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        雞傳染性喉氣管炎病毒SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

        2024-08-22 00:00:00張玉霞董雯雯袁小遠(yuǎn)孟凱徐懷英
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年6期
        關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性敏感性

        關(guān)鍵詞:雞喉氣管炎病毒;TK基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;特異性;敏感性;重復(fù)性

        中圖分類號(hào):S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2024)06-0128-05

        雞傳染性喉氣管炎是由喉氣管炎病毒(Infec-tious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一種急性、接觸性呼吸道傳染病,主要侵染雞的喉頭和氣管上皮細(xì)胞,同時(shí)也對(duì)雞鼻竇、氣囊和肺組織產(chǎn)生影響,被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的疾病。ILTV首次于20世紀(jì)30年代報(bào)道自美國,屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科,病毒粒子為直徑85~105nm的正20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu),有囊膜,是危害雞集約化養(yǎng)殖的主要病毒性呼吸道傳染病致病菌之一。近年來,在山東、江蘇、河北等部分地區(qū),雞傳染性喉氣管炎的發(fā)病率不僅在蛋雞中增高,在蛋種雞和商品肉雞中也呈增加趨勢(shì)。

        ILTV只有一個(gè)血清型,臨床病變有嚴(yán)重和輕微兩種形式,嚴(yán)重者表現(xiàn)出呼吸困難、氣喘、咳出帶血分泌物等主要癥狀,發(fā)病率和致死率高達(dá)70%。該病易與其他呼吸道疾病,如新城疫、傳染性支氣管炎等混淆,因此建立一種快速有效的診斷方法對(duì)ILTV的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

        ILTV的基因組有79個(gè)開放閱讀框,編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和致病性蛋白,其中,TK基因編碼胸腺嘧啶激酶,在核酸代謝中起主要作用,是病毒的主要毒力基因,也是構(gòu)建基因缺失疫苗的主要靶標(biāo)。本研究對(duì)ILTV的TK基因保守區(qū)域進(jìn)行分析,利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)熒光定量PCR引物,建立了ILTV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,為ILTV的監(jiān)測(cè)與診斷提供技術(shù)支持。

        1材料與方法

        1.1病毒與臨床病料

        ILTV、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感H5(AIV-H5)、H9亞型滅活毒株(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)均由山東省禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。臨床樣本為2022年1月一2023年1月該實(shí)驗(yàn)室接收的病料組織,-80℃保存。

        1.2主要試劑

        SimplyP病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、18-T載體連接試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;SYBR Green Premix TaqTM

        1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)GenBank已公布的ILTV的TK基因保守序列,利用軟件Primer 5.0分別設(shè)計(jì)1對(duì)普通PCR引物和1對(duì)熒光定量PCR引物(表1),均由北京華大基因科技有限公司合成,離心后用ddH2O稀釋至10μmol/L,-20℃保存。

        1.4病毒核酸提取

        將儲(chǔ)存于-80℃的感染ILTV的雞尿囊液按照SimplyP病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA,于-80℃保存。

        1.5質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

        以ILTV DNA為模板,利用引物TK-P1/P2對(duì)TK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:Taq Mix12.5μL,上、下游引物各1.0μL,模板DNA 2.0μL,加ddH2O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

        用膠回收試劑盒純化回收330 bp處陽性目的片段:使用18-T載體連接試劑盒將純化回收片段與18-T載體16℃連接30 min后,按說明書轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞:在氨芐陽性的LB營養(yǎng)瓊脂平板上涂抹培養(yǎng)并篩選陽性克隆,挑取合格單菌落接入含氨芐的液體LB培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后基因測(cè)序。

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