摘 要：我國(guó)畜禽血液資源十分豐富，目前血液蛋白精深加工、血液蛋白活性肽酶解、氯化血紅素制備等工作已取得明顯成效。近年來(lái)，血液外泌體作為一類新型功能性成分，已被證明具有多種功能活性，在食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑方面具有極強(qiáng)的開發(fā)潛力。然而，血液外泌體的基礎(chǔ)研究還處于起步階段。為了未來(lái)更好地對(duì)血液外泌體進(jìn)行有效資源開發(fā)，本文對(duì)其結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成進(jìn)行概述，回顧血液外泌體功能活性的近年研究進(jìn)展，綜述不同提取、保存方法對(duì)血液外泌體活性的影響，對(duì)血液外泌體未來(lái)潛在的生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)行展望，旨在為畜禽血液資源挖掘、血液外泌體的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供思路。

關(guān)鍵詞：畜禽血液；血液深加工；血液外泌體；功能活性；資源挖掘

Progress on the Function and Resource Development of Livestock and Poultry Blood Exosomes

XU Ronglu， MAI Jiwen， SHI Yuwei， CAO Jinxuan， ZHANG Chan， YANG Xinyao， WANG Xue’er， WU Shixiang， WANG Ying*

（Key Laboratory of Geriatric Nutrition and Health， Ministry of Education， College of Food and Health，

Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

Abstract： There are abundant blood resources of livestock and poultry in our country. At present， remarkable results have been achieved in the deep processing of blood proteins， the enzymatic hydrolysis of blood proteins for the production of active peptides， and the preparation of hemin chloride. In recent years， blood exosomes， as a new class of functional ingredients， have been shown to have a variety of functional activities， and have great potential in the development of nutritional food supplements. However， basic research on blood exosomes is still in its infancy. In order to develop blood exosomes effectively in the future， this paper summarizes the structure and chemical composition of blood exosomes， reviews the recent progress research on the functional activities of blood exosomes and the effects of different extraction and preservation methods on them， and discusses future prospects for the production and application of blood exosomes. This paper aims to provide ideas for the mining of livestock and poultry blood resources and the further development and application of blood exosomes.

Keywords： animal blood; deep processing of blood; blood exosomes; functional activities; resource development

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230913-083

中圖分類號(hào)：TS251.2 " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）03-0070-08

引文格式：

徐榮鷺， 麥籍文， 石雨薇， 等. 畜禽血液外泌體功能及其資源開發(fā)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2024， 38（3）： 70-77. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230913-083. " "http：//www.rlyj.net.cn

XU Ronglu， MAI Jiwen， SHI Yuwei， et al. Progress on the function and resource development of livestock and poultry blood exosomes[J]. Meat Research， 2024， 38（3）： 70-77. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230913-083.

http：//www.rlyj.net.cn

我國(guó)畜禽總產(chǎn)量連年居世界第一，畜禽加工產(chǎn)生的血液資源十分豐富，因其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他活性物質(zhì)，在食品工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。我國(guó)畜禽血液的初級(jí)利用仍以傳統(tǒng)血豆腐、血球粉、血液粉等加工形式為主、利用率和產(chǎn)業(yè)化程度較低[1]。近年來(lái)，通過(guò)大力挖掘畜禽血液功能因子，血液加工已向系列化、多樣化和高附加值方向發(fā)展，如畜禽血液中提取的部分酶類、維生素、激素及活性肽等已在食品、化妝品中及臨床有較廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái)，為了更好地利用血液蛋白資源，在提高血液凝膠強(qiáng)度和挖掘血液蛋白自身特性方面，科研人員進(jìn)行了各種嘗試。有研究表明，外源添加亞麻籽膠和瓜爾豆膠[2]、瓜爾豆膠與魔芋膠復(fù)配聯(lián)合超聲處理[3]、超聲波破壁[4]及高壓脈沖電場(chǎng)處理[5]等均對(duì)血液凝膠強(qiáng)度具有顯著增強(qiáng)作用。以分離的豬血紅血球?yàn)殍F強(qiáng)化原料制備得到的血紅蛋白微膠囊化明膠軟糖具有良好的色澤和風(fēng)味，口感細(xì)膩、有良好的彈性和韌性[6]。采用冷凍沉淀法分離純化豬血中的纖維蛋白原，利用其黏合特性可用于對(duì)碎牛肉和碎干腌火腿進(jìn)行重組，制備得到重組牛排和重組干腌火腿[7]。

除了對(duì)完整血液蛋白的開發(fā)利用以外，近年來(lái)，科學(xué)家們?cè)趯?duì)血液蛋白酶解產(chǎn)物和活性肽的制備與應(yīng)用方面也開展了大量工作。血液蛋白經(jīng)酶解處理后得到多種小肽混合物，具有良好消化吸收性，同時(shí)還具有抗氧化性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、增強(qiáng)肌原纖維凝膠和保水性等功能特性，可作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、凝膠強(qiáng)化劑和營(yíng)養(yǎng)保健品[8-9]。以血液資源制備氯化血紅素作為鐵補(bǔ)充劑，具有良好的應(yīng)用潛力。提取氯化血紅素的主要方法有血粉法、醋酸鈉法、羧甲基纖維素鈉法等，其中血粉法制備的氯化血紅素產(chǎn)量最高[10]。氯化血紅素是一類具有過(guò)氧化物酶催化功能的蛋白質(zhì)輔基，其生物利用度較高，目前在食品、醫(yī)藥、保健領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，可作為人工合成色素、抗貧血藥、細(xì)胞抗氧化劑等[11]。有研究者發(fā)現(xiàn)，將氯化血紅素作為人工合成色素使用可以獲得較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有效預(yù)防缺鐵性貧血[12]。此外，氯化血紅素還能改善脊髓損傷的恢復(fù)速度，促進(jìn)脊髓修復(fù)[11]。

進(jìn)一步研究表明，氯化血紅素誘導(dǎo)的血紅素加氧酶具有抑制COVID-19炎癥的作用，可能為新冠病毒的潛在治療藥物[13]。然而，局限于氯化血紅素特殊腥臭味，目前以氯化血紅素為鐵強(qiáng)化劑的功能性食品較少，對(duì)氯化血紅素的包埋和產(chǎn)品開發(fā)工作有待進(jìn)一步開展。

除上述功能活性成分外，血液外泌體作為一類新型功能性成分，近年來(lái)被證明具有保護(hù)心血管、增強(qiáng)免疫力、治療重癥COVID-19、緩解關(guān)節(jié)炎、緩解腸壁損傷等多種作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于血液外泌體的功能研究多樣，血液外泌體在食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑方面具有極強(qiáng)的開發(fā)潛力。然而，血液外泌體的基礎(chǔ)研究還處于起步階段。本文對(duì)血液外泌體的化學(xué)組成、功能活性及提取穩(wěn)態(tài)方法進(jìn)行概述，對(duì)其未來(lái)潛在的生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)行展望，旨在為畜禽血液資源挖掘、血液外泌體的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供思路。

1 血液外泌體結(jié)構(gòu)與組分研究進(jìn)展

1.1 血液外泌體定義及結(jié)構(gòu)

真核細(xì)胞釋放不同類型的細(xì)胞外囊泡，包括外泌體、胞外體和微泡。外泌體可由大多數(shù)類型細(xì)胞釋放，細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成多囊泡體，與質(zhì)膜融合后向胞外分泌外泌體[14]，廣泛分布于血液、乳汁、尿液、腦脊液等體液中。血液外泌體是血液中各種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種亞細(xì)胞成分，含量為1.10～1.18 g/mL[14]，直徑為30～150 nm，具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)，以維持外泌體囊泡的完整性和穩(wěn)定性，并保護(hù)其內(nèi)容物不被降解[15]。外泌體膜表面帶有負(fù)電荷，攜帶細(xì)胞特異性的活性成分，在細(xì)胞間信息傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。

1.2 血液外泌體組成

血液外泌體化學(xué)組成與其功能活性如表1所示。血液外泌體包含多種類型的活性分子，這些活性分子可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞基質(zhì)中，介導(dǎo)多效性生物學(xué)功能，如免疫反應(yīng)、抗原呈遞、癌癥反應(yīng)、細(xì)胞通訊以及RNA和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移等[24]。外泌體中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)有膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白（如細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）、線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，

MFN2））、分泌蛋白（如富亮氨酸α-2-糖蛋白1（leucine-rich α-2-glycoprotein 1，LRG1））、蛋白激酶（如局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK））、干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（interferon-induced transmembrane protein，IFITM）、脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）、細(xì)胞外膜蛋白（如纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N））、四次穿膜蛋白家族（如CD63、CD81、CD151、CD171、TSPAN8）等[25]。

四次穿膜蛋白通常用作外泌體標(biāo)記物。血液外泌體中除含有外泌體普遍存在的這些蛋白外，還包括一些血液中特有的細(xì)胞因子，如血小板來(lái)源的血友病因子及整合蛋白CD41a等，這些蛋白常在臨床中作為腫瘤及相關(guān)疾病診斷的重要依據(jù)[26]。

除了蛋白以外，外泌體中也含有不同種類的脂質(zhì)，如磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、溶血磷脂酰甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）等，它們作用于不同的受體細(xì)胞，并在疾病診斷治療方面發(fā)揮不同的作用。

血液外泌體中含有大量信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）[27]。目前研究表明，外泌體源性miRNA作為各種疾病診斷和預(yù)后判斷的新型分子生物標(biāo)志物具有很大的應(yīng)用潛能[28]。外周血液中還發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶多種運(yùn)動(dòng)因子（如miRNA等），在運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)性適應(yīng)中發(fā)揮重要的通訊作用[29]。

2 血液外泌體的功能活性研究現(xiàn)狀

血液外泌體是血液的重要組成部分之一，攜帶和傳遞重要信號(hào)分子，調(diào)控生物體內(nèi)多種生理與病理過(guò)程，如參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨組織修復(fù)、保護(hù)心血管及抗病毒等。此外，由于其高敏感性、高特異性和高穩(wěn)定性，外泌體還可作為不同疾病的生物標(biāo)志物尤其是用于腫瘤等疾病的診斷，或作為藥物遞送載體彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥物水溶性差及細(xì)胞滲透力低等缺陷[30]，對(duì)禽畜血液資源的利用和新型食品藥品的開發(fā)具有重要價(jià)值（圖1）。

2.1 參與炎癥反應(yīng)

炎癥是一種免疫反應(yīng)，通常被認(rèn)為是宿主和免疫細(xì)胞之間穩(wěn)態(tài)的喪失，并且與許多疾病的發(fā)展有關(guān)，例如感染、自身免疫、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病和癌癥[15]。

有研究報(bào)道，免疫細(xì)胞分泌到血液中的外泌體不僅調(diào)節(jié)生物體的生理和病理過(guò)程，并介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)[31]。外泌體可通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方式減輕炎癥反應(yīng)，并依賴其脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和穿越血-腦屏障的優(yōu)勢(shì)，作為給藥載體應(yīng)用于癲癇的治療[32]。研究結(jié)果顯示，血液外泌體可以傳遞炎癥信號(hào)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，為腦缺血損傷治療的研究提供了新思路[33]。此外，臍血液外泌體能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，下調(diào)炎癥因子，對(duì)于改善老年人低度炎癥體質(zhì)、減緩免疫細(xì)胞衰老有一定調(diào)節(jié)作用[34]。

2.2 促進(jìn)骨組織修復(fù)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的致殘疾病，現(xiàn)已成為困擾全球的衛(wèi)生健康問(wèn)題之一，導(dǎo)致巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本。Torreggiani等[35]研究證明，血液外泌體作用于局部環(huán)境的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨前體細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞，促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞向骨損傷處遷移、細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到促進(jìn)骨組織修復(fù)的作用，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有良好的輔助治療效果。Tao Shicong等[36]發(fā)現(xiàn)，血液外泌體可以促進(jìn)骨組織的維持和再生，并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。有研究

表明，動(dòng)物血液外泌體能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)骨形成[37]。Liu Xuchang等[38]報(bào)道，富血小板血液來(lái)源外泌體可通過(guò)控制促炎癥因子釋放和減輕炎癥反應(yīng)減少軟骨組織丟失，從而促進(jìn)軟骨再生，逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎損傷。

2.3 保護(hù)心血管

我國(guó)正在逐步進(jìn)入老齡化社會(huì)，心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，近些年研究發(fā)現(xiàn)，血液中的外泌體及其內(nèi)容物可促進(jìn)血管生成、抗氧化、抑制血栓形成和改善心肌纖維化作用。研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者的血小板外泌體中含有較高含量的miR-126和血管生成因子，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[39]。此外，經(jīng)活血益氣處理后的大鼠血液外泌體能促進(jìn)心梗后血管新生，減少心肌損傷，改善心功能，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及提高血管成管能力[40]。史斌浩等[41]研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體可以保護(hù)血管免受過(guò)氧化氫氧化。內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)源外泌體可以抑制血小板對(duì)血管內(nèi)皮修復(fù)的拮抗作用，從而抑制血栓形成。在改善心肌纖維化方面，血液外泌體中miR-218-5p和miR-363-3p可改善大鼠心肌組織病理變化和心臟功能[42]。

2.4 抗病毒

新冠病毒爆發(fā)以來(lái)，抗病毒藥物的研發(fā)已達(dá)到前所未有的水平。血液外泌體中的miRNA、蛋白質(zhì)和其他生物分子可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗病毒作用。He Jianguo[43]研究發(fā)現(xiàn)，鱖魚血液外泌體可以結(jié)合干擾素誘導(dǎo)的黏病毒抵抗蛋白1，抑制鱖魚傳染性脾腎壞死病毒復(fù)制[44]。

2.5 作為生物標(biāo)志物用于疾病診斷

血液中的外泌體與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物相比具有較高穩(wěn)定性，且參與多種疾病形成，使其可以作為一種疾病診斷的非創(chuàng)傷性液體活檢指標(biāo)[45]。研究顯示，血液中的外泌體miRNA和蛋白質(zhì)是較為常見(jiàn)的標(biāo)志物，如血液外泌體中的miR-21被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)，包括胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等[46]。目前可用于臨床診斷的外泌體蛋白包括用于肺癌診斷的LBP、FN，用于乳腺癌診斷的SH3GL2、MFN2和用于胃癌診斷的TRIM3等。血液外泌體除作為腫瘤生物標(biāo)志物外，還可作為生物標(biāo)志物用于肺炎、肺結(jié)核、血栓及神經(jīng)退行性疾病的診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于新冠病毒康復(fù)患者的血液外泌體中含有攜帶病毒的蛋白，可作為檢測(cè)新冠病毒感染的潛在生物標(biāo)志物[47]。此外，動(dòng)脈粥樣硬化病人血液外泌體中miR-223、miR-339和miR-21表達(dá)水平明顯升高，可作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)急性血栓的形成[48]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源的血液外泌體已被證明在各種神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、額顳葉癡呆和朊病毒病[49]。

2.6 用作載體

目前，臨床上常用的傳統(tǒng)藥物水溶性、生物相容性及細(xì)胞滲透率較低，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限[50]。利用天然外泌體攜帶核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的特性，且能有效降低藥物清除率，可將外泌體作為一種負(fù)載核酸、化療藥物化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)類藥物的優(yōu)良載體，用于疫苗制備和靶向藥物研發(fā)。外泌體作為藥物載體，具有免疫源性低、運(yùn)輸效率高、穩(wěn)定性好、靶向性強(qiáng)及能跨越血腦屏障等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[51]。同時(shí)，在疫苗研制方面，外泌體具有易攜帶更穩(wěn)定核酸材料的機(jī)制，這將為疫苗在體內(nèi)的傳遞提供新路徑[52]。

2.7 用于新型食品開發(fā)

外泌體是一種細(xì)胞分泌的小囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)，具有多種生物功能活性，包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)細(xì)胞再生和修復(fù)、抗炎等作用[31]。這些功能活性對(duì)于新型食品的開發(fā)有重要指導(dǎo)意義，可以應(yīng)用到食品中以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性。

2.7.1 營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化

外泌體中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)[24]，可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到食品中，增加食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，幫助改善人體健康。例如，可以將外泌體添加到乳制品、谷物制品、保健品等產(chǎn)品中，以提高其蛋白質(zhì)和核酸含量。

2.7.2 功能性食品開發(fā)

外泌體中的生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞再生和修復(fù)等作用[31]，可以應(yīng)用到功能性食品開發(fā)中。例如，可以將外泌體添加到免疫調(diào)節(jié)型食品、抗炎食品、抗衰老食品等產(chǎn)品中，滿足消費(fèi)者對(duì)健康功能性食品的需求。

2.7.3 食品保鮮

外泌體中的脂質(zhì)成分具有良好的乳化和抗氧化性質(zhì)[53]，

幫助延緩食品氧化進(jìn)程，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，同時(shí)也有助于保護(hù)人體細(xì)胞免受氧化損傷。例如，可以將外泌體作為乳化劑添加到乳制品、沙拉醬等產(chǎn)品中，延長(zhǎng)其保質(zhì)期。

2.7.4 食品工藝改進(jìn)

外泌體中的生物活性物質(zhì)具有乳化、穩(wěn)定乳液、增稠等功能，可以應(yīng)用于食品工藝改進(jìn)。例如，可以將外泌體作為乳化劑或穩(wěn)定劑添加到各類食品中，改善其口感和質(zhì)地。血液外泌體中還含有豐富的蛋白質(zhì)和

氨基酸，可以作為天然的調(diào)味料，提升食品的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

總的來(lái)說(shuō)，血液外泌體作為一種潛在的食品添加劑和功能性成分，可能為食品生產(chǎn)領(lǐng)域帶來(lái)新的創(chuàng)新和發(fā)展機(jī)遇，為消費(fèi)者提供更加健康、營(yíng)養(yǎng)和更具功能性的食品。然而，在應(yīng)用過(guò)程中需要充分考慮其穩(wěn)定性、安全性和法規(guī)要求等因素，確保產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。同時(shí)，還需要加強(qiáng)對(duì)外泌體的研究和開發(fā)，提高其提取、純化和應(yīng)用技術(shù)水平，以更好地發(fā)揮其潛在價(jià)值。

3 血液外泌體提取方法與活性穩(wěn)態(tài)化研究現(xiàn)狀

3.1 血液外泌體提取方法研究現(xiàn)狀

不同的生物液體需要適當(dāng)?shù)臉悠凡杉㈩A(yù)處理和處理方法。血液外泌體相對(duì)含量較高，提取與穩(wěn)定性相關(guān)的研究較多，然而獲得高純度、結(jié)構(gòu)完整及具有較好生物活性的外泌體仍然是血液外泌體分離難點(diǎn)。目前，最常用的血液外泌體提取方法有超速離心法、超濾法、免疫磁珠法及聚合物沉淀法等，其中超速離心法被認(rèn)為是普遍適用的方法，其得到的外泌體產(chǎn)物通常能保留較好的形態(tài)結(jié)構(gòu)。然而，超速離心法對(duì)設(shè)備要求較高，且分離時(shí)間較長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣[54]。當(dāng)需要進(jìn)一步純化時(shí)，不能依靠簡(jiǎn)單的分離方法，因?yàn)榇祟惸遗莸奈锢砘瘜W(xué)性質(zhì)（尺寸和密度）和組成特性差異較小。主要采用通過(guò)差速離心獲得的粗囊泡制劑的密度梯度分選，可以消除污染物質(zhì)，如較大的蛋白質(zhì)聚集體和與囊泡非特異性相關(guān)的蛋白

質(zhì)[27]。目前正在研究更多的替代提取方法，如微流控法和尺寸排阻色譜法等。上述方法按照目標(biāo)外泌體的特異性結(jié)合位點(diǎn)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、密度等特殊性狀提高了目標(biāo)外泌體的分離效率、提取純度及產(chǎn)量，縮短了分離時(shí)間。

由于缺少對(duì)于血液外泌體分離方法的統(tǒng)一評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，在某種程度上制約了分離技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化，且不同來(lái)源血液樣品組分豐富多樣且不一，使分離結(jié)果易受生物特征物質(zhì)的影響，目標(biāo)外泌體的純度和提取率發(fā)生改變，故需要在分離前對(duì)血液樣品進(jìn)行分析和比較，最終確定合適的分離方法。

血液外泌體提取方法優(yōu)缺點(diǎn)如表2所示。

3.2 血液外泌體保存技術(shù)研究現(xiàn)狀

畜禽血液外泌體具有作為食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物質(zhì)的應(yīng)用潛力，但其穩(wěn)定性較差，易引起食品安全問(wèn)題。外泌體中含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸和其他營(yíng)養(yǎng)成分，這些營(yíng)養(yǎng)成分可能會(huì)在加工、貯藏或運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生降解，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，食品發(fā)生異常變化，產(chǎn)生有害物質(zhì)或滋生細(xì)菌，從而影響食品的安全性。此外，外泌體穩(wěn)定性差可能影響食品的品質(zhì)和口感[61]。因此，血液外泌體如何延長(zhǎng)活性維持時(shí)間和提高保存穩(wěn)定性成為急需解決的問(wèn)題。

為了保持血液外泌體的活性和穩(wěn)定性，國(guó)內(nèi)外近年來(lái)一些血液外泌體穩(wěn)態(tài)化研究方法可供參考，包括低溫保存、冷凍干燥、膜修飾表面法等，但由于血液外泌體組分復(fù)雜，受不同來(lái)源和不同分離方法的影響較大，不同保存技術(shù)產(chǎn)生的效果存在差異。

3.2.1 低溫保存技術(shù)

目前對(duì)于外泌體保存穩(wěn)定性和生物活性維持最好的技術(shù)是低溫保存技術(shù)，此技術(shù)使用二甲基亞砜、乙二醇和海藻糖等防凍劑作為防凍液劑，將溫度降至生化反應(yīng)所需溫度下，以此來(lái)保持血液外泌體功能的穩(wěn)定性[62]。外泌體的保存溫度對(duì)其穩(wěn)定性和功能性有重要影響。

在血液外泌體的低溫保存法中，一般采用4、

－20、－80、－196 ℃等溫度保存[62]。4 ℃低溫保存法可使外泌體保持較好的穩(wěn)定性和功能性，延長(zhǎng)外泌體的保存時(shí)間，適用于短期保存。－20 ℃及－80 ℃低溫保存能夠有效保護(hù)外泌體的穩(wěn)定性和功能性，外泌體中PC含量增加、PE及PS含量降低；對(duì)外泌體大小及數(shù)量沒(méi)有顯著影響，蛋白質(zhì)及miRNA穩(wěn)定[61]。液氮提供極低溫度環(huán)境，能夠最大限度地保護(hù)外泌體的完整性和功能性，適用于長(zhǎng)期保存和冷凍保存要求極高的外泌體樣品。故4 ℃、

－20 ℃低溫法可用于血液外泌體的短期保存，－80 ℃低溫及液氮保存是較好的長(zhǎng)期保持穩(wěn)定活性的方式。

此外，由于保存血液外泌體技術(shù)尚不成熟，部分試驗(yàn)采取低溫保存血液、使用時(shí)再?gòu)闹蟹蛛x血液外泌體的方法維持外泌體的活性。例如，Kalra等[63]研究發(fā)現(xiàn)，保存在4、－20、－80 ℃血液中的外泌體在3 個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的；Ge Qinyu等[64]研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃下血液中miRNA可保存2 周，－20 ℃下外泌體miRNA在2 個(gè)月內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，在－80 ℃下保存時(shí)間可達(dá)5 年。但也有研究表明，血液中的其他物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致外泌體總RNA降解，因此具體的實(shí)驗(yàn)方法還需根據(jù)提取目標(biāo)外泌體的不同進(jìn)行選擇。

3.2.2 冷凍干燥技術(shù)

冷凍干燥是一種保存血液外泌體的新興技術(shù)，此技術(shù)是將血液外泌體中的水分冷卻成冰，利用真空直接升華除去水分，從而保持其原有活性，因此適合熱敏性血液外泌體保存。冷凍干燥法可添加海藻糖等，作為保護(hù)外泌體分子結(jié)構(gòu)的防凍劑[65]。冷凍干燥的外泌體在25 ℃保存可保持活性[62]。該技術(shù)是室溫保存血液外泌體較為經(jīng)濟(jì)、有效的方法，但對(duì)于外泌體活性有輕微影響。李洪超等[66]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體經(jīng)凍干、再水化處理后仍保持膜完整性。

3.2.3 噴霧干燥技術(shù)

噴霧干燥技術(shù)相較于冷凍干燥技術(shù)更加簡(jiǎn)單、便捷，其技術(shù)方法是將血液外泌體溶液在干燥室中霧化后，利用水分與熱空氣接觸迅速蒸發(fā)的原理制得外泌體干粉[67]。噴霧干燥過(guò)程中，霧化壓力和出口溫度是影響外泌體穩(wěn)定性的重要因素。該技術(shù)操作方便、經(jīng)濟(jì)，但外泌體穩(wěn)定性和活性等相較其他方法較差[62]。Xu Jingyi等[68]

通過(guò)噴霧干燥技術(shù)成功制備了外泌體，并很好地維持其生物活性。

3.2.4 膜表面改造技術(shù)

外泌體的表面改造是對(duì)外泌體磷脂膜的表面工程。通過(guò)使用合成脂質(zhì)體，和外泌體間進(jìn)行膜融合修飾外泌體表面，嵌入肽或抗體的脂質(zhì)體或聚乙二醇，利用凍融方法可以改變和優(yōu)化外泌體表面性質(zhì)。利用此技術(shù)保存可以有效增加外泌體的穩(wěn)定性[69-70]。王璐等[71]利用表面改造技術(shù)，并在外泌體磷脂雙分子層上修飾人表皮生長(zhǎng)因子受體核酸適配體，使外泌體得以較好保存?？傊笄菅和饷隗w的保存方法仍需深入研究，以充分利用血液外泌體。

不同血液外泌體保存技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)如表3所示。

4 結(jié) 語(yǔ)

血液外泌體作為一類新型功能性成份，含有豐富的生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等。已證明外泌體具有多種功能活性，如參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨組織修復(fù)、保護(hù)心血管、抗病毒、作為運(yùn)輸載體等，對(duì)禽畜血液資源的利用和新食品的開發(fā)具有重要價(jià)值。

通過(guò)深入研究畜禽血液外泌體的功能，可以開發(fā)出更多高效、低成本的生物活性成分。利用畜禽血液外泌體中的生物活性成分作為食品添加劑，可以開發(fā)具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞再生和修復(fù)、抗炎、抗衰老等功能的功能性食品，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性，生產(chǎn)更加健康、營(yíng)養(yǎng)的新型食品。此外，血液外泌體中的生物活性分子具有抗菌、抗氧化等功能，可用于延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)食品的需求。

畜禽血液外泌體功能研究的不斷深入有望推動(dòng)食品科技的創(chuàng)新發(fā)展，為食品行業(yè)帶來(lái)新的技術(shù)和產(chǎn)品，推動(dòng)行業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。然而，在應(yīng)用過(guò)程中需要充分考慮血液外泌體的穩(wěn)定性、安全性和法規(guī)要求等因素，確保產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。同時(shí)，還需要加強(qiáng)對(duì)血液外泌體的研究和開發(fā)，提高其提取、純化和應(yīng)用技術(shù)水平，更好地發(fā)揮其潛在價(jià)值。總的來(lái)說(shuō)，血液外泌體作為一種具有多種生物活性的天然物質(zhì)，在食品行業(yè)的應(yīng)用開發(fā)中具有廣闊的前景。加強(qiáng)對(duì)血液外泌體功能及其在食品行業(yè)應(yīng)用開發(fā)的研究將有助于推動(dòng)食品行業(yè)的創(chuàng)新和發(fā)展，提供更加健康、更具功能性的食品。

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