摘要過(guò)氧亞硝酸根離子（ONOO?）是非常活躍的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）物種，因具有高氧化性和強(qiáng)硝化性而備受關(guān)注。ONOO?作為一種重要的生理活性分子，其在體內(nèi)的水平異常會(huì)損害細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和DNA，從而導(dǎo)致生物體內(nèi)炎癥和其它嚴(yán)重疾病的發(fā)生。近年來(lái)，研究者利用熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物活性分子的快速且靈敏的監(jiān)測(cè)，并借助成像工具進(jìn)行了高分辨率示蹤，其中開(kāi)發(fā)了許多用于檢測(cè)ONOO?的有機(jī)小分子熒光探針。本文評(píng)述了近年來(lái)基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ESIPT）等多種熒光響應(yīng)機(jī)理構(gòu)建的ONOO?熒光檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞過(guò)氧亞硝酸根離子；熒光檢測(cè)；熒光響應(yīng)機(jī)理；評(píng)述

過(guò)氧亞硝酸根離子（ONOO?）是一種內(nèi)源性氧化劑和親核試劑，在一些病理狀態(tài)和衰老過(guò)程中起中介作用，由于具有瞬態(tài)和低穩(wěn)定態(tài)特性，在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展迅速。在生物體內(nèi)， ONOO?可通過(guò)超氧自由基和一氧化氮（NO）之間的擴(kuò)散控制反應(yīng)而生成，對(duì)細(xì)胞成分具有強(qiáng)硝化性，可對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 造成不可逆的損害[1]；此外， ONOO?的異常表達(dá)被認(rèn)為是許多疾病的關(guān)鍵致病因素，包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、炎癥和癌癥等[2]。因此，建立靈敏且高效的生物系統(tǒng)內(nèi)ONOO?活性分析檢測(cè)方法對(duì)基礎(chǔ)研究、臨床診斷和病理探究等方面具有重要意義。

目前， ONOO?的檢測(cè)方法有分光光度法[3]、化學(xué)發(fā)光法[4]、電子順磁共振法[5]、免疫化學(xué)法[6]、色譜法[7]和熒光光譜法[8]等。其中，熒光光譜法因具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及易實(shí)現(xiàn)原位成像等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，探針?lè)肿油ǔ?huì)經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)（苯硼酸或苯硼酸酯、酰肼、苯并吡喃和吲哚酮）、水解反應(yīng)（二苯基亞磷酸酯）以及基于C=C/C=N 鍵氧化裂解等對(duì)ONOO?進(jìn)行反應(yīng)識(shí)別[11-15]?；谶@些識(shí)別反應(yīng)類(lèi)型已開(kāi)發(fā)出基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ESIPT）和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）等多種熒光響應(yīng)機(jī)理的熒光檢測(cè)方法。隨著熒光成像技術(shù)的快速發(fā)展，這些基于不同熒光機(jī)理設(shè)計(jì)的熒光探針已在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、炎癥、肝腎肺功能性疾病、腫瘤及癌細(xì)胞檢測(cè)等病理模型中實(shí)現(xiàn)了對(duì)ONOO?的檢測(cè)應(yīng)用[16]。本文以熒光響應(yīng)機(jī)理為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地評(píng)述了近年來(lái)有機(jī)小分子探針對(duì)ONOO?的熒光檢測(cè)及其檢測(cè)響應(yīng)機(jī)理的研究進(jìn)展。

1 有機(jī)小分子熒光探針檢測(cè)ONOO?的研究進(jìn)展

1.1 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移

ICT 指一類(lèi)具有典型的D-π-A 或D-A 結(jié)構(gòu)的熒光探針?lè)肿铀鸬臒晒忭憫?yīng)機(jī)理，可以產(chǎn)生明顯的推-拉電子效應(yīng)，在特定的激發(fā)波長(zhǎng)條件下，通過(guò)π電子共軛體系使供體基團(tuán)與受體基團(tuán)部分反應(yīng)前后的能隙差發(fā)生變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)ICT，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。此類(lèi)響應(yīng)機(jī)理通常在比率型熒光探針?lè)肿又袘?yīng)用廣泛，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的靈敏檢測(cè)。

硼酸芐酯或硼酸酯結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常應(yīng)用于ICT 型探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成策略，用于構(gòu)建比率型[17-23]或“Turn-on”型[24-29]熒光探針?lè)肿樱瑢?shí)現(xiàn)對(duì)ONOO?的高效檢測(cè)。以萘酰亞胺結(jié)構(gòu)探針?lè)肿訛槔?jiǎn)述其反應(yīng)機(jī)理。如圖1 所示， ONOO?首先攻擊硼原子，并通過(guò)氧化重排生成硼酸苯酯，通過(guò)水解和去除二烯酮生成化合物1；負(fù)氧離子的給電子能力強(qiáng)于烷氧基，這將導(dǎo)致ICT 效應(yīng)在激發(fā)態(tài)下形成強(qiáng)“推-拉”體系，并導(dǎo)致去質(zhì)子化化合物1 的吸收峰和熒光峰的波長(zhǎng)大于原分子（圖1A）[19]。2022 年， Sun 等[19]基于上述機(jī)理，通過(guò)引入對(duì)甲苯磺酰胺作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向基團(tuán)構(gòu)建了一種比率型熒光探針F1（圖1B），該探針具有靈敏度高（6 s）和選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，被成功應(yīng)用于抑郁小鼠的海馬中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處內(nèi)源性O(shè)NOO?的成像檢測(cè)。Wang 等[27]引入硼酸芐酯基團(tuán)構(gòu)建了“Turn-on”型探針?lè)肿覨2（圖1B），在寬pH 值范圍（pH 7.0～11.5）內(nèi)對(duì)ONOO?顯示出高熒光響應(yīng)，在同一激發(fā)波長(zhǎng)（421 nm）下，響應(yīng)前存在弱的ICT 效應(yīng)，熒光不明顯；響應(yīng)后分子本身強(qiáng)的ICT 效應(yīng)使500 nm 處出現(xiàn)強(qiáng)熒光發(fā)射，基于此成功監(jiān)測(cè)了癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中ONOO?的含量。相較于比率型熒光探針?lè)肿?，“Turn-on”型探針?lè)肿优cONOO?響應(yīng)后的熒光檢測(cè)效果更好。

磷酸二苯酯或二苯基磷酰胺結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常應(yīng)用于ICT 型探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成策略[30-35]。2019 年，Yuan 等[30]在異氟爾酮分子骨架中引入基于磷酸二苯酯結(jié)構(gòu)合成了探針?lè)肿覨3， F3 與ONOO?響應(yīng)后可觀察到665 nm 處的熒光明顯增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞和斑馬魚(yú)中ONOO?的熒光檢測(cè)，推測(cè)其相關(guān)反應(yīng)機(jī)理為：ONOO?首先攻擊磷原子并通過(guò)氧化重排生成化合物2，進(jìn)一步水解脫除二苯基磷酸形成強(qiáng)ICT 效應(yīng)分子化合物3，達(dá)到熒光增強(qiáng)的目的（圖2A）?；谙嗤淖R(shí)別基團(tuán)及熒光機(jī)理， Luo 等[34]以苯并吡喃腈為母核構(gòu)建了雙光子熒光探針?lè)肿覨4（圖2B）， F4 與ONOO?反應(yīng)，導(dǎo)致原探針結(jié)構(gòu)中的磷酰胺鍵斷裂并形成氨基，使得ICT 效應(yīng)恢復(fù)，在685 nm 處發(fā)出近紅外熒光信號(hào)，檢出限為151 nmol/L，實(shí)現(xiàn)了大鼠癲癇模型中ONOO?的熒光成像檢測(cè)。Sonawane 等[35]基于苯并吲哚菁結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了探針?lè)肿覨5（圖2B）。與F4 相比， F5 雖然在近紅外區(qū)沒(méi)有熒光響應(yīng)，但其特有的鹽類(lèi)結(jié)構(gòu)使得探針的水溶性增強(qiáng)，具有更高的ONOO?檢測(cè)靈敏度（檢出限為47.8 nmol/L， 吸收紅移91 nm）。

大共軛結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常被引入ICT 型探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成策略，以獲得比率型熒光探針?lè)肿覽36-39]。2020 年， Lu 等[37]基于雙鍵氧化機(jī)理，以羅丹明結(jié)構(gòu)為母核構(gòu)建了探針?lè)肿覨6（圖2C），吸收光譜表明，F(xiàn)6 在600 nm 處出現(xiàn)明顯的吸收峰， 414 nm 有一個(gè)弱的吸收峰；熒光光譜顯示，隨著加入的ONOO?濃度增大， 564 nm 處的熒光發(fā)射逐漸增強(qiáng)， 700 nm 處的熒光發(fā)射強(qiáng)度不斷降低，這可能是因?yàn)镺NOO?觸發(fā)了探針?lè)肿咏Y(jié)構(gòu)中的聯(lián)二烯橋斷裂，破壞了熒光分子特定的ICT 結(jié)構(gòu)。F6 被成功應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理模型中ONOO?表達(dá)水平的檢測(cè)，檢出限低至28.06 nmol/L。2021 年， Li 等[38]設(shè)計(jì)并合成了探針?lè)肿覨7（圖2C），其識(shí)別機(jī)理與F6 類(lèi)似。F7 與ONOO?作用后，在500 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，在548 nm 處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，在662 nm 處的熒光強(qiáng)度減弱。F7 具有優(yōu)異的靈敏度，基于I548/I662 比率型熒光變化檢出限為47 nmol/L。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在母核結(jié)構(gòu)相同的條件下（圖2C），延長(zhǎng)共軛骨架可增加探針?lè)肿拥陌l(fā)射波長(zhǎng)，并可更好地應(yīng)用于ONOO?的高靈敏檢測(cè)。

此外，還有其它結(jié)構(gòu)的ICT型探針?lè)肿咏Y(jié)構(gòu)[40-44]。Liu等[40]基于萘酰亞胺結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了“Turn-on”型探針?lè)肿覨8（圖3A），與ONOO?發(fā)生反應(yīng)后，裸露的氨基使得化合物4 的ICT 效應(yīng)增強(qiáng)，在548 nm 處的熒光明顯增強(qiáng)，與其它“Turn-on”型探針不同的是， F8 與ONOO?作用后吸收峰由460 nm 藍(lán)移至431 nm。Wang 等[44]設(shè)計(jì)合成了“Turn-off”型探針?lè)肿覨9，在ONOO?存在的條件下， F9 的熒光信號(hào)在19 s 內(nèi)降低了40 倍。F9 可以特異性靶向肝臟，用于監(jiān)測(cè)藥物引起的肝毒性后的體內(nèi)肝保護(hù)藥物的治療效果（圖3A）。

扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）是一種會(huì)淬滅熒光并大幅降低染料光穩(wěn)定性的光物理過(guò)程。在此過(guò)程中，分子的給體或受體片段逐漸扭轉(zhuǎn)至垂直構(gòu)型，使得電荷完全分離。抑制TICT 的發(fā)生能夠顯著提高熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性，多數(shù)的TICT 型熒光探針?lè)肿又饕獞?yīng)用于細(xì)胞微環(huán)境中黏度的檢測(cè)。近年來(lái)， TICT型熒光探針?lè)肿右脖挥糜贠NOO?和黏度的雙響應(yīng)熒光檢測(cè)[45-46]。2020 年， Deng 等[45]將長(zhǎng)共軛的N，N-二甲基苯基及苯硼酸引入喹啉結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建了探針?lè)肿覨10，在ONOO?的作用下， F10 脫除苯硼酸得到更強(qiáng)的熒光響應(yīng)（420 nm 激發(fā)，在635 nm 處熒光增強(qiáng)），被成功應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)肝毒性中ONOO?和黏度的雙響應(yīng)檢測(cè)（圖3B）。長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)的引入，不僅可實(shí)現(xiàn)探針?lè)肿訉?duì)ONOO?長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)的熒光響應(yīng)，而且可構(gòu)建ONOO?和黏度雙響應(yīng)探針?lè)肿?，進(jìn)一步擴(kuò)大其生物成像應(yīng)用范圍。

1.2 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

PET 是指熒光探針?lè)肿拥幕鶓B(tài)受到光等外界因素刺激后，其熒光團(tuán)的電子從最高能量占據(jù)軌道（HOMO）躍遷至最低能量未占軌道（LUMO），形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，進(jìn)而發(fā)生輻射躍遷，由于受到識(shí)別基團(tuán)分子軌道電子的影響，激發(fā)態(tài)電子回到基態(tài)的過(guò)程被阻礙，導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅。在實(shí)際熒光分子設(shè)計(jì)過(guò)程中，將PET 響應(yīng)機(jī)理引入到相關(guān)探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)中，可得到開(kāi)關(guān)型的熒光探針?lè)肿樱憩F(xiàn)出優(yōu)異的選擇性及靈敏度，在金屬離子和小分子檢測(cè)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

氟硼二吡咯（BODIPY）經(jīng)常作為優(yōu)勢(shì)骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)用于PET 型探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)與合成[47-49]。2016 年，Miao 等[47]基于BODIPY 結(jié)構(gòu)構(gòu)建了熒光探針F11（圖4A）， F11 與ONOO?結(jié)合之前具有強(qiáng)烈的PET 效應(yīng)，自身沒(méi)有熒光產(chǎn)生；與ONOO?反應(yīng)幾秒后， PET 猝滅過(guò)程即被阻斷，熒光響應(yīng)增強(qiáng)，基于此實(shí)現(xiàn)了ONOO?的超靈敏檢測(cè)（lt;2 nmol/L）。羅丹明及其衍生物也經(jīng)常作為優(yōu)勢(shì)骨架應(yīng)用于PET 型探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)與合成[50-54]。2018 年， Miao 等[50]設(shè)計(jì)了以Si-羅丹明為母核的熒光探針F12（圖4B），在ONOO?的氧化作用下， F12 的PET 效應(yīng)被有效抑制，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ONOO?的熒光檢測(cè)，并能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活細(xì)胞、組織和動(dòng)物外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO?的熒光成像標(biāo)記。此外，通過(guò)修飾其它常見(jiàn)類(lèi)型的熒光母核也可實(shí)現(xiàn)對(duì)ONOO?的“Turn-on”響應(yīng)，得到具有不同熒光性能的PET 型熒光探針?lè)肿覽55-57]。如以香豆素和萘二酰亞胺為母核的熒光染料通過(guò)引入不同的識(shí)別基團(tuán)分別構(gòu)建了具有雙響應(yīng)性能的探針F13[56]與能夠產(chǎn)生雙光子響應(yīng)的探針F14[57]（圖4C）。

1.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

FRET 是通過(guò)合適的連接基團(tuán)使供體（Donor， D）與受體（Acceptor， A）之間的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)變化。在探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)過(guò)程中引入FRET 熒光機(jī)理，可增加熒光探針?lè)肿拥乃雇锌怂梗⊿tokes）位移；另外，通過(guò)兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)強(qiáng)度的比值大小對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行比率型檢測(cè)可彌補(bǔ)單一發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)目標(biāo)分析物定量檢測(cè)的不足。

2016 年， Jia 等[ 58]通過(guò)乙?；?哌嗪-己?；鶎深?lèi)不同花菁類(lèi)分子進(jìn)行修飾得到探針F15，與ONOO?作用后， F15 分子結(jié)構(gòu)被破壞，抑制了分子內(nèi)的FRET 效應(yīng)，使得熒光發(fā)生顯著變化。F15 被用于線粒體內(nèi)ONOO?的比率型成像檢測(cè)研究。Cheng 等[59]通過(guò)在苯并吡喃鎓受體結(jié)構(gòu)中引入香豆素穩(wěn)定供體熒光團(tuán)，制備了線粒體靶向雙光子定量熒光探針F16，利用FRET 效應(yīng)的變化成功實(shí)現(xiàn)了炎癥小鼠模型中內(nèi)源性O(shè)NOO?的檢測(cè)和成像。在此基礎(chǔ)上， Xu 等[60]繼續(xù)引入萘酰亞胺結(jié)構(gòu)構(gòu)建熒光探針F17，用于關(guān)節(jié)炎模型中ONOO?的早期檢測(cè)和評(píng)估。Sun 等[61]將萘酰亞胺熒光團(tuán)與羅丹明B 熒光團(tuán)通過(guò)柔性哌啶連接形成雙光子熒光探針F18， F18 以二甲基氨基為溶酶體靶基團(tuán)，分子中酰肼部分可特異性識(shí)別ONOO?，成功實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞、組織和斑馬魚(yú)中ONOO?的雙發(fā)射通道成像檢測(cè)。Liu 等[62]通過(guò)哌啶及酰胺烷基鏈將Si-羅丹明結(jié)構(gòu)與氧雜蒽結(jié)構(gòu)結(jié)合，制備了近紅外熒光和光聲雙模態(tài)分子探針F19。F19 本身具備FRET 效應(yīng)，在ONOO?存在條件下，氧雜蒽雙鍵被氧化為醛基，熒光團(tuán)原有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞。F19被用于藥物性急性腎損傷中ONOO?的成像分析。2021 年， Liu 等[63]將羅丹明螺內(nèi)酰胺與萘酰亞胺熒光團(tuán)結(jié)合制備了線粒體靶向探針F20，利用F20 能夠在不同的熒光波長(zhǎng)下對(duì)過(guò)氧亞硝酸鹽和溶酶體融合引發(fā)的線粒體吞噬過(guò)程進(jìn)行研究。

FRET 型探針?lè)肿又型ǔ０?～2 種熒光團(tuán)，如花菁類(lèi)染料、香豆素類(lèi)、萘酰亞胺結(jié)構(gòu)、羅丹明及其衍生物等，利用這些探針?lè)肿涌蓪?shí)現(xiàn)ONOO?的比率型檢測(cè)，具有響應(yīng)迅速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)（表1）。

1.4 激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移

ESIPT 是處于激發(fā)態(tài)的熒光探針?lè)肿觾?nèi)質(zhì)子供體（如羥基或氨基基團(tuán)）與相鄰質(zhì)子受體（如亞胺或羰基基團(tuán)）之間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移從而形成互變異構(gòu)體，導(dǎo)致探針?lè)肿拥陌l(fā)射波長(zhǎng)紅移。

2016 年， Sedgwick 等[64]基于苯并噻唑結(jié)構(gòu)引入識(shí)別基團(tuán)芐基硼酸酯得到探針?lè)肿覨21，在ONOO?存在條件下，探針?lè)肿用摮S基硼酸酯生成“Turn-on”型高熒光強(qiáng)度化合物6，化合物6 的熒光強(qiáng)度是探針F21 的4.5 倍（圖5A）。2-（2-羥基苯基）苯并噻唑分子結(jié)構(gòu)（HBT）[65-72]常被用作ESIPT 型探針?lè)肿拥膬?yōu)勢(shì)骨架，通過(guò)與目標(biāo)化合物的作用使得質(zhì)子供體羥基與相鄰的氫鍵受體亞胺結(jié)構(gòu)之間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而形成互變異構(gòu)體，導(dǎo)致探針?lè)肿拥臒晒庠鰪?qiáng)（圖5B）。2021 年， Li 等[69]基于HBT 結(jié)構(gòu)制備了蝶形熒光探針F22， ESIPT 效應(yīng)及固態(tài)熒光性質(zhì)使得F22 具有大Stokes 位移（216 nm），對(duì)ONOO?具有高靈敏度，檢出限為5 nmol/L， 定量限為21 nmol/L， 可應(yīng)用于潛在指紋檢測(cè)。Li 等[70]在HBT 基礎(chǔ)上引入2-肼基喹啉得到“ESIPT+AIE”型探針?lè)肿覨23，在pH 3～10 條件下， F23 對(duì)ONOO?實(shí)現(xiàn)快速靈敏響應(yīng)（檢測(cè)時(shí)間6 s，檢出限為5.1 nmol/L）。Fu 等[71]將2-苯并噻唑乙腈結(jié)構(gòu)與萘酰亞胺結(jié)合制備了探針?lè)肿覨24，與ONOO?作用后， F24 在518 nm 下熒光增強(qiáng)34 倍，并在1～14 mmol/L 的范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系，檢出限為37 nmol/L（圖5B）。

此外，當(dāng)探針?lè)肿咏Y(jié)構(gòu)中質(zhì)子供體為羥基質(zhì)子且受體為羰基時(shí)，也容易產(chǎn)生ESIPT 效應(yīng)[73-75]。Wang 等[74]在分子結(jié)構(gòu)中引入三苯胺結(jié)構(gòu)，構(gòu)建“ESIPT+AIE”型探針?lè)肿覨25， Stokes 位移為142 nm，當(dāng)ONOO?濃度在0～10 μmol/L 范圍時(shí)存在線性響應(yīng)，檢出限為10 nmol/L，在632 nm 下熒光增強(qiáng)161 倍，可用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中ONOO?的成像檢測(cè)。Yu 等[75]在黃酮熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)中引入芐基硼酸酯，構(gòu)建大Stokes位移（133 nm）ESIPT型探針?lè)肿覨26，成功實(shí)現(xiàn)了HeLa細(xì)胞和斑馬魚(yú)中ONOO?的檢測(cè)（圖5C）。

綜上， ESIPT 型探針?lè)肿泳哂写蟮腟tokes 位移，對(duì)ONOO?表現(xiàn)出高靈敏度和高選擇性，可實(shí)現(xiàn)低濃度范圍內(nèi)的線性檢測(cè)。

1.5 其它響應(yīng)機(jī)理及雙響應(yīng)機(jī)理。

隨著熒光技術(shù)的迅速發(fā)展，基于其它響應(yīng)機(jī)理的熒光探針?lè)肿右脖挥糜贠NOO?的檢測(cè)研究[76-78]。2022 年， Wen 等[76]基于π共軛機(jī)理構(gòu)建了探針?lè)肿覨27。ONOO?不存在時(shí)，電子云聚焦在共軛苯并吡喃腈結(jié)構(gòu)單元上；ONOO?存在時(shí)，羅丹明內(nèi)酯開(kāi)環(huán)，使電子云集中在黃嘌呤核上并產(chǎn)生比率熒光信號(hào)變化（480 nm 激發(fā)，在570 nm 處熒光發(fā)射增強(qiáng)， 670 nm 處熒光減弱），成功應(yīng)用于活體細(xì)胞、炎癥組織和APAP 誘導(dǎo)的肝毒性中ONOO?的波動(dòng)監(jiān)測(cè)（圖6A）。鍵內(nèi)能量轉(zhuǎn)移（TBET）熒光探針通過(guò)化學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)能量受體的能級(jí)間隙而控制能量傳遞，該機(jī)理不需要能量供體和受體之間的光譜重疊，只需要能量間隙存在差異，即可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)發(fā)射信號(hào)的基線分離，從而減少發(fā)射之間的串?dāng)_，高能量傳遞效率可顯著提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此這種機(jī)理已成為構(gòu)建比率型熒光探針的經(jīng)典策略。Hu 等[77]基于TBET 機(jī)理構(gòu)建了線粒體靶向雙光子比率熒光探針F28。隨著線粒體黏度降低和ONOO?含量升高，在810 nm 雙光子激發(fā)下， F28 的最大發(fā)射波長(zhǎng)由621 nm 移至495 nm， 兩個(gè)發(fā)射峰的基線顯著分離（Δλ = 126 nm），提高了生物成像的分辨率和可靠性（圖6B）。

此外，研究者結(jié)合以上兩種響應(yīng)機(jī)理開(kāi)發(fā)了新型熒光探針?lè)肿佑糜贠NOO?的檢測(cè)研究。2018 年，Guo 等[79]基于TBET 和ICT 雙機(jī)理構(gòu)建了近紅外（720 nm）熒光探針F29， ONOO?存在時(shí)，硼酸酯轉(zhuǎn)化為苯酚，導(dǎo)致供體的能量增加以匹配受體的能量，同時(shí)實(shí)現(xiàn)供體和受體之間的TBET 和ICT 效應(yīng)，導(dǎo)致紅移區(qū)域中的熒光“Off-on”，并產(chǎn)生較大的發(fā)射偏移（183 nm）， 檢出限為3.54 mmol/L（圖7A）。Zhou 等[80]設(shè)計(jì)合成了“PET+ICT”型雙光子熒光探針F30，其檢測(cè)機(jī)理如下：1，4-二羥基苯通過(guò)PET 效應(yīng)有效地猝滅了分子自身的熒光，抑制了ICT 過(guò)程， ONOO?存在時(shí)， 1，4-二羥基苯易被氧化脫除，由于增強(qiáng)的ICT 效應(yīng)和形成羥基所誘導(dǎo)的PET 抑制效應(yīng)，使得萘酰亞胺的強(qiáng)熒光恢復(fù)，基于此實(shí)現(xiàn)了急性肝損傷小鼠肝臟中ONOO?的檢測(cè)（圖7A）。2022 年， Sun 等[81]選擇HBT 骨架結(jié)合氰基苯形成“PET+ESIPT”型熒光探針F31，當(dāng)pH 值從8.0 降至3.0 時(shí)，探針在525 和710 nm 處的熒光信號(hào)增加了約4 倍。其中， 525 nm 處的熒光變化主要?dú)w因于PET 效應(yīng)， 710 nm 處的熒光增強(qiáng)主要?dú)w因于酸誘導(dǎo)的開(kāi)閉循環(huán)。ONOO?存在時(shí)，525 nm 處的熒光增加了5 倍，而710 nm 處的熒光強(qiáng)度顯著減弱，由此產(chǎn)生了不同的熒光強(qiáng)度變化，在I525/I710 處表現(xiàn)出明顯的比率型熒光變化（圖7A）。Zhou 等[82]在羅丹明基礎(chǔ)上通過(guò)連接基團(tuán)引入萘酰亞胺結(jié)構(gòu)，得到具有“PET+FRET”型響應(yīng)雙機(jī)理的探針?lè)肿覨32（圖7B）， F32 能夠?qū)崿F(xiàn)在不同通道下分別監(jiān)測(cè)細(xì)胞中pH 值和內(nèi)源性O(shè)NOO?熒光成像變化，實(shí)現(xiàn)了比率型檢測(cè)。Jing 等[83]將苯并吡喃鎓與香豆素?zé)晒鈭F(tuán)通過(guò)哌啶連接形成雙位點(diǎn)“ICT+FRET”型熒光探針F33（圖7B），可實(shí)現(xiàn)線粒體中GSH 與ONOO?的同時(shí)檢測(cè)，并且發(fā)現(xiàn)GSH 的耗竭和ONOO?的間接形成與APAP 誘導(dǎo)的肝損傷有關(guān)， GSH 可有效緩解APAP 誘導(dǎo)的肝損傷。

2 總結(jié)與展望

隨著熒光檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展， ONOO–的熒光檢測(cè)方法研究取得了很大進(jìn)展，并且在疾病病理模型中廣泛應(yīng)用。本文主要對(duì)探針?lè)肿颖旧砘蚺cONOO–響應(yīng)前后所產(chǎn)生的ICT、PET、FRET、ESIPT 及其它雙效應(yīng)熒光響應(yīng)機(jī)理方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。從目前的研究情況分析， ONOO–的熒光檢測(cè)研究仍存在發(fā)展空間：（1）熒光探針?lè)肿泳哂胁豢赡娴捻憫?yīng)特性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)ONOO–的動(dòng)態(tài)/實(shí)時(shí)檢測(cè)；（2）探針?lè)肿拥陌l(fā)射波長(zhǎng)僅停留在可見(jiàn)光區(qū)或NIR-Ⅰ區(qū)，尤其是NIR-Ⅱ區(qū)ONOO–的熒光檢測(cè)報(bào)道甚少，因此，需要基于ICT 響應(yīng)機(jī)理引入長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型長(zhǎng)波長(zhǎng)的探針?lè)肿?，以增加其組織穿透深度，更加有效地應(yīng)用到疾病的診斷和治療中；（3）探針?lè)肿拥乃苄杂邢蓿锒拘暂^高，抗干擾性和穩(wěn)定性較差，因此，可在后續(xù)設(shè)計(jì)過(guò)程中結(jié)合雙響應(yīng)機(jī)理構(gòu)建多功能分子，借助聚合物或者納米技術(shù)提高水溶性及生物相容性；（4）探針?lè)肿釉诩膊〔±Ｐ椭械倪x擇性和靈敏度有待提高，因此，仍需基于PET 和FRET響應(yīng)機(jī)理設(shè)計(jì)合成生物活性穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強(qiáng)和靶向性好的熒光探針。未來(lái)，希望基于更多新型響應(yīng)機(jī)理建立ONOO–的熒光探針設(shè)計(jì)合成策略，也可通過(guò)多種響應(yīng)機(jī)理結(jié)合的形式進(jìn)一步改善探針的光穩(wěn)定性、生物分析的選擇性和靈敏度以及目標(biāo)組織和器官的靶向性。

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陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（Nos. 2021SF-439， 2023-YBSF-577， 2023-YBSF-275）資助。