激下的基因表達差異，挖掘心臟發(fā)育的候選基因。本研究將512枚鵝種蛋，隨機均分在正常黑暗孵化以及補充綠光的兩臺孵化機中，每臺孵化機內(nèi)放置4層（64枚·層-1），綠光孵化機提供15 min開燈和15 min關(guān)燈的間歇光照。在孵化第13、16、20、24、28和30天時，每組隨機挑選種蛋8枚，稱取胚胎重量，分離胚胎心臟組織并稱重；采集孵化第13天的胚胎心臟組織（每組各3），進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq），篩選差異表達基因（DEGs）并進行功能富集分析，鑒定與綠光促進心臟發(fā)育相關(guān)的候選基因。并通過熒光定量PCR（qRT-PCR方法）驗證測序結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明：綠光顯著提高16和30胚齡胚重比例（胚胎重/入孵蛋重×100）（Plt;0.05），以及13和16胚齡心臟指數(shù)（心臟重/胚胎重×100）（Plt;0.05）。心臟轉(zhuǎn)錄組測序分析共篩選出1 643個DEGs。隨機選擇 7個DEGs 進行 RT-qPCR 驗證，表達趨勢與測序結(jié)果一致。功能富集分析表明，DEGs 主要涉及PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路等通路，最終篩選出GATA4、GATA5、Smad4和GHR這4個候選基因。對它們在不同胚齡階段心臟組織中的mRNA表達量進行分析，其表達模式進一步表明了其在綠光調(diào)控心臟發(fā)育過程中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，鵝蛋孵化期綠光處理促進了胚胎和心臟發(fā)育，進一步通過心臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，鑒定到了4個鵝胚心臟發(fā)育候選基因 GATA4、GATA5、Smad4和GHR，為鵝胚心臟組織發(fā)育的分子調(diào)控機制提供了線索，并為綠光應(yīng)用于鵝種蛋孵化提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 鵝；綠光；孵化；心臟；轉(zhuǎn)錄組；GATA4

中圖分類號：S835.2

文獻標志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-1978-11

收稿日期：2023-09-26

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-42-20）；國家自然科學(xué)基金青年項目（32202622）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（21）2013）

作者簡介：陳 哲（1982-），男，山東泰安人，副研究員，博士，主要從事動物繁育與環(huán)境控制研究，E-mail：chenzzju@163.com

*通信作者：閆樂艷，主要從事家禽繁殖調(diào)控與健康養(yǎng)殖研究，E-mail：yanleyan198469@126.com

Study on Candidate Genes for Green Light Affecting Early Development of Goose Embryo Heart Based on Transcriptome Sequencing

CHEN" Zhe1，2， QU" Xiaolu3， GUO" Binbin1，2， SUN" Xuefeng1，2， YAN" Leyan1，2*

（1.Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，

China;

2.Key Laboratory for Crop and Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture

and Rural Affairs， Nanjing 210014，" China;

3.Agricultural Genomics Institute at Shenzhen，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen 518100，" China）

Abstract：" The aim of this study was to identify candidate genes for heart development in goose embryos by analyzing the gene expression differences in embryonic hearts tissue under green light stimulation. The 512 goose eggs were randomly divided equally into green light and dark incubators， with 4 layers and 64 eggs per layer placed in each incubator. During the entire incubation period， the green light incubator provided intermittent light regimen of 15 minutes on and 15 minutes off. On the 13， 16， 20， 24， 28， and 30 day of incubation， 8 eggs were randomly selected from each group， the embryo weight was measured， and the embryonic heart tissue was separated and weighed. The embryonic heart tissues were collected at day13 of incubation， and transcriptome sequencing （RNA-Seq） were performed. Differentially expressed genes （DEGs） were screened， and subjected to functional enrichment analysis to identify candidate genes related to green light promoting heart development. And the reliability of the sequencing results was validated using fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. The green light significantly increased the proportion of embryo weight at 16 and 30 embryonic ages （embryo weight/hatched egg weight×100） （Plt;0.05）， and the heart index （heart weight/embryo weight×100） at 13 and 16 embryonic ages in the green light group were significantly higher than individuals in the dark group （Plt;0.05）. A total of 1 643 DEGs were screened from the green light group and the dark group， 7 DEGs were randomly selected for RT-qPCR validation， and the expression trend was consistent with the sequencing results. Enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in the PI3K-Akt signaling pathway， AMPK signaling pathway， and other pathways. Four candidate genes： GATA4， GATA5， Smad4 and GHR were ultimately screened out. Their expression in heart tissues at different embryonic ages were analyzed to further validated their regulatory role in heart development. Through the analysis of transcriptomic data of heart tissue， we identified GATA4， GATA5， Smad4 and GHR as candidate genes for goose embryonic heart development， which provide clues to the molecular regulatory mechanism of green light on embryonic heart development， and provide a theoretical basis for the application of green light in goose egg hatching.

Key words： goose; green light; incubation; heart; transcriptome; GATA4

*Corresponding author：YAN Leyan， E-mail：yanleyan198469@126.com

商業(yè)化生產(chǎn)中，禽蛋通常在閉燈黑暗環(huán)境下進行孵化。但在自然孵化過程中，母禽會離巢采食和飲水，使得種蛋會接受一部分外界的光照刺激［1］。禽類對光照敏感，因此在家禽生產(chǎn)中，光照調(diào)控逐漸成為調(diào)節(jié)家禽生產(chǎn)性能的重要手段［2］。在肉雞、蛋雞、鵪鶉和火雞上的研究表明，在孵化期給予禽蛋適宜的光照刺激可以影響胚胎肌肉發(fā)育、改變出雛窗口期，并對雛禽生長等具有重要影響，且對家禽出殼后健康及福利生長具有長期效應(yīng)［3-8］。胚胎在孵化第2天便可以感受到光刺激［9-10］。進一步研究表明，不同波長的光線調(diào)控禽類胚胎發(fā)育存在區(qū)別，而單色綠光是促進胚胎發(fā)育的優(yōu)勢光色［11-12］。綠光改善禽蛋孵化效率的調(diào)控機制目前還不明確，本課題組最近的一項研究表明，綠光可能通過影響肝臟糖代謝從而促進胚胎發(fā)育［13］，是否存在其它調(diào)控機制還需要進一步的研究。

在禽類胚胎中，心臟是第一個發(fā)育的功能性器官［14］，孵化第2天可見發(fā)育成型并出現(xiàn)節(jié)律性泵動；伴隨卵黃膜血管的發(fā)育，將血液分配到各種組織以滿足氧氣和營養(yǎng)需求，維持胚胎體循環(huán)和能量代謝過程。研究發(fā)現(xiàn)，孵化期1～18 d單色綠光照射（12L：12D）可極顯著提升初生肉種雞心臟相對重量［15］。此外，光照對胚胎心率水平也有潛在影響，暴露在光照條件下的體外心臟組織［16］以及光照條件下的雞胚胎心臟心率都有顯著增加［9］。因此推測，孵化期光照可以調(diào)節(jié)胚胎心臟發(fā)育，但具體的作用機制還不明確。且前期研究主要關(guān)注光照對孵化后期或出殼當天心臟的影響［12，15］，但對心臟發(fā)育全程，尤其是胚胎早期心臟發(fā)育影響的研究較少。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）已經(jīng)在家禽研究領(lǐng)域成熟應(yīng)用，是挖掘特定環(huán)境下差異表達基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效工具［17］。我國肉鵝出欄量占世界總出欄量的94%。但鵝種蛋重量大、孵化時間長、入孵操作程序繁瑣，相比于雞、鴨種蛋，鵝種蛋孵化率不高且不穩(wěn)定，因此開發(fā)有效的孵化技術(shù)手段提高鵝種蛋孵化率非常重要。本研究擬分析綠光對鵝種蛋孵化的影響；同時，針對在鵝種蛋孵化期應(yīng)用綠光，采用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)篩選差異表達基因，揭示綠光刺激誘導(dǎo)胚胎心臟發(fā)育的信號通路，發(fā)掘胚胎心臟發(fā)育關(guān)鍵候選基因，為綠光在鵝種蛋孵化中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

512枚泰州鵝種蛋（蛋重143.7～152.5 g，均重（147.6±0.15） g）購自泰州金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，被隨機分配到2個微電腦全自動控制孵化機中（型號：HX-100，南京市恒信孵化設(shè)備有限公司）。對照組為正常的不補充光照的黑暗組（D組，256枚），試驗組補充綠色光照（G組，256枚）。每臺孵化機內(nèi)放置4層蛋盤（設(shè)為4個重復(fù)），每層64枚。光源由LED燈帶（珠海雷士照明有限公司）提供，蛋殼表面光照強度約為36 W/m2。采用15 min開燈和15 min關(guān)燈的間歇光照制度［18］。第1～28天每90 min翻蛋一次，第28天停止翻蛋并轉(zhuǎn)移到出雛機中。孵化第7和18天照蛋，剔除無精蛋和死胚蛋。孵化試驗于2021年3月10日至4月9日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所孵化實驗室完成。

在孵化第13（E13）、16（E16）、20（E20）、24（E24）、28（E28）和30天（E30）時，每組從每層的蛋盤中隨機挑選種蛋2枚，即每組共8枚，破殼后將胚胎表面的膜等剝離后稱取重量；解剖胚胎，分離心臟組織，排出心臟內(nèi)血液后稱重；采集心臟組織樣置于液氮中速凍，－80℃保存，用于后續(xù)的熒光定量PCR分析。對各時間段胚重比例（胚胎重/入孵蛋重×100）和心臟指數(shù)（心臟重/胚胎重×100）分析后，選取心臟指數(shù)差異最顯著時間段（E13）的心臟組織樣，每組各3個，－80℃保存用于開展轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 主要試劑

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）、熒光定量PCR試劑盒（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR儀（Bio-Rad）購自美國Bio-Rad公司。實時熒光定量PCR儀（ABI 7500）購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 鵝胚心臟組織轉(zhuǎn)錄組測序

采用Trizol法提取E13階段鵝胚心臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，結(jié)合核酸分析儀測定總RNA的純度和濃度，選用OD值為1.8～2.0的RNA為模板，-80 ℃保存。整個轉(zhuǎn)錄組文庫的制備和測序在Sangon Biotech（中國，上海）進行。對測序合格的RNA使用NEBNext UltraTM RNA Library Pre Kit制備cDNA文庫，利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量，基于Illumina Hiseq平臺，對質(zhì)檢合格的文庫進行測序，回收測序數(shù)據(jù)。

1.4 測序數(shù)據(jù)的處理與分析

對獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）通過FastQC軟件進行質(zhì)量評估，使用Trimmomatic消除接頭和低質(zhì)量reads，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。并使用Trinity軟件進行轉(zhuǎn)錄本組裝拼接，完整 Reads 使用Bowtie2（-bowtie2-mismatch-rate）與鵝參考基因組進行比對?；谏鲜霰葘Y(jié)果，對各個樣本中比對到參考基因組的各unigene（非重復(fù)序列）上的Reads進行定量，并進行FPKM（fragments per kilo base of exon model per million mapped reads）值的轉(zhuǎn)換，從而獲取各條unigene的表達水平?；诙康玫降母鱱nigene的FPKM值進行樣品間差異基因比較，利用DEGSeq2進行基因差異表達分析，將qlt;0.05和log2（fold change）≥1設(shè)置為差異表達基因的閾值，獲得D組和G組的差異表達基因。

對獲得的顯著差異表達基因利用基因本體論分析（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。并導(dǎo)入KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進行富集分析，確定顯著差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）驗證

采用Trizol法提取不同胚齡階段心臟組織的總RNA。利用HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）將純化的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，選取 GATA4、GATA5、生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）、Smad4、FOX3、CYP11B1、Lipocalin等7個差異表達基因，參照GenBank數(shù)據(jù)庫鴻雁（Anser cygnoides）基因組中的相應(yīng)基因序列，使用Primer 5.0 軟件（www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/Primer-blast/）Primer-BLAST軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/Primer-blast/）設(shè)計基因特異性引物，并以β-actin為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

使用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems， 美國）進行熒光定量驗證。反應(yīng)體系共 20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR 擴增程序：預(yù)變性階段為 95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)為 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（40個循環(huán)）；熔解曲線為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品進行 3 次生物學(xué)重復(fù)。

除用E13的心臟組織總RNA作為模板驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性外，還提取不同胚齡心臟組織的RNA，對GATA4、GATA5、GHR、Smad4基因的表達量進行檢測。每個樣本重復(fù)分析3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔCt法對基因相對表達量進行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標準差”表示。利用 SPSS 22.0 軟件對所得表達量進行t檢驗分析或單因素方差分析（One-way ANOVA），以*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。采用GraphPad Prism 8 軟件進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 綠光光照對鵝胚及心臟重的影響

孵化期綠光處理對鵝胚胚胎及心臟重的影響見圖1。對孵化期不同胚齡鵝胚及其心臟稱重的結(jié)果顯示，綠光對鵝胚胚胎發(fā)育有明顯的促進作用，尤其在種蛋孵化至16胚齡和30胚齡時，綠光組鵝胚的胚重比例顯著高于在黑暗條件下孵化的鵝胚的胚重比例（Plt;0.05，圖1A）；其它胚胎階段綠光對胚胎發(fā)育也有促進作用，但與黑暗組的差異不顯著。而心臟指數(shù)在鵝胚孵化至13胚齡和16胚齡時均顯著高于黑暗組中孵化的鵝胚的心臟指數(shù)（Plt;0.05，圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

兩個組分別取孵化期E13心臟組織樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果如表2所示，平均每個樣品產(chǎn)出8 872 758 550 bp原始數(shù)據(jù)（Raw reads），經(jīng)過質(zhì)量控制，質(zhì)控率均在90.08%，Q30堿基百分比都在94%以上。將clean reads與鵝參考基因組（Anser cygnoides）基因組進行比對，比對率為82.66%～85.01%，表明測序數(shù)據(jù)滿足后續(xù)分析的要求。

2.3 差異表達基因及功能分析

按照顯著性qlt;0.05，表達差異倍數(shù)log2Fold Change≥1.0標準，綠光處理組和對照黑暗組鵝胚心臟組織中共篩選得到1 643個差異基因（DEGs），其中842個顯著上調(diào)基因，801個顯著下調(diào)基因（圖2）。

由圖3可知，上調(diào)差異基因主要富集到在發(fā)育過程（developmental process）、細胞進程（cellular process）、代謝進程（metabolic process）、對刺激的反應(yīng)（response to stimulus）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、催化活性（catalytic activity）等GO條目。而下調(diào)差異基因富集分析結(jié)果見圖4，主要集中在代謝進程（metabolic process）、生物學(xué)過程（biological process）、發(fā)育過程（developmental process）、催化活性（catalytic activity）等GO條目。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因共富集到240個通路。圖5列出了前30個顯著富集到的通路，主要包括PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、AMPK信號通路（AMPK signaling pathway）、黏著斑（focal adhesion）、軸突導(dǎo)向（axon guidance）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）等。包含差異基因較多的通路與心臟發(fā)育和細胞發(fā)育密切相關(guān)。

2.4 差異表達基因的qRT-PCR驗證結(jié)果

隨機選取出GATA4、GATA5、GHR、Smad4、FOX3、CYP11B1、Lipocalin等7個基因進行qRT-PCR檢測。如圖6所示，E13階段GATA4、GATA5、GHR、Smad4、FOX3等5個基因在綠光組鵝胚胎心臟中的相對表達量均顯著高于黑暗組的胚胎中的表達量（Plt;0.05），而CYP11B1、""""" Lipocalin在E13階段綠光組胚胎心臟中的表達量均顯著低于黑暗組胚胎（Plt;0.05）。qRT-PCR 結(jié)果與 RNA-Seq 測序結(jié)果表達趨勢一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的真實性和準確性。

2.5 候選基因在不同胚齡心臟組織中相關(guān)基因表達量的分析

對差異表達基因進行功能注釋、通路富集和特異性篩選，篩選出GATA4、GATA5、Smad4和GHR這4個調(diào)控心臟發(fā)育的候選基因。對候選基因在黑暗組孵化期6個階段的mRNA相對表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)GATA4的mRNA表達量在E16、E20、E28和E30階段鵝胚心臟組織中均顯著性高于E13階段（Plt;0.05），而在E24階段表達有一個明顯的下降（Pgt;0.05）（圖7A）。從圖7B可以看出，GATA5的mRNA表達量與GATA4表達量在趨勢基本一致，在E16、E20、E28階段心臟組織中表達量均顯著性高于E13階段（Plt;0.05）。與13胚齡的鵝胚心臟組織相比，Smad4的表達量在20和24胚齡顯著升高（Plt;0.05），在28和30胚齡時表達量略有下降，但仍明顯高于13胚齡（Plt;0.05）（圖7C）。

此外，對GHR在各胚齡心臟組織中的相對表達量也進行了檢測，結(jié)果顯示：GHR基因的mRNA表達量隨著胚齡的增加而顯著增加（Plt;0.05），但在出殼前即30胚齡時有明顯的下降（圖7D）。

2.6 綠光處理對候選基因在30胚齡心臟組織中相關(guān)基因表達量的影響

此外，孵化期綠光處理，對30胚齡階段鵝胚心臟組織中GATA4、GATA5、Smad4以及GHR mRNA表達也進行檢測。如圖8所示，與對照的黑暗條件下孵化相比，綠光孵化的鵝胚心臟組織中GATA4、GATA5、Smad4以及GHR的表達量均無顯著差異（Pgt;0.05）。這也與綠光處理對該胚齡時心臟發(fā)育指數(shù)無明顯影響的結(jié)果一致。

3 討 論

光照是影響家禽繁殖性能的重要環(huán)境因素之一，已經(jīng)在鵝的各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)中廣泛應(yīng)用并明顯提高了鵝的產(chǎn)蛋性能［19-20］，但對于鵝種蛋孵化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，人工光照的應(yīng)用還十分缺乏。僅有前期的研究結(jié)果表明，孵化期綠光處理可能通過調(diào)控肝臟組織的糖代謝而促進胚胎發(fā)育和提高出雛性能［13］。胚胎期是心臟發(fā)育的關(guān)鍵時期，很容易受到自身基因表達變化和外界環(huán)境因素的影響而發(fā)育異常［21］。在其它禽類上的研究指出，孵化期光照處理可以調(diào)節(jié)胚胎心臟發(fā)育［15］，但具體的作用機制還不明確。

本研究對孵化期鵝蛋綠光處理后的胚胎重量和心臟重量進行分析，發(fā)現(xiàn)綠光促進胚胎發(fā)育，胚重比例高于在黑暗條件下孵化的胚重比例。綠光對心臟的發(fā)育也起到促進作用，尤其是在孵化至13胚齡和16胚齡時，心臟指數(shù)均顯著高于黑暗組中孵化鵝胚的心臟指數(shù)；但在孵化后期，對心臟指數(shù)并沒有顯著性影響。這與在肉種雞上的研究結(jié)果有些類似，即孵化期1～18 d單色綠光照射（12L：12D）顯著提升16和21胚齡雞胚心臟的重量［15］。

進一步對綠光孵化和黑暗中孵化第13天的鵝胚心臟組織進行轉(zhuǎn)錄組對比分析，篩選出1 643個差異基因，結(jié)合GO基因功能分析以及 KEGG富集分析，篩選出了GATA4、GATA5、Smad4和GHR這幾個差異表達候選基因，這些基因富集在與心臟發(fā)育和細胞發(fā)育相關(guān)的信號通路上。對不同胚齡階段心臟組織中這幾個候選基因的mRNA檢測發(fā)現(xiàn)，隨著胚齡的增加，GATA4、GATA5、Smad4和GHR的表達都呈現(xiàn)上升的趨勢。而在30胚齡時，綠光組心臟組織中這幾個基因的表達量與黑暗組并沒有明顯差異，這與綠光對于這一階段心臟指數(shù)沒有明顯影響的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，鑒定到的差異基因可能參與胚胎心血管發(fā)育和功能，是研究綠光調(diào)控鵝胚心臟發(fā)育的候選基因。

GATA4和GATA5（GATA結(jié)合蛋白4和5）是一類含鋅指的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，對正常心臟發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［22-23］。尤其是GATA4在胚胎期的作用更為重要，GATA4是心臟前體細胞出現(xiàn)的最早期標志之一［24］，在整個發(fā)育過程中表達，也在成年機體心臟中表達，缺乏GATA4的小鼠胚胎心臟形態(tài)發(fā)生缺陷，并在胚胎第8.5天死亡［25］。其基因突變可導(dǎo)致先天性心肌?。?6-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，GATA4和GATA5在各胚胎時期心臟中均有表達，且表達量呈現(xiàn)整體逐漸上升的趨勢，暗示其在鵝胚胎期心臟發(fā)育過程中均具有較為重要的作用。孵化期綠光處理后，在13胚齡時胚胎心臟指數(shù)增加的同時伴隨著GATA4和GATA5表達的增加，而在30胚齡時綠光對心臟指數(shù)以及GATA4和GATA5的表達均無明顯影響，證明GATA4和GATA5在胚胎期的心臟發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

Smads蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族受體的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Smad4是通用型的Smads，與激活的其它Smads形成異源的多聚復(fù)合物，從而發(fā)揮作用。TGF-β1/Smad4信號通路在SD大鼠胚胎心臟發(fā)育不同時期發(fā)揮著不同的作用［29］。缺失Smad4將導(dǎo)致心臟α肌動蛋白、α肌球蛋白重鏈等表達下調(diào)，心臟表現(xiàn)為小梁結(jié)構(gòu)破壞、室間隔缺損［30］，甚至導(dǎo)致胚胎死亡［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，Smad4基因表達量在孵化期綠光處理引起的心臟發(fā)育變化過程中存在差異，且隨著胚齡增加和心臟發(fā)育進程，其表達量是上升的，均提示了Smad4在鵝胚心臟發(fā)育過程中發(fā)揮了作用。

生長激素受體（GHR）是一種單鏈跨膜糖蛋白，位于動物生長軸中心位置的生長激素（GH）主要通過和靶器官的GHR相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控動物生長發(fā)育的作用［32］。在雞胚的器官發(fā)育過程中，GH和GHR均可以在胚胎的心臟中檢測到［33］。在雛鵝的心臟中也檢測到了GHR的表達，且GHR mRNA表達量的峰值出現(xiàn)在0～28 d階段，提示GHR mRNA可能主要在鵝早期生長發(fā)育階段起調(diào)節(jié)作用［34］。在鵝胚階段檢測到GHR mRNA的持續(xù)表達，但在孵化后期顯著降低，這與在雞胚胎上的結(jié)果相似，即在孵化后期和出殼后的早期階段，GH下調(diào)GHR表達，使得GHR 表達急劇下降［35］。孵化期綠光刺激不僅可以增加肌肉中GHR的表達［36］，還可以增加肝臟中GHR的表達，從而加速肌肉發(fā)育并增加胚胎重量［11］。本試驗中，在13胚齡時綠光組心臟中GHR表達高于對照的黑暗組，這與綠光促進心臟發(fā)育的結(jié)果是相符的；而在30胚齡時，綠光對心臟發(fā)育無明顯促進作用的同時對GHR mRNA的表達也無顯著影響。這些都證明了GHR對鵝胚的心臟發(fā)育也起到了重要的作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，鵝蛋孵化期綠光處理后，胚重比例和心臟指數(shù)在16胚齡時均顯著高于正常黑暗條件下孵化的鵝胚；而在30胚齡時，僅胚重比例存在顯著差異。進一步結(jié)合RNA-Seq技術(shù)，篩選出GATA4、GATA5、Smad4、GHR可能與心臟發(fā)育相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步探究種蛋孵化期綠光處理促進鵝胚和心臟發(fā)育的分子機制提供了線索，并為綠光應(yīng)用于鵝種蛋孵化提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻（References）：

［1］ 陳 哲，陳永霞，于建寧，等.光照在禽蛋孵化期的應(yīng)用和研究進展［J］.中國家禽，2018，40（4）：1-6.

CHEN Z，CHEN Y X，YU J N，et al.Application and research progress of illumination during avian hatching process［J］.China Poultry，2018，40（4）：1-6.（in Chinese）

［2］ 泮進明，王小雙，蔣勁松，等.家禽規(guī)模養(yǎng)殖LED光環(huán)境調(diào)控技術(shù)進展與趨勢分析［J］.農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2013，44（9）：225-235.

PAN J M，WANG X S，JIANG J S，et al.Advancement and trend of LED light environment control technology for intensive poultry production［J］.Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2013，44（9）：225-235.（in Chinese）

［3］ LI X J，RATHGEBER B，MCLEAN N，et al.Providing colored photoperiodic light stimulation during incubation：2.Effects on early posthatch growth，immune response，and production performance in broiler chickens［J］.Poult Sci，2021，100（9）：101328.

［4］ ALI S，SHERZADA S，USMAN M，et al.Impact of different light intensities to Japanese quail eggs on hatching results and post-hatch performance［J］.Trop Anim Health Prod，2023，55（6）：387.

［5］ ROZENBOIM I，HUISINGA R，HALEVY O，et al.Effect of embryonic photostimulation on the posthatch growth of turkey poults［J］.Poult Sci，2003，82（7）：1181-1187.

［6］ 張 林，張海軍，武書庚，等.單色光間歇性刺激胚蛋對肉仔雞胸肉生長及肉品質(zhì)的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（5）：951-957.

ZHANG L，ZHANG H J，WU S G，et al.Effect of intermittently monochromatic light stimuli during the embryogenesis on breast muscular growth and meat quality in male broiler chicks［J］.Scientia Agricultura Sinica，2012，45（5）：951-957.（in Chinese）

［7］ TANG W Y，TONG Q，LI B M，et al.Effects of different light-emitting diode light on hatch performance，embryo development，eye structure，and plasma melatonin in layer incubation［J］.Poult Sci，2023，102（10）：102977.

［8］ HUTH J C，ARCHER G S.Effects of LED lighting during incubation on layer and broiler hatchability，chick quality，stress susceptibility and post-hatch growth［J］.Poult Sci，2015，94（12）：3052-3058.

［9］ COOPER C B，VOSS M A，ARDIA D R，et al.Light increases the rate of embryonic development：implications for latitudinal trends in incubation period［J］.Funct Ecol，2011，25（4）：769-776.

［10］ MAURER G，PORTUGAL S J，CASSEY P.Review：an embryo’s eye view of avian eggshell pigmentation［J］.J Avian Biol，2011，42（6）：494-504.

［11］ DISHON L，AVITAL-COHEN N，ZAGURI S，et al.In ovo green light photostimulation during the late incubation stage affects somatotropic axis activity［J］.Poult Sci，2021，100（2）：467-473.

［12］ WANG P L，SUN Y Y，LI Y L，et al.Monochromatic green light stimulation during incubation shortened the hatching time via pineal function in White Leghorn eggs［J］.J Anim Sci Biotechnol，2021，12，17.https：//doi.org/10.1186/s40104-020-00539-x.

［13］ CHEN Z，QU X L，F(xiàn)ENG C G，et al.Monochromatic green light stimulation during incubation alters hepatic glucose metabolism that improves embryonic development in Yangzhou goose eggs［J］.Int J Mol Sci，2023，24（1）：405.

［14］ WITTIG J G，MNSTERBERG A.The early stages of heart development：insights from chicken embryos［J］.J Cardiovasc Dev Dis，2016，3（2）：12.

［15］ TONG Q，MCGONNELL I M，DEMMERS T G M，et al.Effect of a photoperiodic green light programme during incubation on embryo development and hatch process［J］.Animal，2018，12（4）：765-773.

［16］ GIMENO M A，ROBERTS C M，WEBB J L.Acceleration of rate of the early chick embryo heart by visible light［J］.Nature，1967，214（5092）：1014-1016.

［17］ 陳雪嬌，劉會杰，臧 蕾，等.雞胚心臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定雪域白雞高原低氧適應(yīng)性關(guān)鍵基因［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2023，54（10）：4154-4163.

CHEN X J，LIU H J，ZANG L，et al.Transcriptome data from chicken embryo heart tissue identified key genes for altitude hypoxia adaptation in Xueyu White chickens［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（10）：4154-4163.（in Chinese）

［18］ ROZENBOIM I，PIESTUN Y，MOBARKEY N，et al.Monochromatic light stimuli during embryogenesis enhance embryo development and posthatch growth［J］.Poult Sci，2004，83（8）：1413-1419.

［19］ ZHU H X，SHAO X B，CHEN Z，et al.Induction of out-of-season egg laying by artificial photoperiod in Yangzhou geese and the associated endocrine and molecular regulation mechanisms［J］.Anim Reprod Sci，2017，180：127-136.

［20］ LI M Y，LIANG C，ZHAO X H，et al.Reproductive performance of Zi-goose promoted by red color illumination［J］.Front Vet Sci，2022，9：879478.

［21］ MARTINSEN B J.Reference guide to the stages of chick heart embryology［J］.Dev Dyn，2005，233（4）：1217-1237.

［22］ ZHOU P Z，ZHANG Y，SETHI I，et al.GATA4 regulates developing endocardium through interaction with ETS1［J］.Circ Res，2022，131（11）：e152-e168.

［23］ AFOUDA B A.Towards understanding the gene-specific roles of GATA Factors in heart development：Does GATA4 lead the way？［J］.Int J Mol Sci，2022，23（9）：5255.

［24］ KUO C T，MORRISEY E E，ANANDAPPA R，et al.GATA4 transcription factor is required for ventral morphogenesis and heart tube formation［J］.Genes Dev，1997，11（8）：1048-1060.

［25］ MOLKENTIN J D，LIN Q，DUNCAN S A，et al.Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesis［J］.Genes Dev，1997，11（8）：1061-1072.

［26］ GARG V，KATHIRIYA I S，BARNES R，et al.GATA4 mutations cause human congenital heart defects and reveal an interaction with TBX5［J］.Nature，2003，424（6947）：443-447.

［27］ MOSKOWITZ I P，WANG J，PETERSON M A，et al.Transcription factor genes Smad4 and Gata4 cooperatively regulate cardiac valve development［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（10）：4006-4011.

［28］ LI R G，XU Y J，WANG J，et al.GATA4 loss-of-function mutation and the congenitally bicuspid aortic valve［J］.Am J Cardiol，2018，121（4）：469-474.

［29］ 張全波，陸長青，冉 黎，等.TGF-β1/Smad4信號通路在SD大鼠胚胎心臟發(fā)育中的作用及意義［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（17）：3105-3108.

ZHANG Q B，LU C Q，RAN L，et al.Effect of TGF-β1/Smad4 signaling pathway on the development of heart of SD rat embryo［J］.The Journal of Practical Medicine，2010，26（17）：3105-3108.（in Chinese）

［30］ QI X，YANG G，YANG L L，et al.Essential role of Smad4 in maintaining cardiomyocyte proliferation during murine embryonic heart development［J］.Dev Biol，2007，311（1）：136-146.

［31］ NIE X G，DENG C X，WANG Q，et al.Disruption of Smad4 in neural crest cells leads to mid-gestation death with pharyngeal arch，craniofacial and cardiac defects［J］.Dev Biol，2008，316（2）：417-430.

［32］ HALMOS G，SZABO Z，JUHASZ E，et al.Signaling mechanism of growth hormone-releasing hormone receptor［J］.Vitam Horm，2023，123：1-26.

［33］ HARVEY S，JOHNSON C D，SANDERS E J.Extra-pituitary growth hormone in peripheral tissues of early chick embryos［J］.J Endocrinol，2000，166（3）：489-502.

［34］ 李青竹，李潤航，鄭艷秋，等.鵝多個組織GHR和IGF-Ⅰ基因表達的發(fā)育性變化［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2015，35（5）：739-744.

LI Q Z，LI R H，ZHENG Y Q，et al.Developmental changes of GHR and IGF-Ⅰ gene expression in multiple tissues of geese［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2015，35（5）：739-744.（in Chinese）

［35］ KHN E R，VLEURICK L，EDERY M，et al.Internalization of the chicken growth hormone receptor complex and its effect on biological functions［J］.Comp Biochem Physiol Part B：Biochem Mol Biol，2002，132（1）：299-308.

［36］ DISHON L，AVITAL-COHEN N，ZAGURI S，et al.The effect of selected in ovo green light photostimulation periods on post-hatch broiler growth and somatotropic axis activity［J］.Poult Sci，2021，100（8）：101229.

（編輯 郭云雁）