李 莉 李 鈺 楊紹杰

1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川成都 611731；2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000；3.成都市慢性病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都 610017

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是1906年首次由德國(guó)精神病學(xué)家和神經(jīng)病學(xué)家Alzheimer Alois發(fā)現(xiàn)，并以其名字命名的一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是老年期癡呆最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，也是導(dǎo)致老年人失能的重要原因之一[1]。據(jù)Alzheimer’s Association報(bào)道，預(yù)計(jì)到2050年AD患者將接近1.14億，每33秒就會(huì)新增一位AD患者[2]。目前AD可能的發(fā)病機(jī)制有β淀粉樣蛋白毒性學(xué)說(shuō)、tau蛋白過(guò)度磷酸化學(xué)說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等[3]。然而沒(méi)有任何一種假說(shuō)能全面解釋AD所有的病理特點(diǎn)，目前主要認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。而目前對(duì)于AD的藥物研究方面，臨床上主要使用西藥治療，如膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑、腦蛋白水解物及其他緩解AD癥狀的藥物[4]。這些藥物雖然可使患者癡呆癥狀相對(duì)減輕，但引發(fā)的不良事件也較多。

近年來(lái)，應(yīng)用中藥提取物及其衍生藥物治療AD的研究日益增多。與西藥相比，我國(guó)特有的中藥具有治療效果較好、毒副作用較低等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)楊晶瑩等[5]的研究，古方黃精丸具有潛在防治AD作用。從黃精丸防治AD相關(guān)的試驗(yàn)與臨床研究結(jié)果來(lái)分析，黃精丸與地黃飲子[6]、開(kāi)心散[7]等中藥復(fù)方相似，具有多層次、多靶點(diǎn)、多方向防治AD的特點(diǎn)，而有關(guān)黃精丸防治AD的相關(guān)研究還處在空白階段，有關(guān)該復(fù)方的相關(guān)試驗(yàn)及臨床研究報(bào)道極少，現(xiàn)有的相關(guān)研究尚未完全闡明其作用機(jī)制，并且由于中藥成分的多樣性和作用機(jī)制的多靶點(diǎn)、多通路，傳統(tǒng)的研究方法很難實(shí)施。而近年興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)，從系統(tǒng)水平分析藥物作用機(jī)制、發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物或新適應(yīng)證、識(shí)別新藥靶點(diǎn)的一種新的研究角度，其與中醫(yī)藥整體調(diào)控機(jī)體的理念相吻合，同時(shí)也能大大降低后續(xù)試驗(yàn)研究的工作量[8]。因此本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思路應(yīng)用于黃精丸防治AD的作用機(jī)制探討，旨在為后續(xù)的試驗(yàn)研究方向提供一定的信息支撐，并將經(jīng)典中藥古方發(fā)揚(yáng)光大。

1 材料與方法

1.1 分析軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

主要包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、DrugBank數(shù) 據(jù) 庫(kù)、UniProt數(shù) 據(jù) 庫(kù)、GeneCards數(shù) 據(jù) 庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、String數(shù)據(jù)庫(kù)、Venny 2.1、R 4.0.3、Cytoscape 3.8.1等軟件。

1.2 黃精丸活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通 過(guò)TCMSP數(shù) 據(jù) 庫(kù)[9]（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）按照如下名稱(chēng)：黃精（Polygonati Rhizoma）和當(dāng)歸（Angelicae Sinensis Radix）檢索黃精丸2味中藥的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%的，類(lèi)藥性（drug-like index，DL）≥0.18的原則篩選[10]。利用DrugBank數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.drugbank.ca/releases/latest）和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）預(yù)測(cè)篩選、收集活性成分的潛在靶點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化蛋白名稱(chēng)，得到黃精丸活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)及藥物與疾病靶點(diǎn)交集預(yù)測(cè)

以“Alzheimer’s disease”為 關(guān) 鍵 詞，檢 索GeneCards數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.GeneCardssorg/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/），得到AD相關(guān)的疾病基因。刪除疾病靶點(diǎn)中多余重復(fù)的靶點(diǎn)，得到AD相關(guān)靶點(diǎn)。用韋恩圖（Venny 2.1）繪制活性成分靶點(diǎn)和AD靶點(diǎn)的交集。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，生物種類(lèi)設(shè)定為“Homo sapiens”。以節(jié)點(diǎn)連接度值（degree）為指標(biāo)，篩選核心蛋白質(zhì)靶標(biāo)，以R 4.0.3軟件繪制度值排名前20的靶點(diǎn)柱狀圖。

1.5 構(gòu)建成分-靶蛋白-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

以篩選所得的黃精丸有效成分、AD靶點(diǎn)及靶點(diǎn)所屬信號(hào)通路為基礎(chǔ)，通過(guò)Cytoscape構(gòu)建成分-靶蛋白-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Tools面板中的Network analysis計(jì)算網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。

1.6 GO（Gene ontology）富集分析

將黃精丸防治AD的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Metascape平臺(tái)，選擇物種信息為“Homo Sapiens”，進(jìn)行GO注釋分析，設(shè)置閾值P＜ 0.01，篩選出排名靠前的20個(gè)GO注釋結(jié)果。

1.7 KEGG（Kyoto encyclopedia of gene and genomes）通路富集

將黃精丸藥物和AD交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)置P＜ 0.05，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，使用R 4.0.3軟件，繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 黃精丸有效成分及其靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃精丸中黃精和當(dāng)歸的化學(xué)成分，獲得黃精有效成分38個(gè)、當(dāng)歸有效成分95個(gè)，按照OB值和DL值篩選活性成分，選出黃精11個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)，去重后獲得黃精丸的活性成分12個(gè)，見(jiàn)表1，最終得到黃精丸活性成分潛在作用靶點(diǎn)蛋白265個(gè)。

表1 黃精丸活性成分信息表

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選，去重后得到AD靶點(diǎn)基因1000個(gè)。

2.3 藥物與疾病靶點(diǎn)交集

用韋恩圖（Venny 2.1）繪制黃精丸活性成分靶點(diǎn)和AD靶點(diǎn)的交集，共92個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 AD與黃精丸活性成分靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

PPI網(wǎng)絡(luò)中共92個(gè)節(jié)點(diǎn)、787條邊，平均度值為17.1，見(jiàn)圖2。根據(jù)其度值篩選出排名前20位的核心靶點(diǎn)，包括AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等，見(jiàn)圖3。

圖2 黃精丸與AD共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 黃精丸治療AD的前20位核心靶點(diǎn)

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

利用Cytoscape軟件構(gòu)建黃精丸藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D（圖4）。該網(wǎng)絡(luò)圖中包含130個(gè)節(jié)點(diǎn)、1252條邊。在黃精丸防治AD作用網(wǎng)絡(luò)圖中，根據(jù)中心度，排名靠前的成分是 黃 芩 素（baicalein）、5，4’-二 羥 基 黃 酮（4’，5-Dihydroxyflavone）、甘 草 素（DFV）、3’-甲氧 基 大 豆 苷 元（3’-Methoxydaidzein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol），度值排名靠前的靶點(diǎn)有PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3等。

圖4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

2.6 GO富集分析

GO注釋分析通過(guò)共同的語(yǔ)義來(lái)描述基因生物學(xué)功能，GO注釋結(jié)果見(jiàn)圖5A～C。

圖5 黃精丸治療AD的潛在靶點(diǎn)GO富集分析

2.7 KEGG通路富集

總共富集到146條信號(hào)通路，選擇排名前20的通路并以氣泡圖展示，見(jiàn)圖6。排名靠前的主要有癌癥信號(hào)通路、代謝通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)退行性性變信號(hào)通路、AD等。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

AD病灶在腦，在中醫(yī)學(xué)中屬于“健忘”“呆病”等范疇，與腎虛血瘀有關(guān)[11]?！秱摗诽岬健瓣?yáng)明病，其人喜忘者，必有蓄血”，《類(lèi)證治裁》提到“若血瘀于內(nèi)，則善忘如狂”[12]。AD屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為腎精虧虛、氣血不足致腦髓失養(yǎng)，標(biāo)實(shí)為血瘀絡(luò)滯、痰濁互結(jié)則腦脈痹阻[13]。

黃精丸中黃精可補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺[14]，當(dāng)歸活血通絡(luò)、補(bǔ)血和血、氣暢血行[15]，全方共奏補(bǔ)腎填精、活血通絡(luò)之功。綜上所述，黃精丸用于AD防治具有扎實(shí)的中醫(yī)理論依據(jù)。黃精提取物可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶，降低海馬tau蛋白磷酸化[16-17]。未小明等[18]也證實(shí)黃精對(duì)AD大鼠的行為認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶能力等有明顯改善作用。另有研究顯示，黃精的主要成分黃精多糖可顯著保護(hù)AD大鼠的海馬神經(jīng)元，并可減少細(xì)胞丟失，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。當(dāng)歸性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經(jīng)[20]。當(dāng)歸具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗AD及神經(jīng)保護(hù)功能[21]。吳紅彥團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸提取物及有效組分（當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸揮發(fā)油及阿魏酸）可提高腦組織膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、抗自由基活性，從而改善AD大鼠、小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸水提取物可下調(diào)糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）酶活性，進(jìn)而降低tau蛋白磷酸化水平[24]。此外，當(dāng)歸的有效成分藁本內(nèi)酯[25-26]、阿魏酸對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠也具有良好的保護(hù)作用，均可顯著改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶，增強(qiáng)其認(rèn)知能力[27]。但黃精丸防治AD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未明確，有待深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)黃精丸7個(gè)活性成分參與AD的治療，其中度值排名靠前的成分是黃芩素、5，4’-二羥基黃酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元、β-谷甾醇）。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激，降低毒性反應(yīng)，顯示黃芩素具有改善認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶的能力[28]。杜燁湘等[29]的研究顯示，甘草素可有效抑制AD模型細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與其能上調(diào)ERβ蛋白的表達(dá)有關(guān)。黃芩素、5，4’-二羥基黃酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元均屬于黃酮類(lèi)成分。黃酮類(lèi)成分是在自然界大量存在的一類(lèi)具有廣泛活性的中藥化合物，可通過(guò)抑制膽堿酯酶活性、抑制氧化應(yīng)激及清除自由基、修飾tau蛋白、減少Aβ形成、抑制炎癥因子表達(dá)而有效阻斷AD的疾病進(jìn)展[30]。而β-谷甾醇也是黃芩的有效成分，具有抗氧化作用，并通過(guò)抑制體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活而發(fā)揮抗炎作用[31]。上述成分可能是黃精丸治療AD的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

PPI蛋白相互作用分析結(jié)果顯示，黃精丸治療AD的核心靶點(diǎn)主要有AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等；藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D中PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3的度值相對(duì)較大。AKT1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，參與細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝。TP53編碼的蛋白質(zhì)響應(yīng)多種細(xì)胞應(yīng)激，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復(fù)或代謝改變。VEGFA是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管新生，增加血管通透性及維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。SIRT1是去乙?；讣易宄蓡T，通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活劑-1α（PGC-1α）參與調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；概cmtDNA結(jié)合活性，參與細(xì)胞糖脂代謝、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制，抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[32]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種跨膜糖蛋白，可誘導(dǎo)受體二聚和酪氨酸自磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其下調(diào)可能與AD有關(guān)[33]。PIK3CA是一個(gè)能夠磷酸化磷酸肌醇環(huán)3’OH的脂質(zhì)激酶家族。其負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)多種細(xì)胞功能，包括增殖和存活。PIK3CB在真核細(xì)胞外膜受體的信號(hào)通路中起著重要作用，并因其催化亞基而得名。編碼的蛋白是PI3Kbeta（PI3Kβ）的催化亞基。PI3KB已被證明是中性粒細(xì)胞激活途徑的一部分，中性粒細(xì)胞在損傷或感染部位會(huì)結(jié)合免疫復(fù)合物。NOS2是一種活性自由基，在神經(jīng)傳遞、抗菌和抗腫瘤等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮生物介質(zhì)的作用。MAPK3基因編碼MAP激酶，MAP激酶參與多種細(xì)胞過(guò)程，是tau蛋白激酶的一種[34]，tau蛋白異常過(guò)度磷酸化是AD主要的發(fā)病機(jī)制之一，tau蛋白是腦內(nèi)一種微管相關(guān)蛋白，受蛋白激酶（磷酸化）和蛋白磷酸酯酶（脫磷酸化）的調(diào)節(jié)，tau蛋白功能異常改變可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和凋亡[35]。推測(cè)黃精丸可能通過(guò)降低MAPK的表達(dá)，從而減少tau蛋白的形成，減輕神經(jīng)退行性變。

KEGG富集分析顯示與黃精丸治療AD相關(guān)的有癌癥信號(hào)通路、代謝通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)退行性性變信號(hào)通路、AD等。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，結(jié)果顯示黃精丸對(duì)AD的調(diào)控是通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的方式，為進(jìn)一步研究提供了理論參考。后期可在藥效學(xué)和細(xì)胞水平層面進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步明確黃精丸防治AD的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。