摘 要：類鈣調(diào)蛋白（CML）是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中應(yīng)對(duì)刺激的一種重要蛋白，基于甜櫻桃全基因組，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)甜櫻桃CML基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子作用元件等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PavCML家族有49個(gè)基因，不均勻的分布于1～8號(hào)染色體上，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核等部位，啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)PavCML家族基因響應(yīng)多種元件。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示CML在裂果部位的相對(duì)表達(dá)量高，表明該基因可能參與裂果過程，為CML家族基因的功能鑒定提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；CML基因家族；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S662.5" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1002-2910（2024）02-0032-08

收稿日期：2024-02-19

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動(dòng)（2023TZXD059）；泰安市良種工程項(xiàng)目（2022NYLZ04）。

*通訊作者：魏國(guó)芹（1983-），女，山東曲阜人，副研究員，從事果樹育種及栽培研究工作。E-mail：guoqinw1983@126.com

作者簡(jiǎn)介：吳軍平（2000-），女，河南平頂山人，在讀碩士研究生，從事植物生理和分子相關(guān)研究。E-mail：16637515739@163.com

Bioinformatics analysis of CML gene family in sweet cherry

WU Junping1，F(xiàn)U Quanjuan2，GUO Yuanpeng3，HOU Sen2，SUN Yugang2，WEI Guoqin2*

（1.Shandong Agricultural University， Tai’an， Shandong 271018， China;2.Shandong Institute of Pomology， Tai’an， Shandong 271000， China；3.Juancheng County State Owned First Forest Farm， Heze， Shandong 274600， China）

Abstract：Calmodulin-like protein （CML） is an important protein in response to stimuli during plant growth and development. In this study， based on the whole genome sequence of sweet cherry， the members of sweet cherry CML gene family were identified using bioinformatics methods， and the physicochemical properties， chromosome localization， gene structure， and promoter elements were analyzed. The results showed that there were 49 genes in the PavCML family， which were unevenly distributed on chromosomes 1 to 8， and the subcellular localization was located in the cytoplasm， chloroplast and nucleus. Analysis of promoter cis-acting elements showed that PavCML family genes were involved in the response to a wide range of elements. Combined with transcriptome data， the RT-PCR results showed that the relative expression of PavCML was high in the fruit splitting site， indicating that the gene may be involved in the fruit splitting process， which provided a theoretical basis for the functional identification of CML family members.

Key words：sweet cherry; CML gene family; bioinformatics analysis

鈣離子作為植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最重要的信使之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可或缺［1］。但是游離的鈣并不能直接發(fā)揮作用，需要由植物體中存在的鈣離子傳感器結(jié)合鈣離子并進(jìn)行下游調(diào)控。目前植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有四種鈣離子結(jié)合蛋白：鈣調(diào)蛋白（CaM）［2］、類鈣調(diào)蛋白（CML）［3］、鈣調(diào)B樣蛋白（CBL）［4］和磷酸鈣調(diào)樣激酶（CDPK）［5］。類鈣調(diào)蛋白又稱鈣調(diào)樣蛋白或類鈣調(diào)素（Calmodulin-like proteins， CMLs），CML基因家族是植物中特有的鈣離子傳感器，是參與高等植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫、激素作用等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一類基因家族，它含有高度保守的EF-hand結(jié)構(gòu)域，呈螺旋-環(huán)-螺旋的結(jié)構(gòu)［6］。相關(guān)CML基因在不同部位和一些靶蛋白或者同其他基因一起發(fā)揮不同的功能［7］。不同的CML基因在不同發(fā)育階段、不同器官和不同刺激反應(yīng)存在明顯的差異表達(dá)。目前多種植物中都被鑒定，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有50個(gè)［8］、番茄中有52個(gè)［9］、水稻有32個(gè)［10］、甜瓜有54個(gè)［11］、大豆有68個(gè)［12］、棗中有23個(gè)［13］CML家族成員等。目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的50個(gè)CML基因中，AtCML12能介導(dǎo)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸［14］，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；AtCML18在植物生長(zhǎng)中能抵抗鹽脅迫［15］；AtCML24除了能抵抗鹽脅迫，還能響應(yīng)ABA和日光［16］；AtCML39在幼苗發(fā)育時(shí)期對(duì)病毒有抵抗作用［17］等。在棗中ZjCML13參與調(diào)控冬棗及其同源四倍體響應(yīng)低溫脅迫。在茶樹中CsCML16、CsCML18-2和CsCML42響應(yīng)鹽脅迫［18］，但甜櫻桃的CML家族成員和功能還并未見報(bào)道。

甜櫻桃（Prunus avium L.）成熟期遇雨裂果一直是影響果實(shí)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵問題。甜櫻桃裂果除與水分、品種、砧木、果實(shí)性狀、栽培措施等密切相關(guān)外，還與礦質(zhì)元素等密切相關(guān)。筆者通過對(duì)果實(shí)噴布氯化鈣溶液處理，探索CML家族跟鈣離子結(jié)合對(duì)甜櫻桃裂果的影響，通過生物信息學(xué)的方法鑒定了甜櫻桃的CML基因家族成員，為深入解析CML家族功能提供數(shù)據(jù)支持，為甜櫻桃分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甜櫻桃PavCML家族基因鑒定及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過對(duì)已經(jīng)發(fā)表的擬南芥的50個(gè)CML基因［20］在Tair（TAIR - Home Page （arabidopsis.org））網(wǎng)站上檢索并下載蛋白質(zhì)序列作為目標(biāo)序列，在GDR（https：//www.rosaceae.org/）數(shù)據(jù)庫中下載甜櫻桃Prunus avium Tieton Genome v1.0［21］基因組蛋白序列文件，通過TBtool［22］進(jìn)行Blast比對(duì)，在Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載 CML家族的結(jié)構(gòu)域模型文件（EF-hand_l：PF00036、EFhand_6：PF13405、EF-hand_7：PF13499、EF-hand_8：PF13833）［23］通過使用Simple HMM Search功能進(jìn)行比對(duì)，將這兩種方法一起篩選得到的結(jié)果通過NCBI的swiss-port功能查看注釋，去除掉一些注釋不為CML基因后再通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站篩選掉不含EF-hand的非保守序列，最終得到在甜櫻桃中的有49個(gè)PavCML基因，通過MEGA11軟件，將擬南芥和甜櫻桃的CML基因一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇Neighbor-joining tree，設(shè)置Bootstrap method的參數(shù)為1 000，Model選擇p-distance， Gaps選擇Complete deletion得到進(jìn)化樹，用iTOL網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）對(duì)進(jìn)化樹美化。

1.2 甜櫻桃PavCML染色體定位

通過在GDR網(wǎng)站上下載甜櫻桃GFF3文件對(duì)目標(biāo)基因以及基因在染色體的位置信息進(jìn)行提取后用在線網(wǎng)站MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）繪制染色體定位圖。

1.3 甜櫻桃PavCML蛋白理化性質(zhì)分析

將得到的PavCML蛋白序列復(fù)制到 Expasy （https：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站，對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸、分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過用WoLF PSORT網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 甜櫻桃PavCML基因家族Motif 結(jié)構(gòu)分析

使用TBtools 中的Simple MEME Wrapper工具進(jìn)行 Motif 分析，提交蛋白序列，默認(rèn)Mode選擇Zero or One Occur Per Seq，設(shè)置查找 20 個(gè) Motif 數(shù)。選擇Visualize MEME/MAST Motif Pattern進(jìn)行motif結(jié)果的可視化分析。

1.5 甜櫻桃PavCML基因結(jié)構(gòu)分析

選擇TBtools的Gene Struture View（Advanced）工具進(jìn)行提交基因組注釋文件來繪制基因家族的基因結(jié)構(gòu)。

1.6 甜櫻桃PavCML基因啟動(dòng)子順式作用原件分析

在GDR網(wǎng)站上下載甜櫻桃基因組數(shù)據(jù)，通過提取甜櫻桃基因組DNA序列上游2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)域文件上傳至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），將得到的結(jié)果通過TBtools的Simple BioSequence View進(jìn)行可視化繪制得到CML基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件。

1.7 擬南芥AtCML與甜櫻桃PavCML基因家族的共線性分析

使用 TBtools的Advanced Circos工具進(jìn)行共線性分析，繪制擬南芥與甜櫻桃的共線性圖。

1.8 RNA提取與熒光定量PCR分析

以9年生甜櫻桃布魯克斯為試材，于果實(shí)轉(zhuǎn)色期噴布自來水和0.5% 氯化鈣，以不噴施作對(duì)照，間隔2 d噴施1次，共3次。果實(shí)成熟采樣，每處理選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的3個(gè)結(jié)果枝。選取對(duì)照、噴自來水、噴鈣3種處理的裂果和不裂果部位分別進(jìn)行混合取0.1 g樣品提RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合，從中選出10個(gè)CML相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析。通過IDT（PrimerQuest - design qPCR assays | IDT （idtdna.com））進(jìn)行定量引物的設(shè)計(jì)，如表1。樣品RNA的提取采用諾貝萊多糖多酚試劑盒，反轉(zhuǎn)錄采用全式金試劑盒進(jìn)行第一條鏈的合成。熒光定量PCR試劑采用康為世紀(jì)的2x Magic SYBR Green Mixture ，定量?jī)x采用ABI 7500 Fast，體系為20 μL：10 μL 2x Magic SYBR Green Mixture，0.2 μL Rox，0.4 μL引物F，0.4 μL引物R，1 μL cDNA，8 μL dd H2O。程序設(shè)置為95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）40個(gè)循環(huán)，溶解曲線程序95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s。通過相對(duì)定量 2-ΔΔCt 方法計(jì)算，用Excel繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃PavCML基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過利用擬南芥50個(gè)CML基因作為參照基因，Blast后去除掉不含EF-hand結(jié)構(gòu)域的序列，得到49個(gè)PavCML基因，依次命名為PavCML1～ PavCML49。將擬南芥與甜櫻桃進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如下圖所示，表明PavCML7與AtCML12、PavCML18與AtCML18、PavCML43與AtCML23、AtCML15與PavCML25、AtCML24與PavCML24等有較高的同源性。研究表明AtCML24調(diào)控花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)，猜測(cè)PavCML24也有類似的生理功能。根據(jù)進(jìn)化樹可將其劃分A～G亞組，各類群數(shù)量不等，如圖1所示。

2.2 甜櫻桃PavCML基因家族的染色體定位分析

從甜櫻桃基因組注釋文件提取49個(gè)PavCML基因（圖2），這些基因不均勻的分布在8條染色體和一個(gè)sacf161碎片上，從圖中可看出在Chr1最長(zhǎng)，分布的PavCML基因最多，有15個(gè)，PaCML8單獨(dú)分布在scaf161碎片上，Chr2和Chr4上均有2個(gè)PavCML基因。

2.3 甜櫻桃PavCML基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

將得到的49個(gè)PavCML基因的蛋白序列提交到Expasy網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，如表2所示，發(fā)現(xiàn)該家族（Coding sequerce，CDS）長(zhǎng)度在152～2 391 bp，每個(gè)序列至少有2個(gè)及以上的手性（EF-hand）結(jié)構(gòu)域，氨基酸的長(zhǎng)度在101～796 aa。PavCML40的分子量最大約90 kDa，PavCML7、PavCML8、PavCML24、PavCML32這些分子量稍大些，其他基因都在20 kDa 左右。只有PavCML14的等電點(diǎn)超過7，為8.76，其他均在7以下，在3.69～6.49，即大多數(shù)PavCML基因是酸性氨基酸。根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該家族大部分基因分布在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體，說明該家族參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯等過程，少量分布在質(zhì)膜和液泡中。

2.4 甜櫻桃PavCML 基因家族Motif 結(jié)構(gòu)

得到的Motif如圖3所示，在這49個(gè)PavCML基因中都含有共同的Motif1，除了PavCML26和PavCML49，其他都含有Motif2結(jié)構(gòu)。PavCML7、PavCML9、PavCML10、 PavCML11、PavCML47這幾個(gè)基因都含有相同的Motif結(jié)構(gòu)分別是Motif1、Motif2、Motif13、Motif4、Motif5、Motif8、Motif19；PavCML34和PavCML22也含有相同的Motif結(jié)構(gòu)。還有PavCML1、 PavCML2、 PavCML3、 PavCML16、 PavCML19、PavCML23、 PavCML29、 PavCML35、 PavCML36等這些序列基因也呈現(xiàn)出相似的Motif結(jié)構(gòu)。

2.5 甜櫻桃PavCML基因結(jié)構(gòu)

PavCML家族的基因結(jié)構(gòu)中，一些基因含有較多的短片段的外顯子且沒有內(nèi)含子，如PavCML9、PavCML11、PavCML19、PavCML24、PavCML26、PavCML32、PavCML33、PavCML40、PavCML47等。PavCML1、PavCML2、PavCML3、PavCML4、PavCML5、PavCML13、PavCML23、PavCML25、PavCML27等基因既有內(nèi)含子，也有外顯子（圖4）。

2.6 甜櫻桃PavCML基因家族的順式作用元件

通過預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)PavCML基因家族大都有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件、赤霉素反應(yīng)性的順式作用元件、低溫響應(yīng)的順式作用元件、光敏色素下調(diào)表達(dá)的順式作用元件、水楊酸反應(yīng)性的順式作用元件、脫落酸反應(yīng)性的順式作用元件、涉及MeJA響應(yīng)性的順式作用調(diào)節(jié)元件、赤霉素反應(yīng)元件、光響應(yīng)元件等（圖5），表明CML基因家族的廣泛作用，這些基因元件中含有的有光響應(yīng)元件和防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件，則證明該基因家族能廣泛應(yīng)對(duì)脅迫刺激，抵抗逆境條件下的不良反應(yīng)。

2.7 甜櫻桃PavCML基因家族的共線性分析

通過將擬南芥與甜櫻桃的CML基因進(jìn)行共線性分析發(fā)現(xiàn)擬南芥的1號(hào)和5號(hào)染色體與甜櫻桃5號(hào)染色體上的基因，擬南芥3號(hào)染色體與甜櫻桃1號(hào)和8號(hào)染色體有較多共線，則表示有很好的共線性（圖6）。

2.8 甜櫻桃PavCML基因家族表達(dá)模式分析

通過與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，選擇對(duì)照、噴自來水裂果和不裂果部位、噴鈣離子溶液的裂果和不裂果部位樣品，對(duì)CML基因進(jìn)行熒光定量PCR（圖7），結(jié)果表明CML基因在裂果果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量高于不裂果果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量，且在施加鈣離子的裂果中的相對(duì)表達(dá)量高于噴自來水的裂果相對(duì)表達(dá)量，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的調(diào)控趨勢(shì)一致，則可表明CML家族的基因很可能參與甜櫻桃生長(zhǎng)發(fā)育過程中裂果，調(diào)控裂果發(fā)生的某些相關(guān)途徑。

3 小結(jié)與討論

類鈣調(diào)蛋白家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面起著至關(guān)重要的作用，本研究通過將擬南芥CML基因作為參考基因來獲得甜櫻桃的CML基因，共鑒定到49個(gè)，他們分別分布在8條染色體和一個(gè)碎片上，這49個(gè)PavCML基因大多數(shù)是小分子偏酸性蛋白，基因間有較大差異的基因結(jié)構(gòu)，有些基因只有外顯子，有些基因內(nèi)含子數(shù)量多，可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。與擬南芥相似，甜櫻桃的PavCML基因含有2～4個(gè)EF-hand手性結(jié)構(gòu)，通過將甜櫻桃與擬南芥的CML基因家族一起進(jìn)行進(jìn)化樹分析，劃分了為7個(gè)亞族（如圖1），表明甜櫻桃PavCML家族蛋白成員眾多，在植物基因間有相似的進(jìn)化，功能具有多樣性［24］ 。在預(yù)測(cè)CML家族順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該家族成員蛋白具有生長(zhǎng)素、赤霉素、光響應(yīng)元件等大量激素響應(yīng)元件，可知CML基因通過調(diào)控激素在植物抗逆中起到了極為重要的作用。除此之外，還鑒定到一些低氧、低溫和受傷反應(yīng)元件，表明其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)［25］。

為了探索鈣離子與CML基因家族對(duì)甜櫻桃生長(zhǎng)的影響，本實(shí)驗(yàn)基于本課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)在鈣離子處理后，部分CML家族基因相對(duì)于對(duì)照CK的表達(dá)顯著上升（圖9），可推測(cè)鈣離子對(duì)甜櫻桃果實(shí)的發(fā)育有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，在鈣處理后的裂果部位的相對(duì)表達(dá)量要比任何組高，推測(cè)甜櫻桃PavCML基因家族可能響應(yīng)裂果，參與裂果產(chǎn)生的機(jī)制，但具體作用機(jī)理和方式有待進(jìn)一步研究。本研究初步闡明了甜櫻桃PavCML基因的基本生物信息學(xué)特點(diǎn)，驗(yàn)證了CML基因參與甜櫻桃裂果，為進(jìn)一步研究該家族成員的生物學(xué)功能提供了數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。

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