摘 要： 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，其致死率高達(dá)30％。該菌能夠在高鹽度、高酸度和冷藏溫度等極端條件下存活和增殖，對(duì)人畜健康構(gòu)成了重大威脅。然而抗生素的濫用導(dǎo)致藥物殘留和多重耐藥性等問(wèn)題的出現(xiàn)，從而使得李氏桿菌病的防治異常困難。噬菌體相關(guān)生物制劑的發(fā)展為解決以上問(wèn)題提供了可行方案。本文綜述了李氏桿菌噬菌體在食品保鮮、生物檢測(cè)、基因工程等方面的應(yīng)用，同時(shí)還探討了噬菌體與宿主之間的互作機(jī)制，旨在為李氏桿菌噬菌體在食品污染防控中提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 李氏桿菌；噬菌體；食品污染；生物檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-1819-08

收稿日期：2023-09-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32060822；31960726；31560700）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFC1605705）

作者簡(jiǎn)介：崇 倩（2000-），女，藏族，甘肅永靖人，碩士生，主要從事李氏桿菌噬菌體分離鑒定研究，E-mail： 1801638664@qq.com

*通信作者：茍惠天，主要從事食源性疾病的診斷及防控研究，E-mail： gouht@gsau.edu.cn

Research Progress of Applied Research on Listeria monocytogenes Phage

CHONG" Qian， ZHAO" Xuehui， CAO" Qing， XUE Huiwen， GOU" Huitian*

（College of Veterinary Medicine of Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China）

Abstract："" Listeria monocytogenes being a common foodborne pathogen. Food contaminated with this bacterial can cause listeriosis， with clinical manifestations of sepsis and meningitis， and mortality be up to 30%. Listeria monocytogenes can survive under extreme condition such as high salinity， high acidity， and low temperature， so posing a significant threat to the human and animal health. At present， the main method of preventing and treating this disease is the use of antibiotics. However， the multiple drug resistance making the prevention and treatment of listeriosis extraordinarily difficult. The development of phage and related biological agents provides feasible solutions to solve the above problem. This article reviews the applications of Listeria phages in food preservation， biological detection， genetic engineering， and the interaction between phages and hosts， aiming to provide a theoretical basis for Listeria phages in food pollution prevention and control.

Key words： Listeria monocytogenes; phage; food contamination; biological detection

*Corresponding author：" GOU Huitian， E-mail： gouht@gsau.edu.cn

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，LM），是已發(fā)現(xiàn)李氏桿菌屬中對(duì)人致病性最強(qiáng)的種［1］，食用經(jīng)LM污染的食品可引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等多種疾病，死亡率高達(dá)30％［2］。對(duì)于李氏桿菌病的防治主要依靠抗生素，長(zhǎng)久使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此，在治療細(xì)菌性疾病時(shí)，迫切需要研發(fā)含有抑菌功能的新型制劑給予支持。以噬菌體為代表的新型生物抗菌制劑因其安全性、特異性、在體內(nèi)不會(huì)造成菌群失調(diào)、副作用小、無(wú)化學(xué)殘留等特點(diǎn)在降低致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，從而保障食品的質(zhì)量與安全方面具有巨大的潛力，已經(jīng)成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

1 噬菌體感染細(xì)菌的機(jī)制

依據(jù)侵染細(xì)菌機(jī)制的不同，可將噬菌體分為裂解性噬菌體（lytic phage）和溶源性噬菌體（lysogenic phage）。裂解性噬菌體首先吸附到細(xì)菌表面特異性受體上，將核酸注入宿主細(xì)胞，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；核酸隨后在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞中生成上百個(gè)新的噬菌體顆粒，噬菌體基因組編碼的裂解酶裂解細(xì)胞壁，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂和噬菌體子代釋放。溶源性噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，將其基因組 DNA 整合至宿主菌基因組上，并隨宿主菌 DNA復(fù)制而復(fù)制，在特定的條件下（如紫外線、絲裂霉素C等誘導(dǎo)），噬菌體 DNA與宿主菌 DNA分離，隨后進(jìn)入裂解循環(huán)，噬菌體進(jìn)行生物合成與裝備并裂解宿主菌，子代噬菌體顆粒釋放至宿主菌胞外（圖1）。

2 噬菌體-宿主李氏桿菌的相互作用

在自然界中，噬菌體已經(jīng)進(jìn)化獲得了超越傳統(tǒng)的溶源反應(yīng)，在一些LM菌株中，存在“comK”的基因，其中含有原噬菌體，這會(huì)導(dǎo)致宿主菌失去活性。當(dāng)LM感染巨噬細(xì)胞時(shí)，原噬菌體會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿娱_(kāi)關(guān)，促進(jìn)“comK”基因的表達(dá)，從而促進(jìn)LM在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)。在這個(gè)過(guò)程中，原噬菌體不會(huì)產(chǎn)生感染性噬菌體或?qū)е录?xì)菌溶解，這表明它已經(jīng)適應(yīng)了宿主的生活方式。研究將這種適應(yīng)性噬菌體行為稱為“活性溶源”，即噬菌體通過(guò)基因組切除來(lái)調(diào)控細(xì)菌的基因表達(dá)，而不觸發(fā)溶源周期［3］。為了更好地理解LM菌株10403S與其原噬菌體f10403S之間的相互作用，該研究分析了噬菌體對(duì)誘導(dǎo)裂解循環(huán)的條件的反應(yīng)、噬菌體基因組以及在溶源性、裂解性和活性溶源性條件下的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，同時(shí)還分析了調(diào)控基因和溶源性基因。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，f10403S獲得了一種非經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)鑒定出新的噬菌體編碼因子，并且發(fā)現(xiàn)這些因子促進(jìn)了活性溶源行為，以及在細(xì)菌-噬菌體互作作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，例如LlgA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和DNA復(fù)制酶。

伊氏李氏桿菌（Listeria ivanovii，Liv）是李氏桿菌屬中的致病菌種之一，主要感染反芻動(dòng)物，但也偶爾引起人類腸道感染。最近的研究表明，LM細(xì)胞壁相關(guān)的糖基共聚物 （WTA） 上的特異性糖基負(fù)責(zé)噬菌體吸附和保留主要毒力因子InlB。除了作為血清分型的主要抗原決定因素外，WTA還參與一些關(guān)鍵的生理功能，包括維持滲透壓、抗生素耐藥性、毒力以及與宿主細(xì)胞和噬菌體的相互作用［4］。在LM血清型1/2a中的研究表明，InlB依賴于WTA上的鼠李糖殘基來(lái)進(jìn)行表面保留，這種修飾也可以作為噬菌體受體［5］。由于這些修飾體既是噬菌體結(jié)合的受體，也是表面相關(guān)毒力因子InlB的配體，因此，李氏桿菌在維持毒力和產(chǎn)生噬菌體抗性之間面臨著權(quán)衡［4］。由于Liv基因組中也具有InlB的特征，因此確定InlB毒力因子是否也依賴于WTA修飾是有必要的。研究表明，對(duì)Liv WSLC 3009基因組的多順?lè)醋覹TA基因簇中編碼一個(gè)假定的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的獨(dú)特基因liv1070進(jìn)行鑒定。超高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，基因組內(nèi)缺失liv1070導(dǎo)致WTA上葡萄糖替代缺失，由于噬菌體不能吸附在細(xì)菌表面，這一結(jié)合過(guò)程由受體結(jié)合蛋白介導(dǎo)，葡萄糖缺乏突變體對(duì)噬菌體感染產(chǎn)生了抗性。與LM類似，liv1070的缺失導(dǎo)致了細(xì)菌細(xì)胞壁上InlB保留的缺失。liv1070的遺傳互補(bǔ)恢復(fù)了其特有的表型，包括葡萄糖修飾、噬菌體吸附和細(xì)胞侵襲。綜上所述，噬菌體、細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間的相互作用也存在于Liv中，這表明噬菌體耐藥性和毒性衰減之間的權(quán)衡可能是李氏桿菌屬的一個(gè)普遍特征［6］。

隨著非編碼RNAs （ncRNAs）在LM毒力和環(huán)境脅迫中的不同作用越來(lái)越清楚，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。ncRNA rliB是CRISPR家族的非典型成員，在一些LM基因組和其他李氏桿菌中被發(fā)現(xiàn)，并可能位于相似的基因組位點(diǎn)上。Tian等［7］通過(guò)同源重組構(gòu)建了rliB缺陷突變體（Lm3-22-ΔrliB），研究發(fā)現(xiàn)Lm3-22-ΔrliB對(duì)李氏桿菌噬菌體vB-LmoM-SH3-3的敏感性顯著提高，成斑效率提高了128倍。與野生型相比，Lm3-22-ΔrliB的黏附性和侵襲性顯著降低（分別為9.3%和1.33%）。感染4 h后，Lm3-22-ΔrliB在小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）中的增殖也明顯下降。侵襲相關(guān)表面蛋白轉(zhuǎn)錄水平顯示，Lm3-22-ΔrliB中內(nèi)毒素基因lmo0610、lmo0514和肽聚糖結(jié)合蛋白基因lmo1799顯著升高。此外，與噬菌體相互作用后，Lm3-22-ΔrliB細(xì)胞中inlA、lmo0610、lmo1799、lmo2085和lmo0514的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而與噬菌體處理的Lm3-22對(duì)照組相比，inlB的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。因此，rliB缺失有效調(diào)節(jié)了李氏桿菌與噬菌體的相互作用，削弱了其侵襲能力，增強(qiáng)了其對(duì)噬菌體的敏感性，為噬菌體的生物防治提供了新的理論依據(jù)。

3 李氏桿菌噬菌體改造

經(jīng)過(guò)工程化改造的人工噬菌體可以攜帶特定的功能模塊，相較天然噬菌體具有增強(qiáng)殺菌效率、核酸水平的精準(zhǔn)干預(yù)、轉(zhuǎn)換或擴(kuò)大宿主譜、降低免疫反應(yīng)、利用宏基因組挖崛噬菌體資源、多組學(xué)揭示噬菌體與宿主互作機(jī)制［8］、用于病原菌的檢測(cè)以及改造LM噬菌體作為給藥載體等一系列優(yōu)點(diǎn)。

基于生物發(fā)光的報(bào)告噬菌體是一種基因工程病毒，可以特異性感染宿主細(xì)胞，并轉(zhuǎn)導(dǎo)一種異源熒光素酶基因，其活性可以高靈敏度地檢測(cè)到，可以指示活的靶細(xì)胞的存在［9］。Meile等［10］用合成生物學(xué)進(jìn)行全基因組組裝和激活，以及 CRISPR-Cas-輔助噬菌體工程，構(gòu)建了一套用于檢測(cè)和鑒別李氏桿菌活細(xì)胞的報(bào)告噬菌體。在這項(xiàng)研究中基于單個(gè)噬菌體結(jié)構(gòu)，比較了編碼不同甲殼動(dòng)物、刺胞動(dòng)物和細(xì)菌熒光素酶的四種報(bào)告噬菌體的特性。從這組報(bào)告蛋白中，nluc被鑒定為一種理想的納米熒光素酶［11］，引入到廣泛宿主噬菌體A511和血清型1/2a和血清型4b特異性李氏桿菌噬菌體A006和A500的基因組中?；趎luc的廣譜噬菌體A511：：nlucCPS在不到24 h的時(shí)間內(nèi)，在25 g人工污染的牛奶、冷盤和生菜中檢測(cè)出1 CFU的LM。此外，該報(bào)告噬菌體成功在可能被污染的食品樣品中檢測(cè)出，而且沒(méi)有產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。A006：：nluc和A500：：nluc能夠進(jìn)行血清特異性李氏桿菌診斷。此研究中提出的報(bào)告噬菌體不僅可以快速檢測(cè)出LM，而且還能估計(jì)早期食品生產(chǎn)和加工場(chǎng)所分離的李氏桿菌潛在毒力。

噬菌體為診斷、修復(fù)和靶向微生物組操作提供了極好的工具，但分離具有廣譜宿主特異性的噬菌體仍然具有挑戰(zhàn)性。李天昊等［12］從屠宰場(chǎng)污水中分離出一株可跨種裂解的LM噬菌體LP8，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析后，聯(lián)合青霉素G鈉治療可以在良好的治療效果的前提下，減少抗微生物藥物使用，為治療李氏桿菌病提供了一個(gè)新的途徑。噬菌體編碼的受體結(jié)合蛋白（RBP）介導(dǎo)附著并賦予屬、種甚至血清型水平的特異性［13］。這些蛋白是特定噬菌體靶向分類多樣性的關(guān)鍵決定因素，即噬菌體宿主范圍［14］。Dunne等［15］將Gp15鑒定為噬菌體PSA 的RBP，并構(gòu)建了一個(gè)包含序列隨機(jī)RBP的合成噬菌體文庫(kù)，從中分離出突變體，隨后將其整合到具有擴(kuò)展宿主范圍的合成多價(jià)噬菌體中。在1.7 分辨率下確定了Gp15受體結(jié)合羧基末端的晶體結(jié)構(gòu)，并利用生物信息學(xué)方法鑒定了針對(duì)不同李氏桿菌血清型的RBP。結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)使異種RBP頭部、頸部或肩部結(jié)構(gòu)域的交換能夠產(chǎn)生具有可預(yù)測(cè)和擴(kuò)展宿主范圍的嵌合噬菌體。這一方法將促進(jìn)基于具有可調(diào)宿主特異性的噬菌體生物制劑的開(kāi)發(fā)。

完整注釋的基因組序列對(duì)于治療用噬菌體十分重要。盡管基因遺傳圖譜并不能決定噬菌體的宿主范圍，但可由它分析一些關(guān)鍵信息?；蚪M測(cè)序可以幫助確定噬菌體DNA的可修飾性，該系統(tǒng)可以對(duì)噬菌體能否進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移的可能性進(jìn)行預(yù)測(cè)［16］。其次，該方法可以有效預(yù)測(cè)噬菌體是否包含有毒基因。通過(guò)對(duì)李氏桿菌噬菌體基因組進(jìn)行基因修飾，理論上可以拓寬噬菌體的裂解譜［17］。

CRISPR-Cas系統(tǒng)為細(xì)菌提供適應(yīng)性免疫，以抵抗入侵的DNA，包括噬菌體和質(zhì)粒［18］。Hupfeld等［19］報(bào)道了李氏桿菌屬的第一個(gè)功能性CRISPR-Cas系統(tǒng)，LivCRISPR-1是L. ivanovii亞種londoniensis基因組中的II-A型系統(tǒng)，研究者將LivCRISPR-1 Cas9和反式激活crRNA轉(zhuǎn)移到LM中，與crRNA編碼質(zhì)粒一起，這種可編輯干擾系統(tǒng)能夠有效地切割細(xì)菌DNA和進(jìn)入的噬菌體基因組。構(gòu)建了一個(gè)基于LivCRISPR-1的可編輯特異性核酸酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)也可用于李氏桿菌屬的其他成員。LivCRISPR-1 Cas9蛋白對(duì)于李氏桿菌和噬菌體DNA的高效靶向切割，可用于編輯李氏桿菌噬菌體基因組。因此，該研究編輯了一種李氏桿菌噬菌體，可誘導(dǎo)受感染細(xì)胞產(chǎn)生和釋放特異性細(xì)胞壁水解酶，從而允許在共培養(yǎng)中控制兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)和相互作用。這種方法有助于調(diào)控復(fù)雜的細(xì)菌環(huán)境，從而有助于深入研究細(xì)菌之間的相互作用。

4 噬菌體在李氏桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

通過(guò)將噬菌體與納米材料組裝為納米復(fù)合探針或者直接使用噬菌體作為探針可用于超敏檢測(cè)。據(jù)此，國(guó)外NEMIS技術(shù)公司建立AquaSparkTM技術(shù)用于快速監(jiān)測(cè)食品接觸表面中的LM，這種技術(shù)利用LM的特異性肌醇1-磷酸基團(tuán)被AquaSparkTM小分子化學(xué)發(fā)光探針標(biāo)記，這個(gè)觸發(fā)基團(tuán)是由LM表達(dá)的毒力因子磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C （PI-PLC）的底物所組成的，加上含有噬菌體雞尾酒的細(xì)菌特異性富集肉湯，提高其特異性和靈敏度?？梢栽?4 h內(nèi)檢測(cè)到不銹鋼表面低劑量的LM［20］。

Sample6 DETECTTMHT/L是一種基于噬菌體的檢測(cè)系統(tǒng)，主要用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的LM和其他李氏桿菌。使用Sample6專有的BioIlluminationTM技術(shù)，該方法通過(guò)特異性噬菌體與李氏桿菌結(jié)合，高通量DETECT HT/L試劑盒能在18 h內(nèi)最多可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)環(huán)境樣品或混合綠葉蔬菜基質(zhì)中的李氏桿菌［21］。

Lai等［22］成功研發(fā)了一種將李氏桿菌噬菌體P100和銀納米顆粒結(jié)合到藻酸鹽基質(zhì)中的新型抗菌配方。該方法通過(guò)將噬菌體P100（109 PFU·mL-1）添加到藻酸鹽-銀包被中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在原紙上涂上不同重量的抗菌配方，然后進(jìn)行紅外干燥，制成生物活性紙。整合到海藻酸鹽基質(zhì)中的噬菌體即使經(jīng)過(guò)高溫紅外干燥也能保持穩(wěn)定的特性。當(dāng)海藻酸鹽濃度范圍為1.0%～1.25%，對(duì)應(yīng)的干燥紙涂層重量為1.8～2.3 g·m-2時(shí)，對(duì)LM的抗菌活性最有效，使LM數(shù)量減少了5 log CFU·cm-2。噬菌體展示技術(shù)是將多肽基因片段克隆到噬菌體衣殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，融合表達(dá)外源肽和衣殼蛋白。融合蛋白通過(guò)子代噬菌體的重組顯示在噬菌體表面，經(jīng)過(guò)3～5輪吸附洗脫擴(kuò)增后，從噬菌體肽庫(kù)中篩選出特異性外源肽［23］。該方法篩選的肽具有特異性好、穩(wěn)定可靠、結(jié)構(gòu)清晰、容易合成、成本低等優(yōu)點(diǎn)［24］。Li等［25］利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)大腸桿菌O157：H7、LM和馬耳他布魯氏菌這三種常見(jiàn)人畜共患病原體進(jìn)行特異性肽篩選，得到了分別能識(shí)別這三種病原體的肽E2、L4和B4。合成了三個(gè)經(jīng)生物素修飾的肽，并將其偶聯(lián)到鏈霉親和素磁珠（streptavidin magnetic beads，mb）上形成多肽mb，從而富集了上述三種病原體。將3種多克隆抗體偶聯(lián)到不同的量子點(diǎn)熒光表面（QD540、QD580和QD630），構(gòu)建了3個(gè)量子點(diǎn)探針。建立了基于多肽-mb和量子點(diǎn)多色熒光標(biāo)記的檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌O157：H7、LM和馬耳他布魯氏菌。檢測(cè)耗時(shí)約100 min，檢出限分別為103、102、102 CFU·mL-1。根據(jù)Meile等［10］的研究，噬菌體的病原識(shí)別工具可以根據(jù)其作用方式分為兩類：基于分子的檢測(cè)方法和基于相互識(shí)別的檢測(cè)方法。許多基于核酸的技術(shù)已被應(yīng)用于LM的檢測(cè)，包括常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)/定量PCR （qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和全基因組測(cè)序分析等。這些分子技術(shù)雖非常敏感和特異，然而它們通常無(wú)法區(qū)分活的和滅活的微生物，因而會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果［26］。因此，需要新型的、快速的、健全的檢測(cè)方法對(duì)致病菌進(jìn)行識(shí)別。在基于相互識(shí)別的檢測(cè)方法中，噬菌體尾部及其受體結(jié)合蛋白（RBPS）通過(guò)尾部附著位點(diǎn)與細(xì)菌表面分子之間的特異性相互作用，對(duì)宿主識(shí)別起到關(guān)鍵作用。研究者從一組李氏桿菌噬菌體中收集了六種蛋白質(zhì)：三種RBP和三種內(nèi)毒素衍生的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域（cell wall-binding domains CBD），目的是開(kāi)發(fā)一種快速、可靠和客觀的血清分型方法。在該方案中，GFP（綠色熒光蛋白）標(biāo)記的重組蛋白與LM一起在微孔板上孵育，并在1 h內(nèi)測(cè)量結(jié)合探針的熒光，以提供血清特異性指紋圖譜。為了驗(yàn)證這種新的方案的準(zhǔn)確性，測(cè)試了60株已知血清型的菌株，其中58株被該方法準(zhǔn)確分型。這種方法規(guī)避了基于PCR分型的一些局限性，可以區(qū)分活細(xì)菌和滅活細(xì)菌以及由點(diǎn)突變引起的不同血清型。為了進(jìn)一步說(shuō)明基于噬菌體蛋白檢測(cè)和鑒別LM的有效性。研究者們開(kāi)發(fā)了一種方法來(lái)區(qū)分最常見(jiàn)的致病血清型：1/2a和4b，通過(guò)連接GFP標(biāo)記的重組蛋白到磁珠上，以便在熒光顯微鏡下選擇性富集和檢測(cè)這些血清型。結(jié)果顯示雖然4b特異性磁珠的結(jié)合親和力明顯低于1/2a，但在混合培養(yǎng)中仍能有效地分離目標(biāo)血清型細(xì)菌。以上結(jié)果表明，高穩(wěn)定性、特異性和重組過(guò)表達(dá)的易用性使RBP成為抗體的優(yōu)秀替代品和開(kāi)發(fā)新診斷技術(shù)的理想工具。

5 李氏桿菌噬菌體在食品保鮮中的應(yīng)用

李氏桿菌存在范圍廣泛，會(huì)污染食品加工環(huán)境，并在設(shè)備、器皿、地板和下水道的生物膜中存活，通過(guò)交叉污染進(jìn)入食品，因此，消除食品和食品加工環(huán)境中的細(xì)菌病原體需要新的方法。在新興技術(shù)中，利用噬菌體作為新型抗菌劑是有效解決方案之一。在 Song等［27］的研究中，HolGH15有可能作為一種新型的抗菌劑，通過(guò)噴灑或浸泡的方式在食品生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)抗李氏桿菌。Chibeu等［28］的研究表明，單一噬菌體制劑能夠減少火雞片和烤牛肉表面的李氏桿菌。與單一噬菌體制劑相比，用多種噬菌體制備的雞尾酒制劑效果更好，既有更廣泛的裂解范圍，又能降低細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)（表1）。

噬菌體固定化使得具有噬菌體活性的包裝材料應(yīng)用于食品。由于噬菌體外部結(jié)構(gòu)具有電荷差異，噬菌體可以通過(guò)靜電作用固定在包裝表面。Anany等［38］指出固定化的LM噬菌體可以應(yīng)用于真空或有氣體填充的包裝肉類中，可在保質(zhì)期內(nèi)將LM控制在1×105 CFU·mL-1以下。Radford等［39］將噬菌體固定在聚乳酸（PLA）薄膜的黃原膠涂層上，與農(nóng)產(chǎn)品作用30 min內(nèi)，99.99%噬菌體獲得釋放。具有噬菌體涂層與不具備涂層的PLA相比，細(xì)菌的數(shù)量出現(xiàn)明顯下降（表2）。

6 問(wèn)題與展望

近年來(lái)，對(duì)李氏桿菌噬菌體的應(yīng)用研究進(jìn)展成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)之一，但是，目前對(duì)李氏桿菌噬菌體的研究主要集中在分離鑒定及生物學(xué)特性分析等初步研究［12］，對(duì)李氏桿菌噬菌體與宿主互作機(jī)制以及作為生物制劑在臨床應(yīng)用方面研究較少。噬菌體的高度特異性確保了使用噬菌體的安全性；噬菌體種類繁多，基數(shù)大等，為噬菌體的使用提供了基礎(chǔ)；噬菌體的生物活性可以確保在宿主體內(nèi)的作用效果不會(huì)因?yàn)闀r(shí)間的推移或者微環(huán)境的改變導(dǎo)致治療效果下降；同時(shí)利用噬菌體本身的一些特性，也可以開(kāi)發(fā)出一系列的新技術(shù)，用于細(xì)菌性疾病的食品污染防控和公共衛(wèi)生的改善。雖然，李氏桿菌噬菌體生物制劑作為生物防治手段仍有很長(zhǎng)一段路要走。但通過(guò)開(kāi)展李氏桿菌CRISPR-Cas防御系統(tǒng)與噬菌體互作等方面的研究，以進(jìn)一步完善噬菌體生物學(xué)、基因組學(xué)、基因傳遞機(jī)制以及李氏桿菌屬的致病機(jī)制，從而為噬菌體臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和科研手段的提高，噬菌體將會(huì)成為一種綠色、安全、有效的防控細(xì)菌性感染的抗生素替代品。

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（編輯 白永平）