劉波　張曉明　郭巧生　等

摘要：百蕊草根系富含多糖、多酚和其他次生代謝產(chǎn)物，用傳統(tǒng)方法提取總RNA難以有效將這些雜質(zhì)去除。以百蕊草根系為材料，比較TRIzol法、CTAB-LiCl法、SDS/酚法及改進(jìn)TRIzol法4種方法對百蕊草根系總RNA的提取效果，并以電泳檢測、D260 nm/D280 nm比值測定、RT-PCR試驗等對結(jié)果進(jìn)行分析評價。結(jié)果表明，4種方法均能提取百蕊草根中總RNA，提取效果差異顯著；改進(jìn)TRIzol法提取總RNA的28S和18S條帶清晰，無彌散，28S亮度比18S加倍，完整性好，無明顯DNA或其他雜質(zhì)污染，D260 nm/D280 nm值為1.8～2.0，D260 nm/D230 nm值大于2.0，總RNA得率僅次于TRIzol法；用改進(jìn)TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA片段大小分布在0.2～2.5 kb，可擴(kuò)增出目的基因片段，提取的總RNA完全適用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：百蕊草；總RNA提?。欢嗵?；多酚；TRIzol法；RT-PCR

中圖分類號： Q522文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0044-03

收稿日期：2014-03-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81202867）。

作者簡介：劉波（1989—），男，浙江衢州人，碩士，主要從事藥用植物栽培生理研究。E-mail：2011104175@njau.edu.cn。

通信作者：郭巧生，博士，教授，主要從事藥用植物資源開發(fā)。E-mail：gqs@njau.edu.cn。百蕊草（Thesium chinense Turcz.）為檀香科百蕊草屬半寄生植物，全草入藥，具有清熱解毒、止咳化痰等功效[1]，被稱為植物抗生素[2]，具有重要的藥用價值。百蕊草根系可形成寄生根侵入寄主植物[3-4]，通過寄生根從寄主植物獲得水分和養(yǎng)分。目前，對百蕊草的研究主要集中在藥理成分、提取工藝、組織培養(yǎng)等方面[2，5-9]，在分子水平上的研究較少，至今未見有關(guān)百蕊草根系總RNA提取方面的報道。

植物組織RNA的提取是開展后續(xù)植物分子生物學(xué)研究的必要前提。進(jìn)行RT-PCR、cDNA合成、Northern印跡雜交、SSH篩選差異基因等分子生物學(xué)相關(guān)研究，均需要完整性好、純度高的RNA。因此，如何提高RNA純度和經(jīng)濟(jì)快捷獲得足夠量的RNA是當(dāng)前研究人員十分關(guān)注的問題。百蕊草根系化學(xué)成分復(fù)雜，富含多糖及酚類物質(zhì)[10]。酚類化合物容易氧化產(chǎn)生褐化效應(yīng)[11]，在RNA提取過程中與RNA不可逆結(jié)合，導(dǎo)致RNA降解或RNA活性喪失[12]；多糖能與RNA共沉淀形成難溶的膠狀物，抑制許多酶的活性[13]。為此，本試驗開展TRIzol法、CTAB-LiCl法、SDS/酚法[14-16]、優(yōu)化改進(jìn)TRIzol法提取百蕊草根系總RNA研究，以期篩選出一種理想的百蕊草根系RNA提取方法，為今后利用分子生物學(xué)研究百蕊草寄生機(jī)理提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

野生百蕊草采集于南京市附近，選挖長勢良好的植株，清洗根系，立即投入液氮中冷凍保存，備用。原植物經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)郭巧生教授鑒定為檀香科植物百蕊草。

1.2總RNA提取方法

1.2.1TRIzol法取0.1 g植物組織，在液氮中研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中；加入1 mL預(yù)冷的TRIzol，渦旋混勻，室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，振蕩1 min，室溫放置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相至新離心管中，加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，振蕩混勻，室溫放置 10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇，振蕩，使沉淀浮起，懸浮1 min，4 ℃、7 500 r/min離心5 min；棄置上清，空氣中干燥5 min，加入50 μL ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.2.2CTAB-LiCl法將2×CTAB 提取液于65 ℃水浴鍋中預(yù)熱；取0.2 g樣品于液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加700 μL提取液和20 μL β-巰基乙醇，劇烈振蕩混勻；65 ℃水浴10 min，其間振蕩數(shù)次，冷卻到室溫后加等體積比例為25 ∶24 ∶1的苯酚、氯仿、異戊醇混合液，充分振蕩，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清至2 mL新離心管中，重復(fù)上述步驟，再抽提1次；取上清于1.5 mL離心管中，加入1/4體積的10 mol/L LiCl溶液，4 ℃過夜，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min；棄上清，沉淀用500 μL ddH2O溶解，加等體積比例為24 ∶1的氯仿、異戊醇溶液再抽提1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；上清液中加入1/10體積、pH值為52、濃度3 mol/L的乙酸鈉和等體積預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃ 沉淀3 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，用75%乙醇清洗沉淀，室溫干燥，ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.2.3SDS/酚法取0.2 g樣品于液氮中研磨成粉末，加入80 ℃預(yù)熱的提取緩沖液850 μL；加入PVP和β-巰基乙醇，充分混勻，冰浴15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；上清液中加入1/3體積、pH值為4.8、濃度為5 mol/L的乙酸鉀，冰浴15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；上清液中加入等體積、比例為24 ∶1的氯仿、異戊醇溶液，充分混勻，冰浴 10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；上清液中加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃放置3 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清液，用600 μL重懸緩沖液重懸沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；75%乙醇清洗沉淀，室溫干燥，ddH2O溶解，-70 ℃ 保存。

1.2.4改進(jìn)TRIzol法在TRIzol法基礎(chǔ)上，在加入TRIzol試劑的同時，加入20 μL β-巰基乙醇，用異丙醇沉淀后，加入500 μL ddH2O溶解沉淀，加入1/4體積的10 mol/L LiCl溶液，-20 ℃下靜置6 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；棄上清，沉淀用500 μL ddH2O溶解，加等體積比例為24 ∶1的氯仿、異戊醇溶液再抽提1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清，加1/10體積pH值為5.2、濃度為3 mol/L的乙酸鈉和等體積預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃沉淀3 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，用75%乙醇清洗沉淀，室溫干燥，ddH2O溶解，-70 ℃保存。

1.3總RNA質(zhì)量檢測

1.3.1總RNA完整性檢測分別取由4種總RNA提取方法獲得的百蕊草根系總RNA，在1.2%非變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測，3次重復(fù)。

1.3.2總RNA純度及得率檢測用紫外分光光度計測定所提取RNA樣品的D230 nm、D260 nm、D280 nm值，計算D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，評價總RNA純度；同時，測定總RNA濃度并計算得率。

1.4改進(jìn)TRIzol法提取總RNA完整性的RT-PCR檢驗

cDNA第1鏈的合成參照Thermo Scientific公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit操作說明書進(jìn)行。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， 1 μLTcActin正向引物：5′-ACCACTGCTGAGCGGGAAA-3′， 1 μL反向引物：5′-CTGCAATGCCAGGGAACA-3′，15.3 μL 滅菌ddH2O， 2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2 ，2 μL 2.5 mmol/L dNTP ，0.2 μL Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完畢后取5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法對總RNA完整性的影響

由圖1可見，4種方法提取的總RNA完整性和基因組DNA殘留程度有較大差異；TRIzol法提取的RNA電泳條帶清晰，可見28S、18S、5S條帶，且28S的亮度較18S高，RNA完整性較好，但靠近電泳點樣孔附近有亮斑，可能存在蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)殘留；CTAB-LiCl法提取的RNA電泳呈彌散分布，28S和18S處略微可見且亮度較高，但條帶不夠清晰，這說明此方法提取的RNA已經(jīng)有所降解，提取的RNA中可能存在基因組DNA；SDS/酚法提取的RNA電泳彌散最為嚴(yán)重，存在基因組DNA殘留；改進(jìn)的TRIzol法提取的RNA電泳可見清晰的28S和18S條帶，且28S比18S亮度加倍，且完整性好，提取的RNA樣品中無明顯基因組DNA殘留。

2.2不同提取方法的總RNA純度和得率

D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm是對提取的核酸純度和產(chǎn)率進(jìn)行定量分析的通用方法，高純度的RNA溶液D260 nm/D280 nm應(yīng)介于1.8～2.0之間，D260 nm/D230 nm應(yīng)大于2.0。由表

1可見，TRIzol法提取的RNA溶液D260 nm/D280 nm僅為1.582，可能存在蛋白質(zhì)和酚等有機(jī)物殘留，純度過低；CTAB-LiCl法、SDS/酚法、改進(jìn)TRIzol法D260 nm/D280 nm分別為2.081、2223、1.943，均有效去除了蛋白質(zhì)和酚等物質(zhì)；CTAB-LiCl法和改進(jìn)TRIzol法D260 nm/D230 nm均大于2.0，即對酚類和糖類等有機(jī)物質(zhì)可以有效去除；4種方法中，RNA提取產(chǎn)率最高的為TRIzol法，而CTAB-LiCl法、SDS/酚法、改進(jìn)TRIzol法提取RNA的產(chǎn)率與TRIzol法相比，依次約能達(dá)到TRIzol法的70.3%、43.6%、73.1%。

表1不同方法提取百蕊草根系總RNA純度及得率

提取方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nm得率

（μg/g）TRIzol法1.582±0.0481.082±0.070189.073±3.963CTAB-LiCl法2.081±0.0592.332±0.015132.983±2.455SDS/酚法2.223±0.0261.793±0.00782.367±9.166改進(jìn)TRIzol法1.943±0.0492.074±0.033138.168±5.498

2.3改進(jìn)TRIzol法提取總RNA的完整性驗證

以改進(jìn)TRIzol法提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可看出反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段呈彌散分布，大小主要集中分布在0.2～2.5 kb（圖2）。該結(jié)果基本吻合植物RNA長度的一般范圍，反映該cDNA的模板mRNA比較完整，提取的RNA質(zhì)量較高，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗要求。

對百蕊草TcActin基因保守區(qū)序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以進(jìn)一步驗證改進(jìn)方法提取RNA的完整性。由圖3可見，百蕊草TcActin基因保守區(qū)序列能得到片段長度約為330 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序長度為333 bp，擴(kuò)增片段長度與預(yù)計的檀香科Actin基因保守區(qū)序列長度一致，這說明改進(jìn)的TRIzol方法提取總RNA保持了表達(dá)基因的完整性。

3討論

純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行分子克隆及基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)[17]。近年來，關(guān)于植物RNA提取方法的報道逐漸增多[18-20]。由于多數(shù)植物材料成分復(fù)雜，特別是糖類和酚類等有機(jī)物質(zhì)對RNA提取的干擾很大[21-22]。酚類物質(zhì)容易氧化形成褐化效應(yīng)，與RNA不可逆結(jié)合，嚴(yán)重降低了RNA的質(zhì)量和產(chǎn)率；含有多糖的RNA沉淀難溶于水，即使通過加熱等方式溶解，溶液也呈黏稠狀。目前，去除多糖的方法主要有高濃度NaCl沉淀法、LiCl沉淀法、乙酸鉀沉淀法等。

TRIzol試劑原本用于提取動物組織RNA，因其操作步驟簡便，全程只需1～2 h，后被開發(fā)提取植物組織RNA，且對多種植物組織RNA的提取十分有效[18]。較高濃度的CTAB不僅對植物細(xì)胞具有良好的裂解作用，有效形成核蛋白與核酸的復(fù)合物，而且還能與β-巰基乙醇聯(lián)合作用使蛋白變性，抑制RNA酶的活性[23]。CTAB作為陽離子表面活性劑成分，從富含多糖、多酚材料中分離出高質(zhì)量RNA已經(jīng)在多種植物材料中得到驗證。

傳統(tǒng)TRIzol法提取的百蕊草根系總RNA沉淀呈褐色，且很難溶于水中，稍加熱溶解沉淀后有淡黃色的膜狀物質(zhì)，不能有效去除酚類和糖類物質(zhì)，但是通過凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，TRIzol法提取的總RNA完整性良好，對RNA酶的抑制能力強，可有效避免降解；CTAB-LiCl法獲得的RNA沉淀沾水即溶，結(jié)合凝膠電泳及OD值測定，該方法可有效去除蛋白質(zhì)、酚類、糖類等有機(jī)物質(zhì)，但存在基因組DNA污染，且不能有效抑制RNA酶的活性，出現(xiàn)RNA降解，這意味著提取的失敗。

結(jié)合TRIzol法能夠有效抑制RNA酶活性和CTAB-LiCl法能有效去除蛋白質(zhì)、酚類、糖類等有機(jī)物質(zhì)的特點，優(yōu)化百蕊草根系總RNA提取方法，形成改進(jìn)的TRIzol法，即在提取時加入β-巰基乙醇，該物質(zhì)不僅能打開蛋白酶的二硫鍵使酶失活，從而抑制酚類氧化酶和RNA酶的活性，也能與酚類產(chǎn)生競爭性氧化，可有效避免褐化現(xiàn)象[24]。另外，LiCl沉淀可去除部分多糖，多次的酚/氯仿抽提也基本去除了蛋白質(zhì)、酚類、糖類等有機(jī)物質(zhì)。改進(jìn)TRIzol法提取總RNA，雖然RNA的得率有所降低，但獲得的RNA質(zhì)量高，可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。

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