摘 要：為研究冷凍方式對小龍蝦品質(zhì)的影響，分別利用空氣冷凍、浸漬冷凍、靜磁場輔助浸漬冷凍及液氮冷凍處理小龍蝦并探究肌原纖維蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：相較于空氣冷凍，浸漬冷凍或液氮冷凍能夠不同程度提升小龍蝦肌原纖維蛋白的Zeta電位絕對值，抑制總巰基含量的降低，保留蛋白原始結(jié)構(gòu)特征并提升其穩(wěn)定性；靜磁場輔助浸漬冷凍對肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的提升更加顯著（P＜0.05），具體表現(xiàn)為相對其他處理組更低的濁度和粒徑，以及更高的Zeta電位絕對值和總巰基含量，更加保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，更低的表面疏水性，肌球蛋白重鏈也更多地被保留?？傊鋬鲂↓埼r品質(zhì)受不同冷凍介質(zhì)的影響，靜磁場輔助浸漬冷凍能夠更好地穩(wěn)定其肌原纖維蛋白的功能性質(zhì)。

關(guān)鍵詞：小龍蝦；肌原纖維蛋白；冷凍方式；靜磁場；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；熱穩(wěn)定性

Effects of Freezing Methods on the Properties and Structure of Myofibrillar Proteins from Crayfish （Procambarus clarkii）

LU Yaokun1， LI Qiang1， ZHU Yaqing1， WANG Hongyi1， LIN Lin1，2，3， LU Jianfeng1，2，3，*

（1. College of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230601， China; 2. Anhui Provincial Key Laboratory for Agriculture Products Modern Processing， Hefei University of Technology， Hefei 230601， China;

3. Engineering Research Center of Bio-Process， Ministry of Education， Hefei University of Technology， Hefei 230601， China）

Abstract： In order to study the effect of freezing methods on the quality of crayfish， changes in the properties and structure of crayfish myofibrillar proteins （MPs） after air freezing （AF）， immersion freezing （IF）， static magnetic field-assisted immersion freezing （SMF）， and liquid nitrogen freezing （LNF） were examined. Compared with AF， IF and LNF could enhance the absolute value of the zeta potential of crayfish MPs to different degrees， inhibit the decrease of total sulfhydryl content， and maintain the structural characteristics of the proteins enhancing their stability. SMF improved the stability of MPs more significantly than any other freezing treatment （P lt; 0.05）， as evidenced by lower turbidity and particle size， higher absolute zeta potential and total sulfhydryl content， better maintained structural features， lower surface hydrophobicity， and greater retention of the myosin heavy chains. In conclusion， the quality of frozen crayfish is affected by different freezing media， and SMF can better stabilize the functional properties of crayfish MPs.

Keywords： crayfish （Procambarus clarkii）; myofibrillar protein; freezing methods; static magnetic field; protein stability; thermal stability

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240220-041

中圖分類號：TS254.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）03-0049-07

引文格式：

盧曜昆， 李強(qiáng)， 朱雅情， 等. 冷凍方式對小龍蝦蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（3）： 49-55. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240220-041. " "http：//www.rlyj.net.cn

LU Yaokun， LI Qiang， ZHU Yaqing， et al. Effects of freezing methods on the properties and structure of myofibrillar proteins from crayfish （Procambarus clarkii）[J]. Meat Research， 2024， 38（3）： 49-55. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-220240220-041. " http：//www.rlyj.net.cn

小龍蝦學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），在中國淡水蝦類的生產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位。2022年中國小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量為289.07萬 t，相較于2021年的

263.36萬 t增長9.76%[1]。隨著產(chǎn)量的提升，隨之而來的是貯運(yùn)難題。小龍蝦捕撈后不易存活，死亡后的小龍蝦在微生物和酶的作用下，組織腐敗加快，品質(zhì)迅速下降，影響食用口感[2]。因此，凍藏成為水產(chǎn)品保鮮的常用方法[3]，

但常規(guī)空氣凍結(jié)過程中形成的大冰晶會對肌肉組織造成物理損傷，這也對蝦肉品質(zhì)造成不利的影響[4]。冰晶形態(tài)與分布主要受冷凍速率的影響，浸漬冷凍相較于傳統(tǒng)的空氣冷凍是一種更快速的冷凍方式，主要依賴?yán)鋬鼋橘|(zhì)（如乙醇和鹽水）與食品表面之間熱量的快速交換，這有助于在蝦肉冷凍過程中形成體積更小、分布更加均勻的冰晶[5-6]。隨著液氮技術(shù)的發(fā)展，液氮凍結(jié)成本下降，液氮冷凍也更多地被用于水產(chǎn)品的凍結(jié)貯藏[7]。為了提高冷凍效率、減少食品冷凍過程中大冰晶形成，改善食品品質(zhì)，各種新型的物理輔助冷凍加工技術(shù)也相繼出現(xiàn)，例如高壓、超聲波、微波及靜電場等[8]。然而，這些方法對食品本身及所需設(shè)備都有一定要求，應(yīng)用方面存在一定的局限性[9]。

磁場技術(shù)作為一種相對環(huán)保的技術(shù)，近年來受到越來越多的關(guān)注，在各領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛[10-12]。研究表明，磁場會影響水的微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其宏觀性質(zhì)[13]；在脈沖電場存在下，靜磁場能夠使0.9 g/100 mL NaCl溶液相變時(shí)間縮短，冰晶形態(tài)更加均勻[14]?，F(xiàn)如今磁場在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用正逐漸走進(jìn)人們的視野。例如，在豬肉[15]、鯰魚[16]、牛肉[17]等食品冷凍或保鮮過程中添加靜磁場輔助均能提高其冷凍速率，縮短凍結(jié)時(shí)間，在節(jié)能的同時(shí)也能改善其冷凍后的品質(zhì)。相較于變磁場，靜磁場降低了線圈工作時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)對食品的影響，且需要的能量更少[15]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已探究了不同類型磁場輔助冷凍對斑點(diǎn)叉尾鮰魚肉蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響[18]。在此基礎(chǔ)上，本研究主要以小龍蝦為研究對象，進(jìn)一步比較一定強(qiáng)度的靜磁場輔助浸漬冷凍（static magnetic field-assisted immersionfreezing，SMF）與其他3 種常規(guī)冷凍（空氣冷凍（air freezing，AF）、浸漬冷凍（immersion freezing，IF）及液氮浸漬冷凍（liquid nitrogen freezing，LNF））對小龍蝦蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，驗(yàn)證磁場輔助冷凍對小龍蝦肉品質(zhì)的改善作用，為磁場輔助冷凍在水產(chǎn)品冷凍貯藏中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究使用的所有新鮮小龍蝦（體質(zhì)量（30.00±5.00）g）均購自安徽合肥大潤發(fā)超市。?；钸\(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后超聲清洗20 min，剔除死蝦后，將剩余的蝦冰凍猝死，去除蝦頭和蝦線，清洗后隨機(jī)分成4 組，用聚乙烯袋包裝，然后放入4 ℃冰箱中，

24 h內(nèi)使用。

無水乙醇、氯化鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）、考馬斯亮藍(lán)G250

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品

（5 mol/L）、雙縮脲法蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒、總巰基含量檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；HEPES體系預(yù)制膠C621104、5×上樣緩沖液（含少量二硫蘇糖醇） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CH-Hall一維交直流磁場發(fā)生系統(tǒng) 北京翠海佳誠磁電科技有限公司；TMS8005-8R25浸入式高低溫恒溫循環(huán)槽

浙江丹府環(huán)境科技有限公司；PZ1000多路溫度記錄儀

佛山華知科電子科技有限公司；YC-260L低溫冷凍柜

安徽中科都菱有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀

英國Malvern公司；Epoch全波長酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermoelectric Group公司；F-7100熒光光譜儀 日本日立公司；DSCQ2000差示掃描量熱儀 美國TA公司；PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；3500凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；T8均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品冷凍處理

將4 組小龍蝦分別采用－25 ℃冰柜進(jìn)行AF；使用圖1設(shè)備進(jìn)行SMF（4 mT、－25 ℃）；不添加磁場直接進(jìn)行－25 ℃ IF；以及LNF。當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到－18 ℃時(shí)，冷凍過程結(jié)束，然后將所有小龍蝦轉(zhuǎn)移到冰箱（（－18.0±0.5） ℃）中保存，待測。分析前，將冷凍小龍蝦在4 ℃冰箱中解凍6 h。

1.3.2 小龍蝦肌原纖維蛋白的提取

參考桑燕菲等[19]的方法并略作修改。取5 g小龍蝦肉剁碎，與20 mL溶液I（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L

MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）混合，10 000 r/min勻漿25 s后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取沉淀再重復(fù)上述操作2 次得粗蛋白。將所得粗蛋白加入20 mL溶液II（0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0），10 000 r/min勻漿25 s后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取沉淀再加入溶液II重復(fù)上述操作2 次。再用適量溶液III（0.6 mol/L

NaCl、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）溶解蛋白，用紗布過濾除雜，濾液即為肌原纖維蛋白溶液。采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，以5 mol/L牛血清蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，48 h內(nèi)用完。

1.3.3 濁度測定

參考嚴(yán)紅波等[20]的方法并略作修改。將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度用適量溶液III調(diào)至1 mg/mL，混勻后靜置20 min，以溶液III作為空白，于340 nm波長處測定吸光度表示濁度。

1.3.4 粒徑和Zeta電位測定

參照Liu Ru等[21]的方法測定蛋白粒徑，吸取1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液800 μL緩慢注入比色皿中，在25 ℃下用633 nm激光照射測定肌原纖維蛋白顆粒粒徑，并用平均直徑來表征。將肌原纖維蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL，取800 μL注入到U型毛細(xì)管樣品池中，25 ℃平衡120 s，測定Zeta電位值。每組樣品至少重復(fù)測定3 次。

1.3.5 總巰基含量測定

稱取約0.1 g蝦肉，加入1 mL試劑盒內(nèi)蛋白提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，采用試劑盒給定方法測定。

1.3.6 紅外光譜測定

將小龍蝦肉凍干后碾成粉末，使用紅外光譜儀進(jìn)行掃描。參數(shù)設(shè)置如下：掃描范圍4 000～650 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描4 次。使用Peak Fit 4.12軟件（美國Systat Software公司）對紅外光譜圖進(jìn)行去卷積、曲線擬合及二階求導(dǎo)，最后通過分析酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）計(jì)算二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Chelh等[22]的方法測定肌原纖維蛋白的表面疏水性。將1 mL肌原纖維蛋白溶液（5 mg/mL）與200 μL BPB溶液（1 mg/mL）混合，以20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）作為空白組，室溫振蕩10 min，然后

4 000 r/min離心15 min。在595 nm波長處測定上清液的10 倍稀釋液的吸光度（A）。表面疏水性用BPB結(jié)合量表示，按下式計(jì)算：

1.3.8 熒光光譜與紫外吸收光譜測定

熒光光譜檢測：參考Li Fangfei等[23]的方法并略作修改。將激發(fā)波長設(shè)定為295 nm，發(fā)射光譜波長范圍300～450 nm，狹縫寬度固定為10 nm，測定0.1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液的熒光光譜。

紫外吸收光譜檢測：將肌原纖維蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，以溶液III作為對照，掃描波長190～700 nm。

1.3.9 熱穩(wěn)定性測定

使用差示掃描量熱法對樣品蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行評估。精確稱量15 mg解凍樣品，置于鋁盤中，壓蓋密封，升溫速率設(shè)置為5 ℃/min，從20 ℃升溫至90 ℃，以空坩堝作為參比，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析

參考江楊陽[24]的方法并略作修改。將1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液與還原型上樣緩沖液（含DTT）按照4∶1（V/V）混合，于沸水中加熱10 min，蛋白上樣量為10 μL，使用4%～15% HEPES體系預(yù)制膠，濃縮膠和分離膠電壓分別為100、120 V。電泳完成后對膠片進(jìn)行染色30 min并脫色過夜，最后在凝膠成像儀上掃描成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均最少重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 22.0軟件（美國IBM公司）進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的濁度

濁度反映蛋白質(zhì)的聚集程度[25]。由圖2可知，AF組的濁度顯著高于其他各組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)锳F速率慢，形成的冰晶大而不規(guī)則，肌原纖維蛋白變性嚴(yán)重，導(dǎo)致內(nèi)部基團(tuán)外露形成聚集，使?jié)岫仍黾覽26]。

相較于IF組，SMF組濁度顯著降低（P＜0.05），這表明溶液中蛋白質(zhì)分散較為均勻，穩(wěn)定性較好，說明SMF處理能夠抑制蛋白質(zhì)氧化，減少聚集的形成。

小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖3～6同。

2.2 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的粒徑和Zeta電位

蛋白質(zhì)粒徑與其功能特性密切相關(guān)，蛋白質(zhì)平均粒徑越大，表明蛋白質(zhì)不易分散，溶液穩(wěn)定性降低[27]。

如圖3A所示，AF組肌原纖維蛋白粒徑最大，這可能是因?yàn)槁倮鋬鲈斐杉≡w維蛋白嚴(yán)重變性，內(nèi)部基團(tuán)外露發(fā)生聚集，從而形成較大粒徑的蛋白聚集體[28]。相較于AF組，IF組粒徑顯著減?。≒＜0.05），隨著冷凍速率的提高，肌原纖維蛋白被破壞的程度更低。在磁場處理后，肌原纖維蛋白聚集和氧化變性程度較小，粒徑達(dá)到最小值，這可能是因?yàn)榧≡w維蛋白表面絕對電荷增加增強(qiáng)了蛋白分子間的靜電排斥力，有助于減小蛋白粒徑，提高溶液的穩(wěn)定性[29]。

Zeta電位反映蛋白質(zhì)系統(tǒng)膠體的穩(wěn)定性[30]。如圖3B所示，經(jīng)磁場處理后肌原纖維蛋白溶液的Zeta電位絕對值顯著高于其他處理組（P＜0.05），說明蛋白顆粒表面所帶電荷越多，蛋白分子之間的靜電斥力增強(qiáng)，溶液中蛋白體系越穩(wěn)定，有利于維持蛋白整體構(gòu)象。AF組由于凍結(jié)速率過慢而產(chǎn)生的大冰晶對蛋白結(jié)構(gòu)的破壞更加嚴(yán)重，蛋白易聚集，因而表現(xiàn)出最低的Zeta電位絕對值，而LNF組與AF組、IF組之間并無顯著性差異，這可能是因?yàn)橐旱幚砗笈c貯藏溫度形成了較大溫差，此時(shí)蝦肉表面溫度迅速上升，與中心溫度形成溫度階梯，蝦肉內(nèi)外膨脹和收縮速率不一致，造成細(xì)肌絲斷裂，更嚴(yán)重破壞了肌肉纖維，促進(jìn)肌原纖維蛋白的聚集并降低表面的相同電荷數(shù)，因而Zeta電位絕對值較低[31]且表現(xiàn)出與AF組、IF組相似的Zeta電位值。

2.3 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的總巰基含量

總巰基含量包含活性巰基與非活性巰基，能反映蛋白質(zhì)氧化程度[32]。如圖4所示，SMF組總巰基含量為4.04 μmol/g，顯著高于其他各組（P＜0.05），這可能是因?yàn)榇艌瞿苡行Эs短冷凍時(shí)間并形成較小的冰晶，對肌肉組織細(xì)胞及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的損害較小，抑制氧化酶的釋放和活性氧的形成，通過減緩巰基氧化速率降低肌原纖維蛋白的氧化程度[33]。而AF組總巰基含量最低，這是因?yàn)槁倮鋬霎a(chǎn)生的不規(guī)則大冰晶對肌原纖維蛋白造成更大的物理損傷，空間結(jié)構(gòu)因此發(fā)生改變，巰基氧化導(dǎo)致形成二硫鍵等。

2.4 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量

如圖5A所示，1 600～1 700 cm－1范圍內(nèi)的譜帶為酰胺I帶，能夠反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對含量。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)包含β-折疊（1 600～1 639 cm－1）、無規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm－1）、α-螺旋（1 651～1 660 cm－1）及β-轉(zhuǎn)角（1 661～1 700 cm－1）。其中，α-螺旋表現(xiàn)為多肽鏈的—CO和—NH間形成的鏈內(nèi)氫鍵，能夠反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[34]。如圖5B所示，與AF組相比，其他各處理組α-螺旋相對含量顯著提高（P＜0.05），其中SMF組α-螺旋相對含量最高，為26.58%，這說明磁場處理能夠減少冷凍過程中肌原纖維蛋白受到的物理損傷，更好地維持蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的松散性，而AF組的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量顯著高于其他各組，說明AF后小龍蝦肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散且不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集。與IF組相比，SMF組β-折疊相對含量顯著降低（P＜0.05），說明磁場處理能夠抑制α-螺旋展開，維持肽鏈內(nèi)部氫鍵的穩(wěn)定[35]，從而抑制α-螺旋結(jié)構(gòu)的解體和轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)蛋白分子間靜電斥力，這與Zeta電位研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，快速冷凍能夠更好保持肌原纖維蛋白的空間排列，維持肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，磁場處理則進(jìn)一步減少了肌原纖維蛋白的損傷及二級結(jié)構(gòu)的變化。

2.5 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

BPB可通過疏水位點(diǎn)與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出的疏水基團(tuán)結(jié)合，因此可通過BPB結(jié)合量判斷蛋白質(zhì)變性程度[36]。如圖6A所示，在4 個(gè)處理組中，AF組BPB結(jié)合量最高，為118.49 μg，顯著高于IF組與SMF組

（P＜0.05），這說明IF及SMF處理均能有效降低小龍蝦肌原纖維蛋白的表面疏水性。與IF組相比，SMF組的表面疏水性顯著降低（P＜0.05），說明磁場處理能夠減少肌原纖維蛋白中疏水性基團(tuán)的暴露，更好地維持肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)榇艌鎏幚韺?dǎo)致水和肌原纖維蛋白分子的重新定向和有序排列[37]。LNF組并沒有表現(xiàn)出較低的表面疏水性，這可能是因?yàn)樾↓埼r肉過于飽滿，在低溫冷凍過程中由于外殼被快速冷凍，內(nèi)部肌肉冷凍缺乏膨脹空間而相互擠壓，最終造成肌肉纖維嚴(yán)重變形以至斷裂，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致蛋白表面疏水性增加[38]。

熒光強(qiáng)度主要來自芳香族氨基酸（主要是色氨酸）殘基側(cè)鏈基團(tuán)所發(fā)射出的熒光，通過測定色氨酸殘基的內(nèi)源熒光圖譜能夠有效反映肌原纖維蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化[39]。由圖6B可知，AF組熒光強(qiáng)度最低，說明緩慢冷凍形成的大而不規(guī)則的冰晶破壞了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致色氨酸向蛋白質(zhì)分子外側(cè)極性環(huán)境移動(dòng)，熒光強(qiáng)度降低。而SMF與LNF組熒光強(qiáng)度明顯高于其他2 組，說明磁場和液氮處理能夠抑制肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)的展開，這可能是因?yàn)镾MF及LNF均有助于形成較小的冰晶，從而減輕蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)受到的物理損傷，減少疏水基團(tuán)的暴露，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[40]。

芳香族氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)能夠吸收紫外光產(chǎn)生相應(yīng)譜圖[41]。如圖6C所示，在275 nm附近不同處理組均出現(xiàn)特征峰，說明不同冷凍方式并未改變酪氨酸的微環(huán)境。SMF與LNF組的吸收強(qiáng)度差異并不顯著，AF及IF組紫外吸收強(qiáng)度均有所下降，這可能是因?yàn)槠涞鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集，從而包裹暴露在外的顯色氨基酸基團(tuán)，促使紫外吸收強(qiáng)度降低[42]。而磁場處理則能維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，提升蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，減少聚集的發(fā)生，這與紅外光譜結(jié)果相似。

綜合蛋白質(zhì)表面疏水性、熒光光譜及紫外光譜可知，磁場處理能夠更好地維持冷凍過程中肌原纖維蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2.6 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性分析

最大轉(zhuǎn)變溫度（Tmax）和變性焓（ΔH）是評價(jià)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。Tmax和ΔH的值越高，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好[43]。Tmax1、ΔH1以及Tmax2、ΔH2分別為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的Tmax和ΔH。如表1所示，經(jīng)SMF處理后冷凍樣品的Tmax1和Tmax2分別為47.20、66.99 ℃，顯著高于其他處理組，說明磁場處理可以顯著提高肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的熱轉(zhuǎn)變溫度（P＜0.05）。IF和SMF組的ΔH1和ΔH2相較于AF組均顯著提升（P＜0.05），這表明IF和SMF的小龍蝦肌原纖維蛋白變性需要的能量更多。相較于IF，SMF處理后小龍蝦肌球蛋白具有更高的ΔH，這說明磁場處理有利于維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，提升凍結(jié)過程中肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)榇艌鎏幚頃狗肿觾?nèi)氫鍵受到影響，水團(tuán)破碎，自由水簇減小，增加非凍結(jié)合水含量[44]。

2.7 不同冷凍處理小龍蝦肌原纖維蛋白的SDS-PAGE結(jié)果分析

如圖7所示，小龍蝦肌原纖維蛋白主要以肌球蛋白重鏈（約245 kDa）、肌動(dòng)蛋白（約48 kDa）及肌球蛋白輕鏈（約20 kDa）為主要條帶。不同處理組肌原纖維蛋白條帶種類基本一致，說明肌原纖維蛋白的一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵沒有被破壞[45]，本研究中不同冷凍處理并不會改變樣品中蛋白的種類。從蛋白條帶強(qiáng)度上看，肌動(dòng)蛋白及肌球蛋白輕鏈并無明顯區(qū)別，說明不同冷凍處理對小龍蝦肌原纖維蛋白的影響主要體現(xiàn)在對肌球蛋白重鏈的影響。而經(jīng)SMF處理的樣品肌球蛋白重鏈強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，由于蛋白質(zhì)總量一定，說明磁場處理能夠有效防止冷凍過程中降解或聚集。而蛋白質(zhì)氧化會造成肌原纖維蛋白的降解[46]，這與總巰基含量的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

研究冷凍方式對小龍蝦蛋白性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)SMF能夠減少冷凍過程中蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，維持蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。相較于AF與LNF，IF能夠顯著減小肌原纖維蛋白粒徑（P＜0.05），降低蛋白分子的表面疏水性，增強(qiáng)分子間的靜電斥力，抑制蛋白分子聚集。與IF相比，SMF處理后肌原纖維蛋白濁度顯著下降（P＜0.05），且具有最高的總巰基含量，說明SMF能夠減少冷凍過程中蛋白損傷，抑制其氧化、變性和聚集。另外，紅外光譜、熒光光譜及紫外吸收光譜結(jié)果表明，SMF處理能夠抑制α-螺旋的展開和蛋白內(nèi)部基團(tuán)的暴露，維持良好的蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)。差示掃描量熱分析和SDS-PAGE結(jié)果也表明，相較于其他3 種冷凍方式，SMF能夠抑制肌球蛋白的降解，維持其良好的熱穩(wěn)定性，更有利于保持冷凍過程中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的完整性。

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