摘 要 從燈盞花cDNA中克隆出燈盞花3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（EbUF3GT）并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析以預(yù)測其功能。根據(jù)課題組前期的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，篩選出了燈盞花EbUF3GT基因的部分序列，并利用RACE基因克隆方法，獲得燈盞花EbUF3GT基因的全長cDNA，運(yùn)用生物信息學(xué)分析該基因的相似性和同源性、編碼蛋白的理化性質(zhì)，并通過熒光定量PCR檢測基因在植物不同部位中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆cDNA的ORF長1 395 bp，編碼464個氨基酸，其蛋白分子量51 850.48，理論等電點(diǎn)為5.48。EbUF3GT蛋白由24.78%的α-螺旋（Alpha helix）、22.20%的延伸（Extendedstand）、53.02%的隨機(jī)卷曲（Random coil）組成，屬于GT家族中的B類型且包含PSPG盒的保守序列。燈盞花的EbUF3GT基因與青蒿、艾草親緣關(guān)系較近，屬同一個分支，它們的UF3GT具有共同起源。EbUF3GT基因在根、莖、葉、花這幾個部位都能表達(dá)，尤其在花中的表達(dá)量最高，干旱脅迫也會增加它的表達(dá)。結(jié)論：通過對EbUF3GT研究，為進(jìn)一步探索EbUF3GT基因在燈盞花類黃酮次生代謝產(chǎn)物合成和調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 燈盞花；糖基轉(zhuǎn)移酶；黃酮；基因克?。簧镄畔W(xué)

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.13.001

燈盞花[Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.]又名短亭飛蓬，為菊科（Compositae）飛蓬屬（Erigeron）多年生植物，主要分布在我國西南地區(qū)，是云南省最具發(fā)展?jié)摿Φ乃幱弥参镏?，具有通?jīng)、活血、止痛的藥用功效[1]。燈盞花的野生資源和主要種植基地集中在云南紅河、大理等地[2]，目前人工種植已成為燈盞花藥材的主要來源，但有效成分高、抗性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣的優(yōu)良品種選育一直是燈盞花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[2-4]。因此，基于分子機(jī)制研究燈盞花關(guān)鍵活性成分的生物合成、生物及非生物抗性機(jī)制，對培育優(yōu)良燈盞花品種尤為迫切。

燈盞花富含黃酮[5]。黃酮具有廣泛的生物活性和健康益處，是一種重要的天然營養(yǎng)素。糖基化修飾是一種常見的生物化學(xué)修飾過程，特別是在植物的次生代謝產(chǎn)物中。這一修飾過程通常由UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）催化完成。UGT能夠?qū)⑻腔鶑腢DP-糖分子上轉(zhuǎn)移，并連接到不同的底物分子上，從而形成糖基化產(chǎn)物。類黃酮化合物的糖基化反應(yīng)通常發(fā)生在相對容易接受糖基化修飾的羥基位置，如3-OH、5-OH和7-OH。其中UF3GT在類黃酮化合物的糖基化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它催化將葡萄糖從尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖分子轉(zhuǎn)移至花青素或類黃酮的3-OH位置上，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的花色苷和類黃酮3-O-糖苷類化合物（見圖1）[6-7]。由此，苷類化合物可穩(wěn)定存在并運(yùn)輸?shù)揭号葜匈A存，為后續(xù)修飾反應(yīng)提供先決條件，在類黃酮生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用[8-9]。目前，3GT作為催化類黃酮化合物最重要的修飾糖基化的酶，在植物研究中受到廣泛關(guān)注。例如，研究者通過基因克隆和蛋白質(zhì)工程在甘藍(lán)中得到以UDP-葡萄糖，促進(jìn)生成飛燕草素3-O-葡萄糖苷，從而增加黃酮含量[10]；在甘薯中完成3GT基因的克隆，驗(yàn)證其與其他植物的同源性，通過其的過表達(dá)可增加黃酮含量[11]。

盡管目前很多學(xué)者都對燈盞花的藥理活性及其活性物質(zhì)合成途徑進(jìn)行了研究，但燈盞花中類黃酮合成途徑合成的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶——3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）的研究還鮮有報(bào)導(dǎo)。為此，本研究根據(jù)課題組前期的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，篩選出了燈盞花3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（EbUF3GT）的部分序列，利用RACE基因克隆，獲得了燈盞花EbUF3GT基因全長的cDNA，再利用生物信息學(xué)對其序列進(jìn)行分析以預(yù)測功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對后續(xù)培育高含量黃酮成分的燈盞花品種具有一定參考價值。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用燈盞花種植于教育部可持續(xù)能源開發(fā)利用工程中心。新鮮葉片用于總RNA提取。總RNA用于合成cDNA第一鏈。

pMD18-T載體購自大連寶生物公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購買于北京Trans Gene公司。

1.2" 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" 擴(kuò)增cDNA

克隆燈盞花EbUF3GT的cDNA部分片段?；厥漳康钠危z回收試劑盒 TIANgel Midi Purification Kit 購自天根公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，菌液PCR驗(yàn)證陽性克隆，純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工直接測序。

1.2.2" EbUF3GT 3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增

設(shè)計(jì)引物EbUF3GT基因的特異性引物A235-1（GSP1）F：AGGCACGTCGCGGTTTTCG；R：TCAAAG GGTGGCACTAGTG、A235-2 （GSP2）5′-ATCAGAGAA TAGGCCTTGGT-3′、A235-3 （GSP3）5′-TTGCAGTGCC AAAGAATGAA-3′（見表1）。

采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒獲得該基因的5′端序列。操作過程中使用到的EP管和槍頭需經(jīng)0.1% DECP水浸泡過夜處理，并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3" 生物信息學(xué)分析

對EbUF3GT基因cDNA全長進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)信息預(yù)測基因的結(jié)構(gòu)和功能，利用NCBI查找該基因的ORF序列并推測其氨基酸序列，采用NCBI Blastp蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫收集EbUF3GT的同源蛋白序列，利用DNAMAN和Jalview軟件對EbUF3GT同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對，通過MEGA軟件，采用鄰接法繪制EbUF3GT系統(tǒng)發(fā)育樹。利用ProtScale預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水性/親水性，通過Expasy的ProtParam tool推測蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)。

1.2.4" 燈盞花的黃酮含量測定

燈盞花黃酮含量測定參照王夢欽[12]的方法，使用同一時期正常澆水的燈盞花根、莖、葉、花和干旱脅迫后燈盞花的葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行黃酮含量測定。

1.2.5" EbUF3GT基因qRT-PCR分析

將燈盞花根、莖、葉、花采集后分別放入液氮中，并在液氮中研磨樣品，用Trizol法提取總RNA。利用實(shí)時熒光定量PCR儀對EbUF3GT進(jìn)行表達(dá)分析，生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次。

2" 結(jié)果與分析

2.1" EbUF3GT的克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)已有的燈盞花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，設(shè)計(jì)EbUF3GT特異性引物，利用末端克隆技術(shù)分別擴(kuò)增獲得EbUF3GT基因的5′和3′末端序列分別為259 bp、270 bp（見圖2 B-C），將EbUF3GT基因與pMD 18-T克隆載體連接，驗(yàn)證后測序，利用Blast進(jìn)行同源序列比對，確定擴(kuò)增條帶為目的基因。

2.2" 燈盞花EbUF3GT的核酸序列信息分析

將克隆的EbUF3GT進(jìn)行測序，獲得序列用ORF Finder查找EbUF3GT的最大開放閱讀框（ORF）。發(fā)現(xiàn)克隆cDNA的ORF長1 395 bp，編碼464個氨基酸。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫ProtParam軟件在線分析的結(jié)果顯示，其蛋白分子量51 850.48，理論等電點(diǎn)為5.48。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行功能區(qū)域分析，結(jié)果表明EbUF3GT包含糖基轉(zhuǎn)移酶-GTB-超型家族的結(jié)構(gòu)域，表明所克隆的基因?qū)儆贕T家族中的B類型（見圖3）。

依據(jù)ProtScale疏水性/親水性的規(guī)律，預(yù)測結(jié)果表明在多肽鏈的第20位氨基酸最高分值為2.2，疏水性最強(qiáng)（見圖4）。在多肽鏈的第10位氨基酸最低分值為-2.6，親水性最強(qiáng)，于是可以推測此蛋白為親水性蛋白。TMHMM分析結(jié)果顯示基因EbUF3GT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析，由圖可知該相關(guān)基因有半跨膜結(jié)構(gòu)域，因此有半跨膜區(qū)，說明EbUF3GT的蛋白質(zhì)是與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白（見圖5）。利用GORIV程序?qū)bUF3GT基因的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明EbUF3GT蛋白由24.78%的α-螺旋（Alpha helix ）、22.20%的延伸（Extendedstand）、53.02%的隨機(jī)卷曲（Random coil）組成（見圖6）。利用SWISS-MODEL軟件用2acv為模板對EbUF3GT蛋白序列進(jìn)行同源模建，獲得其三維結(jié)構(gòu)（見圖7）。EbUF3GT蛋白的預(yù)測三維結(jié)構(gòu)與2acv為模板空間結(jié)構(gòu)類似，同源性為81.75%。EbUF3GT蛋白預(yù)測三維結(jié)構(gòu)的分辨率：2.00 ?，Ramachandran Favoured數(shù)值為94.21%，表明這個三級結(jié)構(gòu)是可靠的。

2.3" 燈盞花EbUF3GT蛋白序列信息分析

將EbUF3GT氨基酸序列與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對，發(fā)現(xiàn)該EbUF3GT與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他植物的基因同源性很高，與向日葵（登錄號：KAD30680651）、薇甘菊（登錄號：AK123632.1）、煙草（登錄號：XP-0192354401）、白楊（登錄號：XP-03487573）、馬鈴薯（登錄號：XP-00634358.1）、青蒿（登錄號：PWA96182.1）、山茶（登錄號：BAF49310.1）、獼猴桃（登錄號：GF206465.1）、柳樹（登錄號：KAB5530141.1）、艾草（登錄號：GEU57219.1）等親緣較近，與葡萄（登錄號：CZS70601.1）、高粱（登錄號：AAF17077.1）等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，通過DNAMAN和Jalview軟件對該EbUF3GT基因與以上12個UF3GT基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比較（見圖8）。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)EbUF3GT蛋白含有糖基轉(zhuǎn)移酶中的一個高度保守序列PSPG盒。PSPG對結(jié)合糖基供體有關(guān)鍵作用（見圖9）。再利用MEGA對以上的同源性比對結(jié)果繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明燈盞花的EbUF3GT基因與同為菊科的青蒿、艾草親緣關(guān)系較近，屬同一個分支，表明EbUF3GT在菊科中具有一定的保守型（見圖10）。

2.4" 燈盞花不同部位和不同處理的黃酮含量測定

對燈盞花不同組織中黃酮含量的測定表明，黃酮含量在花中的含量最高（0.95±0.11 mg·mL-1），葉和莖中黃酮含量分別為0.65±0.1 mg·mL-1和0.75±0.1 mg·mL-1，根中黃酮含量最少（見圖11-A）。將干旱脅迫和正常澆水處理的葉片相比較，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會使黃酮含量上升（見圖11-B） 。

2.5" 燈盞花不同部位和不同處理中EbUF3GT基因表達(dá)水平

通過qRT-PCR分析燈盞花不同組織中EbUF3GT基因的表達(dá)水平，EbUF3GT在不同的組織中顯示出明顯的表達(dá)差異（見圖12），尤其在花中的表達(dá)量最高，根的表達(dá)量最小。干旱處理后葉片中EbUF3GT的表達(dá)量也顯著上升。上述結(jié)果表明不同組織和不同干旱處理中的黃酮含量變化一致，表明EbUF3GT在類黃酮的合成中具有重要作用。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 討論

燈盞花作為云南歷史悠久的民間藥物，目前在云南已有較為完善的種植體系和臨床治療藥物研發(fā)體系，但品質(zhì)改善和藥物創(chuàng)新技術(shù)依舊薄弱[12]。燈盞花產(chǎn)業(yè)面臨著野生資源不斷減少而人工栽培種存在自交衰退等問題，在藥效方面制劑適應(yīng)癥范圍狹窄，也嚴(yán)重限制了燈盞花產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2]。UF3GT是植物類黃酮-3-O-葡萄糖苷化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一[8，13]，目前已有很多學(xué)者對類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行深入研究，為挖掘類黃酮生物合成途徑和功能奠定了基礎(chǔ)[14-16]。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，燈盞花活性物質(zhì)基因的研究得到了越來越多的關(guān)注，也為改良其品質(zhì)提供了新的思路。

本文從生物信息學(xué)角度，對不同植物來源的13個UF3GT基因的核酸及蛋白質(zhì)序列的組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、蛋白質(zhì)保守功能域及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測和分析發(fā)現(xiàn)，EbUF3GT的ORF全長1 395 bp，編碼464個氨基酸，其蛋白分子量51 850.48，理論等電點(diǎn)為5.48，大部分蛋白呈親水性，均存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)。EbUF3GT基因有半跨膜結(jié)構(gòu)域，因此有半跨膜區(qū)，說明EbUF3GT的蛋白質(zhì)是與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明EbUF3GT蛋白由24.78%的α-螺旋、22.20%的延伸鏈、53.02%的隨機(jī)卷曲組成。在氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析過程中，多數(shù)蛋白進(jìn)化過程中具有保守性和多樣性，不同物種間的進(jìn)化可能存在一種定向趨勢，導(dǎo)致在某些分支上發(fā)生共同的變化，有物種內(nèi)獨(dú)特的平行進(jìn)化同源基因。

EbUF3GT在花的表達(dá)量最高，根的表達(dá)量最小。干旱處理后葉片中EbUF3GT的表達(dá)量也顯著上升。上述結(jié)果表明不同組織和不同處理中的黃酮含量變化一致。我們推測EbUF3GT在類黃酮合成過程中起著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化作用，參與了這些活性成分的糖基化過程。

3.2" 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)為燈盞花3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的功能解析和生物合成研究提供理論基礎(chǔ)。通過生物信息學(xué)分析可望為本實(shí)驗(yàn)室后期對燈盞花EbUF3GT在原核中的異源表達(dá)及黃烷酮糖的生物合成提供理論基礎(chǔ)。本研究為今后采用生物技術(shù)提高藥用植物燈盞花的黃酮含量，促進(jìn)燈盞花高品質(zhì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）

收稿日期：2024-02-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（3196020302）。

作者簡介：莫維淼（1998—），女，在讀碩士，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：mokvimmiu@163.com。

*為通信作者，E-mail：zhyun-feng001@163.com。