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        超聲輔助酶法優(yōu)化提取核桃分心木多酚及其抗氧化活性研究

        2024-08-04 00:00:00白玉英解靜張麗田洋李世俊
        關鍵詞:纖維素酶響應面多酚

        摘要: 【目的】優(yōu)化核桃分心木多酚提取工藝,并研究其抗氧化活性。【方法】以云南漾濞核桃分心木為原料,利用單因素試驗探究纖維素酶添加量、料液比、超聲功率、超聲時間和乙醇體積分數(shù)對核桃分心木多酚提取率的影響,采用響應面法對多酚提取工藝進行優(yōu)化;通過D101 大孔樹脂對粗提物進行初步純化得到核桃分心木多酚,并分析其純度;利用DPPH·自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及鐵還原能力評價其抗氧化活性。【結果】超聲輔助纖維素酶法提取核桃分心木多酚的最佳工藝為:酶添加量0.6%、料液比1∶80(g∶mL)、超聲功率600 W、超聲時間60 min、乙醇體積分數(shù)60%,多酚提取率為7.26%,初步純化得到的多酚純度為89%。核桃分心木多酚對DPPH·自由基和ABTS+自由基清除率的 IC50 值分別為11.11 和183.12 μg/mL,鐵離子還原能力達到同等質量濃度抗壞血酸的59.62%,表明核桃分心木多酚具有較強的抗氧化活性?!窘Y論】得到核桃分心木多酚的最佳提取工藝,為核桃產業(yè)的發(fā)展和核桃分心木有效成分的開發(fā)利用提供了試驗依據。

        關鍵詞: 核桃分心木;多酚;超聲波;纖維素酶;響應面;抗氧化活性

        中圖分類號: S664.101 文獻標志碼: A 文章編號: 1004–390X (2024) 03?0107?09

        核桃分心木是核桃果核內的木質隔膜,主要由不易消化的纖維素和木質素組成[1],是核桃副產品之一,在加工過程中常被丟棄[2]。分心木是一種傳統(tǒng)中藥材,長期以來被用于治療失眠、腹瀉、腎虛、生殖系統(tǒng)疾病等[3-4],也被用作民間文化中涼茶和膳食補充劑[5]。核桃分心木富含多種生物活性成分,包括黃酮、酚酸、多糖等[6-7],且在體外具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫、預防心臟病、降血糖等功效[8-9];其資源豐富,但主要被用于工業(yè),如制作燃料或與核桃殼燒制成活性炭,利用率和附加值低,造成資源的浪費[10-11]。

        核桃分心木富含的植物多酚是一類多羥基酚類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、預防心血管疾病等多種功效[12],廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領域[13]。目前,植物多酚新型綠色提取方法主要包括酶解、微波輔助、超聲輔助等[14],這些方法具有時間短、能耗低、效率高等優(yōu)點[15]。其中,超聲波法和纖維素酶法聯(lián)合用于提取植物多酚已被廣泛研究。在提取條件優(yōu)化方面,國內外學者通過試驗設計、統(tǒng)計分析等方法,對超聲輔助酶技術的參數(shù)(如溫度、時間、功率等) 進行了深入研究。超聲輔助酶技術可有效改善植物多酚的提取效果,提高其抗氧化、抗菌、抗炎等活性,黃敏等[16]采用超聲波輔助纖維素酶法提取香蕉皮多酚,發(fā)現(xiàn)與單一條件提取相比,酶法聯(lián)合超聲波法可明顯提高多酚得率。但有關超聲波協(xié)同纖維素酶法提取核桃分心木多酚(walnut diaphragmpolyphenol,WDP) 的研究鮮有報道。本研究采用超聲—纖維素酶醇提法提取WDP,以多酚提取率為評價指標,通過單因素和響應面設計試驗優(yōu)化提取工藝,并對WDP 的抗氧化活性進行測定,以期為WDP 的開發(fā)利用提供技術支撐和理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 材料與試劑

        核桃分心木(云南漾濞彝嶺山貨有限責任公司);食品級纖維素酶(1×104 U/g,南寧龐博生物工有限公司);沒食子酸標準品(美國Sigma-Aldrich公司);福林酚(Folin-Ciocalteus) 顯色試劑(北京鼎國昌盛生物科技有限公司);抗壞血酸(優(yōu)級,美國Sigma-Aldrich 公司)。

        1.1.2 儀器與設備

        電子天平FA100 (上海舜宇恒平科學儀器有限公司);低速離心機LC-401 (安徽中科中佳科儀器有限公司);春霖超聲波清洗機CR-100 (深圳市春霖清洗設備有限公司);AL204-1C 752 型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 WDP 的提取

        干燥好的核桃分心木經多用途粉碎機粉碎,過60 目篩后(含水量≤5%) 保存?zhèn)溆?。稱取定量核桃分心木干粉, 經超聲輔助纖維素酶醇提一定時間后,90 ℃ 高溫滅酶活5 min,冷卻后4 000 r/min 離心20 min,取上清液冷藏待用。

        1.2.2 沒食子酸標準曲線的建立

        參考《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》(GB/T 8313—2018)[17]配制沒食子酸標準品樣液,于波長760 nm 處測定吸光度(用蒸餾水調零),以吸光度值為縱坐標、沒食子酸質量濃度為橫坐標繪制標準曲線,得到線性回歸方程Y=0.012 1x+0.064 9,R2= 0.999 2。

        1.2.3 多酚提取率的測定

        按照1.2.2 節(jié)的方法測定提取液的質量濃度,并按照公式計算WDP 的提取率(Y):

        Y =(C ×V×N/m×1000)×100%。

        式中:C 為被測液體質量濃度,mg/mL;V 為試樣溶液體積,mL;N 為總稀釋倍數(shù);m 為核桃分心木質量,g。

        1.2.4 單因素試驗設計

        根據實驗室前期試驗,選擇超聲溫度45 ℃且不對其展開探究,分別考察不同纖維素酶添加量 (0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、乙醇體積分數(shù) (40%、50%、60%、70%、80%)、料液比[1∶20、 1∶40、 1∶60、 1∶80、 1∶100 (g∶mL)]、超聲功率(120、240、360、480、600 W) 和超聲時間(25、35、45、55、65 min) 對WDP 提取率的影響,根據結果篩選WDP 最適提取條件范圍。

        1.2.5 響應面試驗設計

        在單因素試驗基礎上選取對WDP 提取率影響較大的酶添加量(A)、料液比(B)、超聲功率(C)、超聲時間(D) 4 個因素為自變量,WDP 提取率(Y) 為響應值,利用Design-Expert V8.0.6 軟件進行 Box-Behnken 設計試驗,進行4 因素3 水平響應面分析(表1)。

        1.2.6 多酚粗提物純化

        按照優(yōu)化所得的提取條件制備提取液并將其真空濃縮、冷凍干燥為粗提物備用。將預處理過的D101 大孔樹脂與2 mg/mL 粗提物溶液按料液比1∶10 (g∶mL) 置于2.0 L 錐形瓶中,置于恒溫搖床(25 ℃,120 r/min) 上靜態(tài)吸附6 h;待充分吸附后,將其置于玻璃層析柱中,先用蒸餾水洗滌樹脂中未被吸附的雜質,再用30% 乙醇溶液作為洗脫劑,對大孔樹脂進行洗脫并收集洗脫液。洗脫液經真空濃縮、冷凍干燥后得到WDP粉末,用于后續(xù)試驗。

        1.2.7 WDP 抗氧化活性的測定

        (1) DPPH·自由基清除率的測定

        參考蔣金龍等[18]和邵哲等[19]的方法,精確稱取3.100 mg DPPH 置于褐色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成0.079 mmol/L DPPH工作液。取DPPH 工作液2.0 mL 置于5 mL 離心管中,取不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL) 待測樣品0.5 mL 與工作液混合,暗處放置10 min,于517 nm 處測定試驗組的吸光度。對照組中用等量甲醇代替DPPH 工作液,以DPPH 工作液為空白對照,以抗壞血酸為陽性對照。按照公式計算清除率:

        清除率=[1-("A1 - A/A0)]×100%。

        式中:A1 為試驗組的吸光度;A 為對照組的吸光度;A0 為空白對照的吸光度。

        (2) ABTS+自由基清除率的測定

        參考胡霞等[20]的方法并略作改進。在5 mL離心管中加入ABTS+工作液3.8 mL,取100 μL 不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL) 的WDP 樣液混合,暗反應10 min,于517 nm 處測定試驗組的吸光度。以等體積乙醇溶液代替ABTS+工作液為對照組,以ABTS+工作液為空白對照,以抗壞血酸為陽性對照。按照公式計算清除率,計算公式同1.2.7 節(jié)(1)。

        (3) 還原鐵抗氧化能力的測定

        參考文獻[21-23] 的方法并略作改進。配制2,4,6-三吡啶基-S-三嗪(TPTZ) 工作液和硫酸亞鐵(FeSO4) 標準液,取標準液0.1 mL 于10 mL 離心管中,加入TPTZ 工作液3.0 mL,混勻,37 ℃水浴4 min,于593 nm 處測定吸光度,用乙酸溶液(300 mmol/L,pH3.6) 調零。以FeSO4 濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制FeSO4 標準曲線,得到線性回歸方程Y=0.000 4x+0.003 1 (R2=0.997 2)。將FeSO4 溶液替換為不同質量濃度(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 g/mL) 的WDP 溶液測定其鐵還原能力,利用標準曲線計算其抗氧化能力,得到的鐵離子還原能力以Fe2+的摩爾數(shù)表示。以抗壞血酸為陽性對照。

        1.3 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

        試驗均平行重復3 次, 利用SPSS 26.0 和Design-Expert V8.0.6 軟件對試驗數(shù)據進行方差分析,并利用Prism 8.0.2 進行整理和繪圖。

        2 結果與分析

        2.1 單因素試驗

        2.1.1 酶添加量

        由圖1 可知:隨著纖維素酶添加量的增加,WDP 提取率呈先升高后降低的變化趨勢。當酶添加量為0.6% 時,WDP 提取率達到峰值;當酶添加量超過0.6% 時,提取率下降。這是因為添加過多酶不利于WDP 充分溶解,導致提取率降低。因此,以0.6% 為纖維素酶的最適添加量。

        2.1.2 料液比

        由圖2 可知:在料液比(g∶mL) 為1∶20~1∶80 的變化過程中,WDP 提取率隨之升高;當料液比為1∶80 時,提取率達到峰值;之后,提取率隨著料液比的升高而下降。這是由于過量提取液會影響細胞壁中多酚的溶出。因此,選擇1∶80 (g∶mL) 為最適料液比。

        2.1.3 乙醇體積分數(shù)

        由圖3 可知:隨著乙醇體積分數(shù)由30% 升高至70%,WDP 提取率呈先上升后下降的趨勢;當乙醇體積分數(shù)為60% 時,提取率達到峰值,繼續(xù)提高乙醇體積分數(shù),提取率逐漸下降。其原因是乙醇體積分數(shù)增加導致脂溶性雜質增多,從而抑制多酚溶出,導致提取率降低。因此,60% 為最適乙醇體積分數(shù)。

        2.1.4 超聲功率

        由圖4 可知:隨著超聲功率由120 W 升至600 W,多酚提取率呈先上升后下降的趨勢。這是因為超聲功率提升,使得超聲波的穿透性增強,導致細胞壁破裂增加,進而溶劑更容易滲透到樣品中,從而提升多酚溶解率。當超聲功率達到480 W 時,提取率達到峰值;當超聲功率超過480 W 時,提取率呈下降趨勢。這是由于過大功率導致提取體系溫度升高,使多酚發(fā)生氧化分解反應,提取率下降。因此,480 W 為最適提取超聲功率。

        2.1.5 超聲時間

        由圖5 可知:隨著超聲處理時間由25 min 升至65 min,多酚提取率呈先上升后下降的趨勢,在55 min 時達到峰值,進一步增加超聲時間后提取率下降。這是由于長時間機械波作用下多酚特殊基團受到破壞,從而導致多酚提取率降低。因此,55 min 為最適超聲時間。

        2.2 響應面試驗優(yōu)化

        2.2.1 響應面試驗設計及結果

        在單因素試驗基礎上,對WDP 提取工藝條件進行優(yōu)化,響應面試驗設計及結果見表2。采用二次多元回歸擬合方法獲得WDP 提取率(Y)的回歸方程:Y=7.03+0.45A+0.37B+0.21C+0.73D?0.06AB?0.17AC?0.04AD?0.38BC?0.17BD+0.12CD?0.65A2?0.74B2?0.37C2?0.70D2。

        由表3 可知:所選模型具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01),模擬的F gt;1,Pgt;0.05,回歸模型的失擬項不顯著,R2 為0.955 2,說明該回歸模型與實際試驗的擬合程度較為接近,可用于預測WDP 的提取率。通過P 值和F 值的比較,得出影響WDP提取率的因素順序為:超聲時間(D)gt;酶添加量(A)gt;料液比(B)gt;超聲功率(C)。這表明在試驗設計的4 個主要因素中,超聲時間和酶添加量對提取率的影響最顯著,液料比和超聲功率對提取率也有一定影響。

        2.2.2 響應面分析

        各因素之間的交互作用對WDP 提取率影響的響應面結果(圖6) 顯示: 6 個響應面均為開口向下的凸形曲面,表明存在極大值點,且響應面曲線較為陡峭,說明各因素的變化對WDP 提取率均有影響,影響程度為BCgt;ACgt;BDgt;CDgt;ABgt;AD,表明料液比(B) 與超聲功率(C) 的交互作用對WDP 提取率的影響最顯著。

        2.2.3 驗證性試驗

        Design-Expert V8.0.6 預測WDP 最佳提取工藝為:酶添加量0.66%、料液比1∶82.34 (g∶mL)、超聲功率509.19 W、超聲時間60.13 min,WDP提取率為7.33%。結合實際情況將工藝參數(shù)調整為:酶添加量0.60%、料液比1∶80 (g∶mL)、超聲功率600 W、超聲時間60 min。在此條件下進行驗證試驗,所得WDP 提取率為7.26%,與預測值接近,相對誤差(0.96%) 較小。說明該回歸模型優(yōu)化的工藝條件可用于提取WDP。

        2.3 WDP 的抗氧化活性

        2.3.1 清除DPPH·自由基的能力

        隨著樣品質量濃度的增大,WDP 對DPPH·自由基的清除率呈先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢,IC50 為11.11 μg/mL (圖7)。當WDP 質量濃度達0.6 mg/mL 時,對DPPH·自由基的清除作用與抗壞血酸相近,說明WDP 有較強的DPPH·自由基清除能力。

        2.3.2 清除ABTS+自由基的能力

        隨著樣品質量濃度的增加,WDP 對ABTS+自由基的清除率呈先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢,IC50值為183.12 μg/mL (圖8)。當WDP 質量濃度達0.6 mg/mL 時,對ABTS+自由基的清除能力基本與抗壞血酸持平,說明WDP 有較強的ABTS+自由基清除能力。

        2.3.3 還原鐵抗氧化能力

        由圖9 可知:隨著質量濃度的增加,WDP對Fe3+的還原能力也隨之增加;不同質量濃度的WDP 和抗壞血酸都可在一定程度上還原Fe3+,但WDP 的還原能力均小于抗壞血酸 (圖9)。

        3 討論

        作為核桃加工過程中的副產物,核桃分心木的潛在價值并未被忽視。近年來,中醫(yī)治療領域對其給予了越來越多關注,原因在于其富含多種活性成分[23-25],這些成分主要是多酚類物質,具有顯著的抗氧化性能。若能有效地提取并利用這些化合物,不僅可以進一步開發(fā)該資源,還能將其轉化為天然抗氧化劑的來源,為保障人類健康提供新途徑[26]。

        相較于傳統(tǒng)植物多酚的提取工藝而言,超聲輔助酶法不僅安全、環(huán)保、高效,而且可以保護活性成分,是一種比較理想的天然產物活性成分提取方法[27-30]。本研究采用超聲波輔助纖維素酶提取WDP,效率高、過程環(huán)保,具有很高的應用價值。以多酚提取率為指標,在單因素試驗基礎上,利用響應面分析優(yōu)化提取工藝,得到最佳工藝參數(shù)為:乙醇體積分數(shù)60%、超聲功率600 W、超聲時間60 min、酶添加量0.6%、料液比1∶80 (g∶mL),在此參數(shù)條件下,WDP 提取率為7.26%。劉靜等[7]采用超聲輔助乙醇提取WDP,利用Box-Behnken 響應曲面設計優(yōu)化提取工藝,提取率為6.98%??梢?,與單一提取方法相比,超聲波輔助酶法可提高多酚提取率。

        目前,市面上常用的抗氧化劑多為人工合成,在使用中存在安全隱患,也越來越受到限制,因此,研究開發(fā)植物中的天然抗氧化劑日益受到重視[31-32]。多酚是植物中的化合物,是天然抗氧化劑。目前常用的抗氧化活性評價指標有DPPH·自由基、ABTS+自由基和總還原能力等[33],因此,本研究采用以上3 種指標評價WDP 的抗氧化活性。研究結果表明:WDP 對DPPH·自由基和ABTS+自由基具有較強的清除能力,且有一定質量濃度依賴性;在同一質量濃度處理下,WDP對鐵離子的還原能力為陽性對照的59.62%,表明WDP 具有較強的抗氧化性,可將其開發(fā)成為天然抗氧化劑。但本研究僅對超聲輔助纖維素酶法提取WDP 的抗氧化活性進行了測定,該技術是否會影響WDP 的生物活性尚不清楚,在后續(xù)研究中,可對不同提取方法與生物活性間的關系進行研究。

        4 結論

        超聲輔助纖維素酶法提取核桃分心木多酚的最佳提取工藝為:超聲功率600 W、超聲時間60 min、酶添加量0.6%、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶80 (g∶mL),該條件下WDP 提取率為7.26%。此外,WDP 清除DPPH·自由基、ABTS+自由基以及還原鐵離子的能力較強,有望作為潛在的天然抗氧化劑。本研究結果為開發(fā)天然的抗氧化劑和云南核桃分心木多酚的深入研究奠定了基礎,并為從農產品副產物中提取生物活性成分提供了實踐參考。

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        責任編輯:何承剛

        基金項目:云南省科技廳重大科技專項計劃項目(202002AA100005,202102AE090027-2);云南省科技廳云南綠色食品國際合作研究中心項目(2019ZG00905)。

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