［摘 要］ 目的：探討D-檸檬烯對膠質母細胞瘤 （GBM） 細胞增殖和凋亡的影響，并闡明其可能的作用機制。方法：將 GBM 細胞分為對照組 （0 mmol·L－1 D-檸檬烯） 和0. 2、 0. 4、 0. 6、 0. 8 及1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組。采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖抑制率，克隆形成法檢測各組細胞克隆形成率，Annexin Ⅴ-FITC/PI 法檢測各組細胞凋亡率，Western blotting 法檢測各組細胞中蛋白激酶B（AKT）、B 細胞淋巴瘤2 （Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax） 和多聚二磷酸腺苷（ADP） 核糖聚合酶（PARP） 蛋白表達水平， 免疫熒光法檢測各組細胞中裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleavedCaspase）-3 蛋白表達水平。15 只建立皮下移植瘤模型小鼠隨機分為空白組（0 mg·kg－1·d－1 D-檸檬烯）、低劑量D-檸檬烯組（200 mg·kg－1·d－1 D-檸檬烯） 和高劑量D-檸檬烯組（400 mg·kg－1·d－1 D-檸檬烯），每組5 只。計算各組小鼠體內(nèi)腫瘤抑制率，HE 染色和免疫組織化學染色觀察各組小鼠皮下腫瘤組織形態(tài)表現(xiàn)，并繪制腫瘤生長曲線，免疫組織化學法檢測各組小鼠皮下瘤組織中Ki67 蛋白陽性表達率，TUNEL染色法檢測各組小鼠腫瘤細胞凋亡情況。結果：對照組細胞呈長梭形，狀態(tài)良好，緊密且貼壁生長，細胞器和細胞質正常；給藥48 h 后，0. 6 mmol·L－1 D-檸檬烯組細胞體積減小，細胞膜雖完整但通透性增強，細胞質皺縮，細胞內(nèi)部產(chǎn)生空泡結構，部分呈碎片狀漂浮在溶液表面；0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組細胞中有明顯凋亡小體生成，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。CCK-8 法，與對照組比較，0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組U87、LN229 及GL261 細胞增殖抑制率均明顯升高（Plt;0. 01），0. 4 mmol·L－1 D-檸檬烯組U87 和GL261 細胞增殖抑制率均明顯升高（Plt;0. 01）。克隆形成法，與對照組比較，0. 4、0. 6 和0. 8 mmol·L－1 D-檸檬烯組U87、LN229 及GL261 細胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。Annexin Ⅴ-FITC/PI 法，與對照組比較，D-檸檬烯處理48 h 后，0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組LN229 細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法，與對照組比較，0. 6、0. 8和1. 0 mmo·l L－1 D-檸檬烯組LN229 細胞中Bax 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01），AKT 和Bcl-2 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 01）；0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組LN229 細胞中PARP 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。免疫熒光法，與對照組比較，0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組LN229 細胞中cleaved Caspase-3 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。與空白組比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤體積均明顯減?。≒lt;0. 01）。與空白組比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤質量均明顯降低（Plt;0. 05），腫瘤抑制率均明顯升高（Plt;0. 05）?？瞻捉M小鼠腫瘤細胞彌漫分布，細胞核染色加深，核漿比增大；低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤組織出現(xiàn)大量腫瘤細胞變性壞死。與空白組比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤組織中Ki67 蛋白陽性表達率均明顯降低（Plt;0. 01）。與空白組比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）。結論：D-檸檬烯具有抑制GBM 細胞增殖的作用， 其作用機制可能與調控AKT 蛋白的表達并激活Caspase-3 通路誘導凋亡有關。

［關鍵詞］ D-檸檬烯； 膠質母細胞瘤； 細胞凋亡； 移植瘤； 蛋白激酶B

［中圖分類號］ R739. 4 ［文獻標志碼］ A

膠質母細胞瘤（glioblastoma， GBM） 是一種常見的腦內(nèi)原發(fā)性腫瘤， 是腦腫瘤分類的最高等級，具有惡性程度高、侵襲性強、增殖速度快、治療耐藥、預后差和易復發(fā)等特點［1］。目前臨床主要治療方式為手術切除，并輔助放療和化療，但治療效果較差，且患者不良反應明顯，患者術后3 年生存率不足 5%， 因此提高 GBM 患者生存時間是目前研究的熱點［2-3］。 蛋白激酶B （protein kinase B，AKT） 參與細胞的多種過程， 包括細胞凋亡和細胞增殖，AKT 蛋白的異?；罨谌祟惏┌Y中較為常見。PAGE 等［4］ 研究顯示：AKT 蛋白的異常激活使腫瘤細胞對凋亡刺激的敏感性降低，抑制該信號通路可能為癌癥治療提供參考。JIA 等［5］ 研究發(fā)現(xiàn)：D-檸檬烯具有抑制結直腸癌細胞中AKT 蛋白表達的作用，可通過抑制AKT 蛋白表達有效抑制結直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡發(fā)生。D-檸檬烯是柑橘精油中富含的一種天然單萜，具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抑菌等多種生物活性［6-7］。研究［8-11］ 顯示：D-檸檬烯具有抑制胃癌、肺癌和結腸癌細胞增殖的作用。但D-檸檬烯對GBM 細胞增殖的抑制作用目前尚未見報道。本研究以LN229、U87 和GL261細胞為研究對象，探討D-檸檬烯對GBM 細胞增殖和凋亡的影響及其對GBM 皮下移植瘤小鼠的治療作用，闡明D-檸檬烯抑制GBM 的作用機制。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、細胞、藥物、主要試劑和儀器

15只C57BL/6 小鼠（廣東藥康生物科技有限公司），5 周齡，體質量18～26 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （粵） 2022-0002， 動物實驗通過廣東省清遠市人民醫(yī)院動物倫理委員會審批，倫理審批號：LAEC-2023-029。人源 GBM 細胞 U87 （ 美國ATCC 細胞庫），LN229 細胞（中山大學動物實驗中心細胞庫）， 鼠源GBM 細胞GL261 ［潤盈生物工程（上海） 有限公司］。D-檸檬烯（美國Sigma公司）。玉米油（上海源葉試劑有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma 公司）， DMEM 高糖培養(yǎng)基、 1% 青-鏈霉素和胰蛋白酶（美國Gibco公司），胎牛血清（澳大利亞 ExCellBio 公司）， 12% 凝膠電泳蛋白預制膠（南京艾思易生物科技有限公司），BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），RIPA 裂解液（江蘇康為世紀生物科技有限公司），Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術有限公司），CCK-8 試劑盒（美國GLPBIO 公司），裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase，cleaved Caspase）-3、多聚二磷酸腺苷（adenosinediphosphate，ADP） 核糖聚合酶（poly ADP-ribosepolymerase，PARP）、AKT、B 細胞淋巴瘤2 （B-celllymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X， Bax）、β-actin 抗體和HRP 標記二抗（美國Cell Signaling 公司）， Ki67 抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），Annexin Ⅴ/PI 凋亡試劑盒（武漢Elabscience 公司）。CO2 恒溫培養(yǎng)箱（型號：CLM-170B-8-CN，新加坡ESCO 公司），倒置熒光顯微鏡（型號： Axio Observer 7， 德國Zeiss 公司），光學顯微鏡（型號：ICX41，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），電泳系統(tǒng)（型號：PowerPac HC，美國Bio-Rad公司），酶標儀（型號：601-0356，德國SPECTOR Star 公司）。

1. 2 細胞培養(yǎng)和分組

U87、LN229和 GL261細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及1% 青- 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中。待細胞融合度達到80% 時，采用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液備用。D- 檸檬烯溶解于DMSO 中，初始濃度為1 028 mmol·L－1。細胞實驗分為對照組（0 mmol·L－1 D-檸檬烯） 和不同濃度（0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1）D-檸檬烯組。

1. 3 光學顯微鏡觀察各組 LN229 細胞形態(tài)表現(xiàn)

取對數(shù)生長期 LN229 細胞，按照每孔 1×105 個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h 后，加入含0、0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯的無血清培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，采用光學顯微鏡觀察各組LN229 細胞形態(tài)表現(xiàn)。

1. 4 CCK-8 法檢測各組細胞增殖抑制率

采用CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率，并篩選出后續(xù)實驗的給藥濃度。將對數(shù)生長期的GBM 細胞消化重懸， 以每孔8×103 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板。于37 ℃ 、5% CO2 和飽和濕度條件下培養(yǎng)， 待細胞貼壁后， 加入含不同濃度D-檸檬烯的完全培養(yǎng)基， D-檸檬烯最終濃度為0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1， 每個濃度設3 個復孔。培養(yǎng)48 h 后，每孔更換為含10 μL CCK-8 染液的完全培養(yǎng)基， 孵箱培養(yǎng)2 h 后， 采用酶標儀于波長450 nm 處檢測各孔吸光度（A） 值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率= ［1－ （加藥組A 值－ 空白組A 值） / （未加藥組A 值－ 空白組A 值）］ ×100%。

1. 5 克隆形成法檢測各組細胞克隆形成率

取對數(shù)生長期的U87、LN229 和GL261 細胞， 以每孔500 個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后， 分別加入0、0. 4、0. 6 和0. 8 mmol·L－1D-檸檬烯處理48 h。繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，并每隔3 d 更換完全培養(yǎng)基。將細胞用4% 多聚甲醛固定，采用0. 5% 結晶紫染液染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 沖洗多余和結合不牢固的結晶紫染液，待自然晾干后，顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)細胞克隆形成數(shù)，計算各組細胞克隆形成率。克隆形成率=克隆形成數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1. 6 Annexin Ⅴ-FITC/PI 法檢測各組細胞凋亡率

取對數(shù)生長期LN229 細胞，按照每孔2×104個細胞的密度接種于8 孔腔室蓋玻片中， 每孔添加200 μL 完全培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，分別用終濃度為0、0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 的D-檸檬烯處理48 h。每孔加入2 μL 的Annexin Ⅴ 和2 μL 的PI 染液，室溫避光孵育15 min。采用熒光顯微鏡分別于FITC 和PI 通道拍攝圖片， Image J 軟件計數(shù)凋亡細胞， 采用Graphad prism 8. 0. 2 軟件計算各組細胞凋亡率。細胞凋亡率= （早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)） /細胞總數(shù)×100%。

1. 7 Western blotting 法檢測各組細胞中 AKT、Bcl-2、Bax和 PARP蛋白表達水平

取對數(shù)生長期的LN229 細胞，按每孔2×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長至70%～80% 密度時，分別采用終濃度為0、0. 6、0. 8和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯處理48 h。收集細胞至1. 5 mL 離心管中， 離心棄上清，加入120 μL 的RIPA 裂解液裂解細胞，并提取細胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量， 加入Loading Buffer， 95 ℃金屬浴使蛋白變性。每孔上樣量為80 μg 蛋白，進行SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ployacrylamide gelelectrophoresis， PAGE）， 將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF） 膜。5% 脫脂奶粉封閉， 加入一抗（1∶ 1 000） 4 ℃搖床孵育過夜，TBST 溶液洗滌3 次，每次5 min，加入相應的二抗（1∶2 000） 室溫搖床孵育1. 5 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 8 免疫熒光法檢測各組細胞中cleaved Caspase-3蛋白表達水平

取對數(shù)生長期 LN229細胞，按照每孔2×104 個細胞的密度接種于8 孔腔室蓋玻片中，每孔添加200 μL 完全培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，分別用終濃度為0、0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 的D- 檸檬烯處理48 h。 4% 多聚甲醛固定細胞，cleaved Caspase-3 （1∶ 400） 抗體 4 ℃ 孵育過夜，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，加入對應熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h 后，加入DAPI 染液復染細胞核。采用熒光顯微鏡在FITC 通道下拍照，Image J 軟件計算各組細胞中cleaved Caspase-3蛋白熒光強度，采用Graphad prism 8. 0. 2 軟件計算各組細胞中cleaved Caspase-3 蛋白平均熒光強度，代表其蛋白表達水平。

1. 9 小鼠皮下移植瘤模型建立

收集 GL261 細胞，PBS 緩沖液重懸至細胞密度為1. 5×107 mL－1。15 只小鼠建立皮下移植瘤模型， 每只小鼠皮下注射200 μL 細胞懸液至小鼠左側腋下區(qū)域。1 周后將造模小鼠隨機分為空白組、低和高劑量D-檸檬烯組，每組5 只。低和高劑量D-檸檬烯組小鼠用玉米油溶解的 D-檸檬烯灌胃， D-檸檬烯濃度分別為 200 和400 mg·kg－1·d－1； 空白組小鼠僅用玉米油灌胃。 每4 d 用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤直徑（mm）。腫瘤體積（V） =1/2×a×b2，a 為小鼠腫瘤最大直徑（mm），b為小鼠腫瘤最小直徑（mm）。治療3 周后，對小鼠進行安樂死，收集腫瘤并稱質量，計算各組小鼠體內(nèi)腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（對照組小鼠腫瘤質量－治療組小鼠腫瘤質量） /對照組小鼠腫瘤質量×100%。各組小鼠腫瘤組織石蠟包埋切片，HE 染色和免疫組織化學染色觀察各組小鼠皮下腫瘤組織形態(tài)表現(xiàn)， 并繪制腫瘤生長曲線。

1. 10 免疫組織化學法檢測各組小鼠皮下瘤組織中Ki67蛋白陽性表達率

取出小鼠腫瘤，固定和脫水后，制成3 mm 石蠟切片，脫蠟，水化，使用檸檬酸鈉緩沖液進行高溫抗原修復15 min， 0. 5%Triton X-100 處理15 min， 采用3% H2O2 處理20min， 5% BSA 封閉30 min， 加入Ki67 抗體， 4 ℃孵育過夜后，PBS 緩沖液清洗后使用對應二抗室溫孵育30 min， 顯色封片， 計數(shù)Ki67 陽性細胞數(shù)。Ki67 蛋白陽性表達率=Ki67 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1. 11 TUNEL染色法檢測各組小鼠皮下腫瘤細胞凋亡情況

將腫瘤制成3 mm的石蠟切片，于二甲苯和乙醇中進行脫蠟及脫水，PBS 緩沖液洗滌2 次，每次5 min， 于 20 mg·L－1 蛋白酶 K 溶液中孵育15 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，加入配置好的TUNEL 染色液中， 室溫避光孵育2 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，采用DAPI 孵育10 min 復染細胞核，熒光顯微鏡于FITC 通道下觀察并拍照，計數(shù)TUNEL 陽性細胞數(shù)，計算各組小鼠皮下腫瘤細胞凋亡率。皮下腫瘤細胞凋亡率=TUNEL 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1. 12 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析和繪制圖像。各組GBM 細胞增殖抑制率、克隆形成率和細胞凋亡率，細胞中Bax、Bcl-2、PARP、AKT 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平， 小鼠腫瘤體積、腫瘤質量、腫瘤抑制率和Ki67 蛋白陽性表達率均符合正態(tài)分布，以 x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Dunnett’s t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 各組LN229細胞形態(tài)表現(xiàn)

對照組細胞呈長梭形，狀態(tài)良好，緊密且貼壁生長，細胞器和細胞質正常； 給藥 48 h 后， 0. 6 mmol·L－1 D-檸檬烯組細胞體積減小，細胞膜雖完整但通透性增強，細胞質皺縮，細胞內(nèi)部產(chǎn)生空泡結構，部分呈碎片狀漂浮在溶液表面；0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D-檸檬烯組細胞中有明顯凋亡小體生成， 呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。見圖1。

2. 2 各組細胞增殖抑制率和克隆形成率

與對照組比較， 0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－ 1 D-檸檬烯組U87、LN229 及GL261 細胞增殖抑制率均明顯升高（Plt;0. 01）， 0. 4 mmol·L－1 D- 檸 檬 烯 組 U87 和GL261 細胞增殖抑制率均明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，0. 4、0. 6 和0. 8 mmol·L－1 D-檸檬烯組U87、LN229 及GL261 細胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表1、圖2 和表2。

2. 3 各 組 細 胞 凋 亡 率

與 對 照 組 （0. 02%±0. 01%） 比較，D-檸檬烯處理48 h后，0. 6 mmol·L－1D- 檸檬烯組（0. 34%±0. 02%）、0. 8 mmol·L－1D- 檸檬烯組（0. 69%±0. 12%） 和1. 0 mmol·L－1D- 檸檬烯組（0. 83%±0. 09%） LN229 細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖3。

2. 4 各組細胞凋亡相關蛋白和 AKT 蛋白表達水平

與對照組比較， 0. 6、 0. 8 和 1. 0 mmol·L－1D-檸檬烯組LN229 細胞中Bax 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01），AKT 和Bcl-2 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 01）； 0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D- 檸檬烯組LN229 細胞中PARP 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖4。與對照組（75. 33±35. 61） 比較， 0. 6、0. 8 和1. 0 mmol·L－1 D- 檸檬烯組LN229 細胞中cleaved Caspase-3 蛋白表達水平（10 993. 41±715. 07， 27 322. 37±1 902. 90 和35 354. 68 ± 17 738. 01） 均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 5 各組小鼠體內(nèi)腫瘤抑制率

與空白組比較，低和高劑量D- 檸檬烯組小鼠腫瘤體積均明顯減小（Plt;0. 01）。與低劑量D-檸檬烯組比較， 高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤體積減小， 但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）。 見圖 6 和圖 7。 與空白組比較， 低和高劑量 D-檸檬烯組小鼠腫瘤質量均明顯降低（Plt;0. 05）， 體內(nèi)腫瘤抑制率均明顯升高（Plt;0. 05）。見表3。

2. 6 各組小鼠移植瘤腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)、Ki67蛋白陽性表達率和細胞凋亡率

空白組小鼠腫瘤細胞彌漫分布，細胞核染色加深，核漿比增大；低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤組織出現(xiàn)大量腫瘤細胞變性壞死。與空白組（47. 53%±3. 22%） 比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤組織中Ki67 蛋白陽性表達率（26. 97%±3. 68% 和21. 50%±1. 53%）均明顯降低（Plt;0. 01）。與空白組（2. 37%±0. 46%） 比較，低和高劑量D-檸檬烯組小鼠腫瘤細胞凋亡率（20. 47%± 2. 39% 和31. 42%±1. 79%）均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖8 和9。

3 討 論

D-檸檬烯是一種具有芳香氣味的單環(huán)單萜化合物，在腫瘤細胞和動物模型中具有化學預防及化療活性［12-14］。研究［15］ 顯示：D-檸檬烯參與誘導腫瘤細胞凋亡， 具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。ZHANG 等［16］ 發(fā)現(xiàn)：D-檸檬烯通過細胞周期阻滯、活性氧產(chǎn)生和線粒體介導產(chǎn)生較好的抗胃癌作用。D-檸檬烯通過誘導細胞自噬和凋亡，抑制肺癌細胞增殖［17］。D-檸檬烯通過抑制AKT 磷酸化誘導細胞凋亡，抑制結腸癌細胞的惡性增殖。然而，D-檸檬烯對GBM 細胞的影響及其作用機制尚未完全闡明。

本研究結果顯示：D-檸檬烯在體內(nèi)和體外均可抑制GBM 細胞的生長或增殖，并能夠明顯促進細胞凋亡；不同濃度的D-檸檬烯能夠明顯降低GBM細胞存活率，從而抑制其增殖。小鼠體內(nèi)實驗進一步證實： D-檸檬烯抑制小鼠皮下移植瘤的生長。Caspases 在細胞凋亡中發(fā)揮核心作用，其可裂解并激活下游Caspase-3 蛋白， 導致PARP 裂解并最終導致細胞凋亡。Bcl-2 和Bax 是Bcl-2 家族成員，通過控制線粒體的完整性調節(jié)細胞凋亡。本研究結果顯示：D-檸檬烯能夠抑制Bcl-2 蛋白表達，并上調Bax、 PARP 和 cleaved Caspase-3 蛋白表達水平，提示D-檸檬烯能夠有效誘導GBM 細胞凋亡。

D-檸檬烯可通過調節(jié)AKT 蛋白表達水平抑制GBM 細胞增殖。AKT 通路是細胞內(nèi)重要的信號通路， 在調控細胞存活和凋亡中起關鍵作用。研究［18-21］ 顯示：部分抗癌藥物可通過阻斷AKT 信號傳導誘導細胞凋亡， 在多種類型的癌癥中， AKT促進細胞活性和細胞增殖。AKT 不僅在GBM 細胞增殖、凋亡和耐藥等方面均具有生物學活性，還直接影響GBM 患者的預后。本研究結果顯示：D-檸檬烯干預后，AKT 蛋白表達水平明顯降低，提示D-檸檬烯可能通過抑制GBM 細胞AKT 蛋白表達，激活下游凋亡相關蛋白抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，與以往研究［5］ 結果一致。

綜上所述，D-檸檬烯具有抑制GBM 細胞增殖的作用，其機制可能與調控AKT 蛋白的表達并激活Caspase-3 通路誘導凋亡有關。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王騰飛參與研究實施過程、數(shù)據(jù)采集和論文撰寫，陳鳳參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，齊玲參與研究方案制定，雷婷參與文獻整理和分析，宋美慧參與論文修訂和審校。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（82203351， 82160662）； 廣東省基礎研究委員會基礎與應用基礎研究基金項目（2021A1515111095，2021A1515010716）；廣東省清遠市人民醫(yī)院醫(yī)學科研基金（20220330）