摘 要：考察黃酮類化合物cudraflavone B對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA1001）的抑菌效果和作用機制.采取微量肉湯稀釋法測定cudraflavone B的最低抑菌濃度及最低殺菌濃度，并繪制其對MRSA1001的時間—殺菌曲線，進(jìn)行溶血活性和細(xì)胞毒性試驗評估其安全性，最后通過掃描電子顯微鏡觀察經(jīng)cudraflavone B處理后MRSA1001細(xì)胞的形態(tài)變化.結(jié)果表明，cudraflavone B對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，殺菌作用較弱，并對MRSA1001表現(xiàn)出一定的濃度依賴性殺菌活性；對人胚胎腎細(xì)胞未顯示出明顯的細(xì)胞毒性，對兔紅細(xì)胞也表現(xiàn)出較低溶血活性，表明其安全性較好；在掃描電子顯微鏡下觀察到，經(jīng)cudraflavone B處理后的細(xì)菌細(xì)胞呈現(xiàn)出塌陷并伴有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲出的現(xiàn)象，表明其作用機制可能是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，造成細(xì)菌死亡從而達(dá)到抗菌效果.cudraflavone B可作為抗菌藥物繼續(xù)發(fā)掘其價值.

關(guān)鍵詞：黃酮類化合物；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；抑菌作用；細(xì)胞毒性；作用機制

中圖分類號：R962

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引 言

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床常見的毒性較強的一種致病菌，也是引起院內(nèi)感染的重要感染源，具有較強的傳染性，在臨床上呈現(xiàn)出多種抗菌藥物（如萬古霉素和利奈唑胺等）在不同程度上耐藥的情況，并且這些抗菌藥物均發(fā)現(xiàn)了MRSA的耐藥株，且這些藥物都存在一定程度的毒副作用［1-4］.隨著耐藥率的不斷升高，亟需尋找新的抗菌藥物.黃酮類化合物又稱多酚類化合物，是一類天然的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，且種類眾多，具有多種生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)［5］.因其具有抑制多種病原微生物（包括多重耐藥菌）的生長趨勢而備受關(guān)注，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和酶抑制等作用［6］.由于黃酮類化合物具有顯著的抑菌活性，且毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，有替代部分抗生素的可能［7-8］.本研究將課題組前期合成的黃酮化合物柘樹二氫黃酮B（cudraflavone B）作為研究對象（見圖1），對其抗菌體外活性進(jìn)行評價，并通過細(xì)胞毒性和溶血性試驗評價其安全性，以及對其抗菌機制進(jìn)行初步研究.

1 材料與儀器

1.1 儀 器

HFsafe 1200型超凈工作臺（上海力申科學(xué)儀器有限公司），A400型多點接種儀（上海典森生物科技有限公司），PL203型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司），DensiCHEK PLus型電子比濁儀（梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司），Multiskan FC型酶標(biāo)儀、371型CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司），LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）， ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、easySpiral Pro型螺旋接種儀（上海智城分析儀器制造有限公司），JSM-IT7000HR型掃描電子顯微鏡（SEM）（日本電子株式會社）.

1.2 材 料

MH（A）培養(yǎng)基（批號，20220610）、MH（B）培養(yǎng)基（批號，20220430），均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；生理鹽水（批號，M22081603B），購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；LB培養(yǎng)基（批號，20200616），購自北京索萊寶科技有限公司；氨芐西林（批號，90MHRF6X），購自安徽澤升科技有限公司；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA1001），由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；金黃色葡萄球菌（ATCC29213）、糞腸球菌（ATCC29 212）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、大腸埃希菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、銅綠假單胞菌（ATCC27853），均購自ATCC菌種保藏中心.

2 方法與結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）

采取微量肉湯二倍稀釋法進(jìn)行MIC和MBC測定.細(xì)菌用MH（A）培養(yǎng)基，35～37 ℃ 孵育18～24 h.培養(yǎng)后挑取單菌落，麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝蛔笥遥s108 CFU/mL），再將此混懸菌液用無菌生理鹽水稀釋至終濃度為106 CFU/mL備用.用MH（B）培養(yǎng)液稀釋化合物cudraflavone B濃度至256 μg/mL，取200 μL cudraflavone B加入96孔板首孔，其余每孔加入100 μL的MH（B）培養(yǎng)液，從首孔吸取100 μL藥液依次對倍稀釋，尾孔吸出100 μL藥液棄去，再在每孔加入100 μL上述稀釋后的菌液，混勻，使菌液最終濃度為5×105 CFU/mL.最終藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008 μg/mL.另設(shè)置陽性對照組（氨芐西林）、藥物對照組（含cudraflavone B，不含菌液）和菌對照組（100 μL菌液與100 μL MH（B）培養(yǎng)基）.將96孔板置于培養(yǎng)箱中，35～37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h后，用酶標(biāo)儀測定孔板在600 nm 處吸光度（OD）值，讀取其MIC值.再取肉眼觀察孔內(nèi)溶液澄清即無細(xì)菌生長孔的培養(yǎng)液20 μL，轉(zhuǎn)種于不含藥物的MH（A）平皿表面，35～37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察到平皿中未見細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為其MBC值.測定結(jié)果見表1.

由表1可知，菌對照組均正常生長，氨芐西林對ATCC29213、ATCC29212和ATCC25922的MIC值分別為0.5、0.5和8 μg/mL，均在質(zhì)量控制范圍內(nèi)，說明本實驗系統(tǒng)和方法是可靠的.cudraflavone B對革蘭氏陽性菌ATCC29213、MRSA1001、ATCC29212和ATCC6633的MIC值范圍在1～2 μg/mL，有明顯的抑制作用，與對照藥氨芐西林相比，顯示出相當(dāng)或更高水平的抗菌效果；cudraflavone B對革蘭氏陰性菌ATCC25922、ATCC700603和ATCC27853的MIC值均大于128 μg/mL，沒有抑制作用.此外，化合物cudraflavone B對革蘭氏陽性菌MBC和MIC比值在8～16倍之間，顯示出較弱的殺菌作用.

2.2 時間—殺菌曲線

為進(jìn)一步研究化合物cudraflavone B的殺菌效果，根據(jù)其MIC結(jié)果，將cudraflavone B與氨芐西林分別稀釋至終濃度依次為1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC的含藥肉湯，每管各2 mL.時間點設(shè)為0、2、4、8和24 h，每個時間點各準(zhǔn)備1支平行管，同時準(zhǔn)備菌對照組，加入MRSA1001菌液，使菌液終濃度約106 CFU/mL，振蕩、混勻，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器，在150 r/min，35～37 ℃條件下震蕩培養(yǎng).按時間點將對應(yīng)平行管取出，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，選擇合適的稀釋梯度，用螺旋接種儀分別取100 μL至2只制備好的MH（A）培養(yǎng)皿中涂布，35～37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計數(shù)，取平均值計算原菌液中菌濃度.以時間為橫坐標(biāo)，菌液濃度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制時間—殺菌曲線，如圖2和圖3所示.

由圖可知，24 h內(nèi)對照組菌液生長正常，當(dāng)cudraflavone B濃度為4×MIC時，在4 h和8 h時，使MRSA1001分別降低了2.0和1.4 lg（CFU/mL），濃度為8×MIC時，在4和8 h時，使MRSA1001分別降低了2.2和2.4 lg（CFU/mL），在24 h內(nèi)，細(xì)菌未明顯生長.結(jié)果表明，cudraflavone B對MRSA1001表現(xiàn)出一定的濃度依賴性殺菌效果，并且略強于氨芐西林.

2.3 體外細(xì)胞毒性

安全性是藥物開發(fā)的基本要素之一，安全性試驗對評估藥物使用風(fēng)險具有重要意義［9］.本研究通過體外細(xì)胞毒性和溶血試驗初步評估化合物cudraflavone B的安全性.使用人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）測定其體外細(xì)胞毒性，確定其對哺乳動物細(xì)胞是否具有潛在細(xì)胞毒性.將冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇，于37 ℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代2～3次.將每孔約2×104個細(xì)胞均勻接種在96孔板中，并置于37 ℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，再向孔板中加入cudraflavone B，使其終濃度依次為1、2、4、8、16和32 μg/mL，不含藥的細(xì)胞作為陰性對照組.在37 ℃含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用噻唑藍(lán)（MTT）工作溶液與細(xì)胞混合，并孵育4 h，采用酶標(biāo)儀于540 nm測量每孔的吸光度，計算細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖4所示.

由圖4可知，HEK293細(xì)胞在cudraflavone B濃度為32 μg/mL時，細(xì)胞存活率超過90%；濃度在16 μg/mL及低于16 μg/mL時，細(xì)胞存活率均超過100%.結(jié)果表明，cudraflavone B對細(xì)胞HEK293未顯示出細(xì)胞毒性，對哺乳動物細(xì)胞具有較好的安全性.

2.4 溶血活性

溶血性研究是中藥和天然藥物制劑臨床安全性評價的重要組成部分，使用兔紅細(xì)胞測定cudraflavone B體外溶血性.將兔紅細(xì)胞用滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，并在PBS中制得10%的兔紅細(xì)胞懸浮液.用PBS將cudraflavone B分別稀釋至濃度為2、4、8、16、32和64 μg/mL的溶液，并加入等量的10%兔紅細(xì)胞懸浮液，混勻，0.2%曲拉通（Triton）X-100作為陽性對照組，PBS作為空白對照組，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，取出以2 500 r/min離心5 min，吸取上清液至干凈的96孔板中，采用酶標(biāo)儀于540 nm測量每孔的OD值，計算其紅細(xì)胞溶血率，計算公式為，

溶血率=（OD2-OD1）/（OD3-OD1）×100%（1）

式中，OD1、OD2和OD3分別為空白對照組、實驗組和陽性對照組的OD值.

結(jié)果表明，cudraflavone B的濃度為32 μg/mL時，對兔紅細(xì)胞溶血率為6.34%，呈現(xiàn)較低溶血活性；濃度在16 μg/mL時，對兔紅細(xì)胞溶血率為1.9%，呈現(xiàn)低溶血活性，濃度低于16 μg/mL時，對兔紅細(xì)胞溶血率低于0.8%.結(jié)果表明，cudraflavone B對兔紅細(xì)胞未顯示出溶血活性.2個安全性試驗結(jié)果表明，cudraflavone B毒性較低，可作為抗菌藥物進(jìn)一步研究.

2.5 SEM成像

為了進(jìn)一步研究cudraflavone B對MRSA1001的作用機制，在SEM下觀察MRSA1001經(jīng)cudraflavone B處理后的形態(tài)變化.將對數(shù)期生長的MRSA1001，3 000 r/min離心5 min后，細(xì)菌菌體用PBS洗滌2次，并調(diào)至細(xì)菌濃度為109 CFU/mL，并與8×MIC濃度的cudraflavone B在35～37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，未用cudraflavone B處理的細(xì)菌作為對照.之后培養(yǎng)物用PBS洗滌2次，用2.5%的戊二醛將細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行固定并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?將菌體再進(jìn)一步固定和染色，用濃度逐級遞增的乙醇進(jìn)行洗脫、干燥，并在臨界點鍍金，并在SEM下觀察細(xì)菌細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知，未經(jīng)cudraflavone B處理過的對照細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)完整，表面平坦光滑，無細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲出，而經(jīng)過cudraflavone B處理后的細(xì)菌細(xì)胞呈現(xiàn)出塌陷，部分細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲出.表明cudraflavone B可能通過破壞細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜，從而破壞細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)，達(dá)到抗菌效果.

3 討 論

由于MRSA 感染具有致病危害性高、病情程度嚴(yán)重、病死率高及治療難度大等特點，造成臨床上治療困難，另外在治療中可選用的抗生素范圍狹窄，且MRSA對多種抗生素存在耐藥情況.因此，迫切需要開發(fā)新的抗菌藥物，而天然產(chǎn)物有獨特的藥理活性，是抗菌藥物的重要來源，臨床使用的大多數(shù)藥物都是受天然產(chǎn)物的啟發(fā)或衍生自天然產(chǎn)物.本課題組合成的黃酮類天然產(chǎn)物cudraflavone B對包括金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和枯草芽孢桿菌在內(nèi)的幾種革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其對MRSA1001具有同樣強的抑菌作用，表現(xiàn)出對耐藥革蘭氏陽性菌的候選抗菌藥物潛力.此外，本研究還通過細(xì)胞毒性和溶血活性試驗對cudraflavone B進(jìn)行安全性評估.當(dāng)其濃度達(dá)到32×MIC時，表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和低溶血活性，表明其有較好安全性，具有進(jìn)一步開發(fā)的價值，今后將繼續(xù)對其進(jìn)行其他安全性評估研究.

黃酮類化合物可通過破壞細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜功能，抑制核酸合成和抑制能量代謝等多種作用機制發(fā)揮抗菌作用，還可通過與宿主細(xì)胞信號通路的相互作用，發(fā)揮抑制細(xì)菌誘導(dǎo)的炎癥，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)等重要作用.如Song等［10］發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物α-mangostin （AMG）和isobavachalcone （IBC）可作用于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，影響細(xì)菌膜流動性從而起到抗菌活性.Cushnie等［11］發(fā)現(xiàn)，高良姜素可誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)膜損傷，造成鉀離子滲出，因細(xì)胞自我分解和細(xì)胞壁損傷及滲透溶解，產(chǎn)生抑菌作用.Meenu等［12］使用SEM和LIVE/DEAD BacLight 細(xì)菌試劑盒等觀察到黃酮類化合物Artocarpin可作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，造成細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)碎片從裂解的細(xì)胞中滲出.在本研究中，通過SEM觀察到，經(jīng)過cudraflavone B處理后，MRSA1001細(xì)菌表面遭到破壞，許多細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)從裂解的細(xì)胞中滲出，這表明cudraflavone B可能通過相似作用機制，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌生長，達(dá)到治療抗感染的效果，今后將繼續(xù)進(jìn)行其機制研究.綜上所述，黃酮類化合物在抗感染治療中具有潛在的開發(fā)價值.

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Antibacterial Effect and Mechanism of Flavonoid Compound Cudraflavone B on MRSA

Abstract：

To investigate the antibacterial effect and mechanism of flavonoid codpound cudraflavone B on methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA1001），the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of cudraflavone B were determined by using the micro broth dilution method，and its time bactericidal curve against MRSA1001 was plotted.Its safety was evaluated through hemolytic activity and cytotoxicity tests.Finally，the morphological changes of MRSA1001 after treatment were observed by scanning electron microscopy.The results showed that cudraflavone B exhibited a significant inhibitory effect on Gram-positive bacteria，weak bactericidal effect，and showed a certain concentration dependent bactericidal activity against MRSA1001.No significant cytotoxicity was observed on HEK293 cells，and low hemolytic activity was also observed on rabbit red blood cells，which indicated high safety.Under scanning electron microscopy，bacterial cells treated with cudraflavone B showed collapse accompanied by liquid exudation，indicating that its mechanism of action might be achieved by disrupting the bacterial cell membrane，and thereby achieving antibacterial effects.In summary，cudraflavone B can continue to be explored for its value as an antibacterial drug.

Key words：

flavonoids;methicillin-resistant staphylococcus aureus;antibacterial effect;cytotoxicity;mechanism