摘 要：針對黑切（dark cutting，DC）牛肉微生物腐敗嚴(yán)重的問題，研究DC牛肉在冷卻（4 ℃）和冰溫（－1.5 ℃）母袋包裝（mother-packaging，MP；80% CO2 MP（80% CO2/20% N2）、40% CO2 MP（40% CO2/60% N2）、真空包裝（vacuum packaging，VP）貯藏及其后續(xù)4 ℃高氧氣調(diào)包裝（high-oxygen modified atmosphere packaging，HiOx-MAP；60% O2/40% CO2）展示期間的感官品質(zhì)、微生物生長、揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）變化規(guī)律。結(jié)果表明：相較于VP貯藏，40%和80% CO2 MP結(jié)合冰溫貯藏均可顯著抑制微生物的生長并降低己醛和1-辛烯-3-醇等VOCs含量，維持較好的氣味新鮮度；高濃度CO2母袋包裝貯藏的抑菌效果更強(qiáng)，并顯著降低了HiOx-MAP展示期間DC牛排的3-甲基-1-丁醇含量，促進(jìn)雙乙酰、己醛等VOCs的生成；盡管高濃度CO2包裝貯藏會產(chǎn)生異味，但打開包裝15 min后異味快速消散，并未對新鮮度造成不良影響；貯藏期間CO2濃度和VP均會影響微生物菌群動態(tài)變化，但肉食桿菌經(jīng)HiOx-MAP展示后最終成為各包裝的優(yōu)勢菌；DC牛排貯藏和展示期間，肉食桿菌、沙雷氏菌及明串珠菌的生長可能是造成DC牛排異味產(chǎn)生的主要原因。本研究推薦使用80% CO2 MP冰溫貯藏結(jié)合高氧包裝展示延長DC牛肉貨架期，抑制牛肉因微生物生長導(dǎo)致的腐敗異味。

關(guān)鍵詞：黑切牛排；二氧化碳；冰溫貯藏；氣調(diào)包裝；微生物群落；揮發(fā)性有機(jī)化合物

Analysis of Microbial Community and Volatile Organic Compounds in Dark-Cutting Beef during Storage in

Oxygen-Free Atmosphere at Different Temperatures and Subsequent Display in High-Oxygen

Modified Atmosphere Packaging

RONG Ge， LIU Zhiyu， YANG Jun， ZHANG Yimin， MAO Yanwei， LIANG Rongrong*， YANG Xiaoyin*

（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai’an 271018， China）

Abstract： To address the problem of serious microbial spoilage of dark-cutting （DC） beef， this study investigated the changes in the sensory quality， microbial growth， and volatile organic compounds （VOCs） contents of DC beef during storage under mother packaging （MP） consisting of 80% CO2 and 20% N2 or 40% CO2 and 60% N2， or vacuum packaging （VP） at chilled （4 ℃） or superchilled （–1.5 ℃） temperature and subsequent display under high-oxygen modified atmosphere packaging （HiOx-MAP） consisting of 60% O2 and 40% CO2 at 4 ℃. The results showed that during superchilled storage， MP significantly inhibited bacterial growth， reduced the contents of certain VOCs （such as hexanal and 1-octen-3-ol）， and thus maintained better odor freshness compared to VP; MP with 80% CO2 concentration showed higher antibacterial effect， and it significantly reduced the concentration of 3-methyl-1-butanol in displayed DC beef steaks while promoting the formation of some VOCs such as diacetyl and hexanal. After storage under high-CO2 MP， an off-odor was formed， but it disappeared at 15 min after opening the packaging， which did not cause any adverse effects on the freshness. Both CO2 concentration and VP affected the change of the microbial community during storage. For all packaging treatments， Carnobacterium was the dominant bacteria after display under HiOx-MAP. The growth of Carnobacterium， Serratia and Leuconostoc may be the main cause of off-odor development in DC steaks throughout the storage and display periods. This study recommends the use of storage with 80% CO2 MP at superchilled temperature and subsequent display under HiOx-MAP to extend the shelf-life of DC beef and inhibit spoilage odor due to microbial growth.

Keywords： dark-cutting beef steaks; carbon dioxide; superchilled storage; modified atmosphere packaging; microbiota; volatile organic compounds

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240304-051

中圖分類號：TS206.6 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）03-0039-10

引文格式：

榮鴿， 劉智宇， 楊君， 等. 氣調(diào)轉(zhuǎn)換包裝黑切牛肉不同溫度貯藏與展示期間的微生物氣味分析[J]. 肉類研究， 2024， 38（3）： 39-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240304-051. " "http：//www.rlyj.net.cn

RONG Ge， LIU Zhiyu， YANG Jun， et al. Analysis of microbial community and volatile organic compounds in dark-cutting beef during storage in oxygen-free atmosphere at different temperatures and subsequent display in high-oxygen modified atmosphere packaging[J]. Meat Research， 2024， 38（3）： 39-48. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240304-051. " "http：//www.rlyj.net.cn

黑切（dark cutting，DC）牛肉主要由肉牛宰前應(yīng)激導(dǎo)致牛肉高極限pH值（pHu≥6.1）引發(fā)，其典型特征為肉色發(fā)暗、質(zhì)地堅硬和表面干燥[1-2]。我國DC牛肉平均發(fā)生率高達(dá)10.07%，西北地區(qū)和中原地區(qū)發(fā)生率較高，分別為17.70%和23.61%，顯著高于東北地區(qū)（4.89%）[3]。

牛肉的冰點(diǎn)溫度為－1.4～－1.7 ℃[4]。真空包裝（vacuum packaging，VP）冷藏現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于冷鮮牛肉的長期運(yùn)輸與貯藏過程，然而冷卻VP DC牛肉的貨架期僅有14 d，并會快速出現(xiàn)硫代肌紅蛋白綠變現(xiàn)象[5]。CO2作為一種高效的綠色抑菌氣體可有效抑制腐敗菌的生長[6]，

而且高濃度CO2處理后的肉類即便在打開包裝后仍具有長時效的遺留抑菌效果[7]。母袋包裝是一種將大塊生鮮肉或其小塊分切肉放置在提前充入特定預(yù)混氣的高阻隔性包裝袋內(nèi)并進(jìn)行密封的包裝方式，該包裝方式主要用于牛肉的長期貯運(yùn)過程，具有裝貨量大、成本低的優(yōu)勢，但不適用于牛肉的貨架零售展示。母袋包裝肉運(yùn)輸?shù)缴坛螅ǔM(jìn)行二次包裝（如氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP））后再進(jìn)入貨架展示環(huán)節(jié)。母袋包裝與MAP本質(zhì)相似，都是借助改變?nèi)忸愔車鷼怏w環(huán)境達(dá)到保鮮目的，但二者的流通環(huán)節(jié)不同。氣調(diào)轉(zhuǎn)換包裝是指牛肉在長期貯藏或長途運(yùn)輸過程中采用無氧包裝，后續(xù)貨架展示期間配合使用高氧MAP（high-oxygen MAP，HiOx-MAP）賦予牛肉鮮紅肉色的一系列配套包裝方式。氣體成分的改變可能會干預(yù)微生物群落演替而影響牛肉的最終貨架期。當(dāng)前，冰溫貯藏（－3～－1 ℃）已被證明可以顯著延長真空包裝牛肉的貨架期[8]，而且CO2在肉中的溶解能力隨溫度降低而增強(qiáng)[9]，高濃度CO2-MAP（60%或70%）結(jié)合冰溫貯藏可以減少揮發(fā)性鹽基氮及揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生[10]。趙菲等[11]研究發(fā)現(xiàn)，－1 ℃結(jié)合75% O2＋25% CO2包裝可以使羊肉有效保鮮42 d。因此能否借助冰溫和高濃度CO2的協(xié)同作用進(jìn)一步延長牛肉貯藏和展示期間的貨架期值得深入研究。

腐敗異味是消費(fèi)者評判牛肉腐敗程度的一個重要感官指標(biāo)，主要由微生物生長代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）造成，了解貯藏牛肉的VOCs變化規(guī)律有助于理解牛肉腐敗異味的形成過程[12]。與肉類腐敗變質(zhì)有關(guān)的常見VOCs主要是醇類、醛類、酮類、酸類、酯類及含硫化合物等[13]。某些微生物在特定氣體成分下會逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，成為導(dǎo)致肉類腐敗的特定腐敗微生物[14]。不同種類微生物在不同包裝和貯藏條件下會展現(xiàn)出較大差異的腐敗潛力和代謝特征，進(jìn)而產(chǎn)生不同VOCs，加劇不愉快異味。例如，透氧托盤包裝肉中的假單胞菌和熱殺環(huán)絲菌是3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇等醇類VOCs的主要產(chǎn)生細(xì)菌[15]；真空包裝肉中的腸桿菌、肉食桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌是硫化物和有機(jī)酸等惡臭和酸敗味VOCs的主要產(chǎn)生細(xì)菌[16]，而高氧包裝肉中的熱殺環(huán)絲菌則是乙偶姻、雙乙酰等黃油味VOCs的主要產(chǎn)生細(xì)菌[17]。因此探究特定包裝環(huán)境下的菌群演替及其VOCs變化對監(jiān)測肉類腐敗進(jìn)程和探究肉中腐敗氣味來源具有重要意義，然而上述高濃度CO2無氧包裝向HiOx-MAP轉(zhuǎn)化過程中的牛肉氣味演變目前相關(guān)報道還很少。

本實驗探究冷卻和冰溫貯藏中高濃度CO2無氧包裝向后續(xù)HiOx-MAP轉(zhuǎn)換過程中的微生物群落和VOCs動態(tài)變化及二者間的關(guān)系，旨在開發(fā)可以用于改善DC牛肉感官特性的氣調(diào)轉(zhuǎn)換包裝方式，本研究有望為研究氣調(diào)轉(zhuǎn)換包裝牛肉的腐敗代謝和預(yù)測其新鮮度提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、蛋白胨 " 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；4-甲基-1-戊醇 上海源葉生物科技有限公司；ShannuoTM DNA提取試劑盒 天津佳美科技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

包裝材料：高阻隔收縮袋（SP21，O2透過率（23 ℃）：20 mL/（m2·24 h），水蒸氣透過率（38 ℃）：5 g/（m2·24 h））、PP托盤（TQBC-0775，O2透過率（23 ℃/相對濕度0%）：10 mL/（m2·24 h），水蒸氣透過率（38 ℃/相對濕度90%）：15 g/（m2·24 h））、DLS-25吸水墊、Lid1050密封阻隔膜（O2透過率（23 ℃/相對濕度0%）：25 mL/（m2·24 h），水蒸氣透過率（4 ℃/相對濕度100%）：10 g/（m2·24 h）） 希悅爾包裝（上海）有限公司。

DZQ-600L臺式外抽真空（充氣）包裝機(jī) 浙江佑天元包裝機(jī)械制造有限公司；DT-6D氣調(diào)包裝機(jī) 中國大江機(jī)械設(shè)備有限公司；BagMixer?400拍打器 法國英特塞恩斯有限公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 " 日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭 美國Supelco公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

隨機(jī)選取6 頭西門塔爾雜交牛左右兩側(cè)的背最長肌腰段（pH≈6.4），真空包裝后0～4 ℃條件下運(yùn)回實驗室。在實驗室中將腰背最長肌分切為2.54 cm牛排，并將每塊牛排各自裝入托盤后，每2 塊牛排放入一個母袋中，隨機(jī)進(jìn)行高濃度CO2母袋包裝（H：80% CO2/20% N2，80% CO2 MP）、低濃度CO2母袋包裝（L：40% CO2/60% N2，40% CO2 MP）和VP（V：對照組），將包裝好的牛排分別在4 ℃（C：冷卻）和－1.5 ℃（S：冰溫）下貯藏（n＝6）。檢測未包裝前牛排的菌落總數(shù)、微生物多樣性、VOCs和感官指標(biāo)作為初始數(shù)據(jù)，并在貯藏14、21 d分別取出其中一塊牛排測定上述指標(biāo)；取出另一塊牛排再進(jìn)行HiOx-MAP（O：60% O2/40% CO2，60% O2 MAP），在4 ℃條件下貨架展示14 d后，打開包裝，測定牛排的上述指標(biāo)。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定

參照Yang Xiaoyin等[18]的方法使用PCA培養(yǎng)基計數(shù)測定菌落總數(shù)。

1.3.3 感官評價

參照Chen Xue等[19]的方法稍作修改，在每個貯藏和貨架展示時間點(diǎn)使用100 mm線標(biāo)尺由10 名經(jīng)實驗室培訓(xùn)的小組成員（5男5女）對不同包裝牛排進(jìn)行感官評分，牛排感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.3.4 VOCs的測定

根據(jù)Yang Jun等[17]的方法，采用頂空固相微萃取法萃取DC牛排中的VOCs，并使用GC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。根據(jù)NIST11和NIST11s數(shù)據(jù)庫對測定的VOCs進(jìn)行定性，使用內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)為4-甲基-1-戊醇，在頂空瓶中的終含量為2 000 μg/kg）對鑒定的VOCs進(jìn)行定量。

GC-MS測定條件：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm），質(zhì)譜源和四極桿溫度分別為230 ℃和150 ℃，柱箱溫度在40 ℃保持5 min后，4 ℃/min升溫至150 ℃，然后30 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min，電子能量設(shè)置為70 eV，掃描范圍為29～350 m/z。

1.3.5 微生物多樣性分析

從不同包裝的DC牛排中提取貯藏和展示過程中的細(xì)菌基因組總DNA，DNA提取操作及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增程序如Yang Jun等[20]描述。測序后，以97%的相似度將DNA測序數(shù)據(jù)聚類成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）并篩選出代表序列，通過SILVA數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進(jìn)行對比，在分類學(xué)上劃分OTU。

1.4 數(shù)據(jù)處理

菌落數(shù)和VOCs采用SAS（9.0，美國SAS軟件研究所）混合模型進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為

P＜0.05。在第1部分貯藏實驗中，母袋包裝類型、貯藏溫度、貯藏時間及其交互作用作為固定效應(yīng)，牛個體作為隨機(jī)效應(yīng)。在第2部分展示實驗中，母袋包裝類型、貯藏溫度、貯藏時間、展示時間及其交互作用作為固定效應(yīng)，牛個體作為隨機(jī)效應(yīng)。應(yīng)用Origin 2018軟件（美國OriginLab公司）作圖。利用SIMCA 14.1軟件（德國Sartorius公司）通過正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）研究感官特征與VOCs含量之間的關(guān)系。以貯藏期間的VOCs含量為因變量，以O(shè)TU為自變量，采用SPSS 18.0軟件（美國IBM公司）利用逐步多元線性回歸分析豐度排名前10的OTU與VOCs之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏和展示期間不同母袋包裝類型和貯藏溫度對DC牛排菌落總數(shù)的影響

貯藏過程中，母袋包裝類型、貯藏時間和貯藏溫度的交互作用對DC牛排菌落總數(shù)影響顯著（圖1a，

P＜0.05）。除冰溫貯藏14 d外，冰溫或冷卻貯藏期間的充CO2無氧包裝DC牛排的菌落總數(shù)顯著低于VP牛排，且80% CO2 MP牛排菌落總數(shù)始終低于40% CO2 MP牛排，這表明隨著CO2濃度的升高，其抑菌效果逐漸增強(qiáng)。在冷卻或冰溫貯藏21 d后，3 種包裝牛肉的菌落總數(shù)均未超過微生物的腐敗限值（7（lg（CFU/g）））[21]。

80% CO2 MP的牛排冷卻貯藏至21 d菌落總數(shù)為3.25（lg（CFU/g）），40% CO2 MP牛排為4.95（lg（CFU/g）），VP牛排為6.63（lg（CFU/g）），但3 種包裝牛排冰溫貯藏21 d的菌落總數(shù)顯著低于其在冷卻貯藏21 d的菌落總數(shù)。在21 d冰溫貯藏期間，80% CO2 MP和40% CO2 MP牛排的菌落總數(shù)與初始值相比并沒有顯著變化，意味著冰溫結(jié)合高濃度CO2無氧包裝具有優(yōu)越的協(xié)同抑菌效果。

展示過程中，母袋包裝類型、貯藏溫度和展示時間的交互作用對牛排菌落總數(shù)的影響顯著（圖1b）；此外，貯藏時間、貯藏溫度和展示時間的交互作用也對牛排菌落總數(shù)影響顯著（圖1c，P＜0.05）。隨貨架展示時間延長，前期不同溫度貯藏的各種包裝牛排的菌落總數(shù)均顯著升高（圖1b）。冰溫貯藏顯著降低了后續(xù)展示期間牛排的細(xì)菌生長速率（圖1b、c）。冰溫貯藏14 d后展示14 d的菌落總數(shù)顯著低于冰溫貯藏21 d后展示14 d的菌落總數(shù)（圖1c）。無論前期采用哪種母袋包裝類型，牛排經(jīng)冰溫貯藏后再HiOx-MAP貨架展示14 d，其菌落總數(shù)顯著低于前期冷卻貯藏后HiOx-MAP展示的牛排，且均未達(dá)到7（lg（CFU/g））

的腐敗閾值，只有3 種包裝配合冷卻貯藏的牛排在貨架展示14 d后超過7（lg（CFU/g））（圖1b）。相較于其他貯藏包裝方式，80% CO2 MP冰溫貯藏牛排展示期間的菌落總數(shù)始終處于最低水平（P＜0.05），展示14 d時牛排菌落總數(shù)僅為5.41（lg（CFU/g））。

VP冷卻牛排在貨架展示14 d后菌落總數(shù)最高，達(dá)到8.44（lg（CFU/g））。因此，高濃度CO2無氧包裝結(jié)合冰溫貯藏21 d后即便在后期HiOx-MAP展示過程中均能有效將DC牛排的貨架期延長至14 d以上。

2.2 貯藏和展示期間不同母袋包裝類型和貯藏溫度對DC牛排感官品質(zhì)的影響

如圖2a～c所示，貯藏期間，母袋包裝類型與貯藏時間的交互作用對貯藏牛排打開包裝前的肉色、打開包裝后的異味和氣味新鮮度及打開包裝15 min后的肉色和總體印象均影響顯著。3 種包裝牛排的總體印象隨著貯藏時間的延長顯著降低，貯藏14 d和21 d，40% CO2 MP牛排打開包裝前的肉色評分和總體印象顯著優(yōu)于80% CO2 MP和VP牛排（P＜0.05）。80% CO2 MP牛排打開包裝后的異味明顯強(qiáng)于40% CO2 MP和VP牛排，評分為17.10，這可能是由于厭氧乳酸菌在高濃度CO2環(huán)境下增殖，產(chǎn)生一種特殊的CO2異味[22]。打開包裝15 min后，僅貯藏時間這一主效應(yīng)對異味有顯著影響（P＜0.05），且異味隨著貯藏時間的延長而增大，而母袋包裝類型對牛排打開包裝15 min后的異味影響并不顯著，這是因為打開包裝15 min后，高濃度CO2產(chǎn)生的異味大量消散，這也說明80% CO2 MP牛排打開包裝后的氣味新鮮度評分顯著低于CO2包裝牛排，這可能是因為VP冷卻牛排貯藏末期達(dá)到臨界腐敗狀態(tài)，微生物的生長產(chǎn)生了令人不愉快的異味。

如圖2d～f所示，母袋包裝類型、貯藏時間、貯藏溫度和展示時間的交互作用對展示牛排打開包裝前的肉色及打開包裝15 min后的肉色影響顯著（P＜0.05）。HiOx-MAP貨架展示顯著提高了品評小組成員對各貯藏時間點(diǎn)的不同母袋包裝類型和溫度貯藏牛肉展示后肉色的喜愛度，這可能是由于高濃度氧氣使牛肉表面暗紫紅色的脫氧肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為鮮紅色的氧合肌紅蛋白，進(jìn)而吸引消費(fèi)者[23]。各包裝冰溫貯藏21 d后再貨架展示14 d的牛肉打開包裝前的肉色顯著優(yōu)于冷卻貯藏牛肉的展示肉色。80% CO2 MP冷卻貯藏牛排在展示14 d后打開包裝前的肉色顯著優(yōu)于40% CO2 MP和VP冷卻貯藏牛排的后續(xù)展示肉色，評分分別為72.91、68.32、57.58。母袋包裝類型、貯藏時間和展示時間對牛排打開包裝后的異味影響顯著（P＜0.05）。VP貯藏21 d后的牛排隨著貨架展示時間延長，異味顯著增強(qiáng)，評分為15.29；而80% CO2 MP貯藏牛排隨著展示時間延長異味評分均顯著降低。包裝方式、貯藏溫度、貯藏時間和展示時間兩兩交互作用對氣味新鮮度和總體印象影響顯著。貨架展示14 d后，80% CO2 MP牛排的氣味新鮮度均顯著高于40% CO2 MP和VP牛排，這主要得益于CO2對微生物生長和代謝活動的有效抑制作用[24]。上述感官結(jié)果表明，80% CO2 MP冰溫貯藏后采用60% O2 MAP貨架展示可有效改善DC牛排肉色，延緩其腐敗異味的產(chǎn)生，進(jìn)而獲得更高的整體感官接受度。

2.3 貯藏和展示期間不同母袋包裝類型和貯藏溫度對DC牛排VOCs含量的影響

如表2、3所示，在貯藏過程中，共檢測到13 種VOCs，包括醇類、醛類、酮類和己酸乙烯酯。母袋包裝類型、貯藏溫度和貯藏時間的交互作用對大多數(shù)VOCs的含量影響顯著（P＜0.05），分別為醛類（己醛、壬醛）、醇類（1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-己醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-庚醇）、己酸乙烯酯和雙乙酰。與貯藏初期相比，經(jīng)3 種母袋包裝（80% CO2 MP、40% CO2 MP、VP）冰溫和冷卻貯藏21 d后，3-甲基-3-庚醇和雙乙酰含量均顯著增加。貯藏溫度并未對80% CO2 MP組的3-甲基-3-庚醇和雙乙酰含量造成顯著差異；冰溫VP貯藏末期的DC牛排產(chǎn)生的3-甲基-3-庚醇和雙乙酰含量顯著低于冷卻VP貯藏的DC牛排。值得注意的是，40% CO2 MP冰溫貯藏21 d的DC牛排產(chǎn)生的3-甲基-3庚醇、雙乙酰含量高于該母袋包裝下的冷卻貯藏DC牛排。母袋包裝類型和貯藏時間的交互作用對乙偶姻的含量影響顯著，隨著貯藏時間延長，3 種母袋包裝牛排中的乙偶姻含量均顯著增加，且80% CO2 MP、40% CO2 MP組貯藏21 d的乙偶姻含量顯著低于VP組。

雙乙酰和乙偶姻是α-乙酰乳酸代謝途徑的終產(chǎn)物，其通常由乳酸菌（如明串珠菌、魚乳球菌）、熱殺索絲菌等細(xì)菌代謝產(chǎn)生，并會使肉產(chǎn)生黃油、奶酪等異味[25-27]。

除80% CO2 MP母袋包裝冰溫貯藏外，己醛含量在其他母袋包裝貯藏期間顯著增加，并在VP冷卻貯藏21 d時達(dá)到最高值，這可能由沙雷氏菌產(chǎn)生[28]。此外，3-甲基-1-丁醇在80%和40% CO2 MP冰溫貯藏下均未檢出，但在其他包裝中含量顯著增加。與40% CO2 MP和VP冰溫貯藏相比，80% CO2 MP可將DC牛排的壬醛、1-戊醇、1-己醇、1-辛醇、

1-辛烯-3-醇和己酸乙烯酯等VOCs含量顯著降低。以上結(jié)果均表明，CO2母袋包裝貯藏通過抑制細(xì)菌生長降低了VOCs的含量，較高濃度CO2抑制VOCs的能力更強(qiáng)。冰溫與CO2母袋包裝貯藏協(xié)同作用更能抑制VOCs的產(chǎn)生。

如表4、5所示，在展示期間，共檢測到17 種VOCs，其中1-庚醇、2-辛烯-1-醇、1-壬烯-4-醇、2-庚酮和2-辛酮

是DC牛排展示期間特有的VOCs。母袋包裝類型、貯藏時間、貯藏溫度和展示時間的交互作用對雙乙酰、

3-甲基-3-庚醇和1-壬烯-4-醇有顯著影響。除VP外，2 種CO2 MP貯藏牛肉的雙乙酰含量均隨展示時間延長顯著增加。母袋包裝類型、貯藏時間和展示時間的交互作用對己醛和2-辛烯-1-醇含量影響顯著。40% CO2 MP牛排貯藏14 d后展示14 d的己醛含量顯著低于80% CO2 MP和VP處理的樣品。2-辛烯-1-醇在2 種CO2 MP貯藏21 d后再展示14 d的含量顯著高于各自包裝貯藏14 d后展示14 d。母袋包裝類型、貯藏溫度和展示時間的交互作用對壬醛、

3-甲基-1-丁醇有顯著影響。80%和40% CO2 MP冰溫牛排后展示14 d的壬醛含量高于VP冰溫牛排（P＜0.05）。得益于80% CO2 MP較好的抑菌效果，其在展示14 d時具有最低的3-甲基-1-丁醇含量，該物質(zhì)的含量在40% CO2 MP和VP組中依次升高（P＜0.05）。此外，冰溫貯藏也降低了牛排在40% CO2 MP和VP貯藏后展示14 d的3-甲基-1-丁醇含量。這些結(jié)果表明，在前期貯藏期間采用不同的母袋包裝類型和貯藏溫度會影響展示期間DC牛排的VOCs含量。貯藏時間、貯藏溫度和展示時間的交互作用對1-庚醇、1-戊醇和2-庚酮的含量影響顯著。在貯藏14 d或21 d之后，冰溫及冷卻貯藏條件下的1-庚醇、1-戊醇和

2-庚酮含量隨著展示時間的延長而升高。冰溫貯藏21 d后展示14 d牛排的1-庚醇、1-戊醇和2-庚酮含量顯著高于冰溫貯藏14 d后展示14 d的含量。冷卻貯藏21 d后展示14 d的1-戊醇含量高于冷卻貯藏14 d后展示14 d的含量。有研究發(fā)現(xiàn)，2-庚酮和2-辛酮等酮類化合物是牛肉中的芳香化合物或化學(xué)氧化產(chǎn)物[29]。這些物質(zhì)的較高含量可能會使DC牛排感官異味產(chǎn)生差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度和展示時間的交互作用對1-辛烯-3-醇、己酸乙烯酯和2-辛酮的影響顯著，隨著展示時間延長，這3 種物質(zhì)的含量逐漸升高，前期冰溫貯藏促進(jìn)了這3 種物質(zhì)的生成。

2.4 貯藏和展示期間不同母袋包裝類型和貯藏溫度下DC牛排微生物多樣性分析

在貯藏和展示期間總共檢測到19 種細(xì)菌屬，DC牛排初始微生物群落主要由棲熱菌、假單胞菌、乳桿菌和不動桿菌組成（圖3）。這些細(xì)菌大部分來自于屠宰加工環(huán)境，如土壤、水源、屠宰刀具等[30-31]。貯藏期間，CO2 MP組微生物多樣性演變趨勢比VP組更復(fù)雜，這可能是由于VP牛排中優(yōu)勢微生物的快速生長降低了其他細(xì)菌的相對豐度，而CO2憑借其抑菌效果將微生物群落始終維持在類似于初始狀態(tài)的復(fù)雜菌群結(jié)構(gòu)中。在40% CO2 MP冷卻或冰溫貯藏末期，優(yōu)勢細(xì)菌為肉食桿菌，其次是環(huán)絲菌，而冷卻80% CO2 MP牛排在貯藏21 d時沙雷氏菌、嗜冷桿菌、葡萄球菌的相對豐度明顯增加。對于冰溫80% CO2 MP，肉食桿菌也逐漸成為優(yōu)勢細(xì)菌。在整個VP冰溫貯藏期間，肉食桿菌也是最常見的細(xì)菌屬。在VP冷卻貯藏14 d時，肉食桿菌和環(huán)絲菌為主要的細(xì)菌，然而氣單胞菌和沙雷氏菌逐漸成為VP冷卻牛排貯藏末期的優(yōu)勢細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，肉食桿菌、明串珠菌被確定為厭氧環(huán)境下導(dǎo)致牛肉腐敗的主要微生物[32]，肉食桿菌能夠在低溫、高濃度CO2環(huán)境中快速生長，并通過產(chǎn)生有機(jī)酸和細(xì)菌素等來抑制其他細(xì)菌的生長[33]。本研究還發(fā)現(xiàn)，不論何種母袋包裝類型及溫度貯藏的牛排經(jīng)過HiOx-MAP展示之后，肉食桿菌的豐度都占絕對優(yōu)勢。已有研究表明，肉食桿菌可用作生物保護(hù)菌來延長肉類的保質(zhì)期并提高肉類的安全性[34]。因此，肉食桿菌作為母袋包裝貯藏及HiOx-MAP展示期間特定的腐敗微生物菌群，可能有利于延緩DC牛排腐敗進(jìn)程。

圖 3 DC牛排母袋包裝貯藏（a）和高氧包裝展示期間（b）

微生物群落屬水平動態(tài)分析

Fig. 3 Microbial community dynamics at the genus level during MP storage （a） and HiOx-MAP display （b） periods of DC beef steaks

2.5 VOCs與異味的相關(guān)性分析

OPLS-DA（圖4a）展示了DC牛肉母袋包裝貯藏及HiOx-MAP展示期間感官異味特征與VOCs的關(guān)系。貯藏和展示期間的樣品分別位于圖中的左右兩側(cè)，這說明貯藏和展示期間樣品的感官異味特征差異較大。貯藏期間的DC牛排樣品與其異味及氣味新鮮度相關(guān)性較低，因此貯藏期間產(chǎn)生的VOCs并不會導(dǎo)致感官異味。打開包裝15 min后的異味與經(jīng)VP冷卻貯藏后的展示樣品

（OVC 14 d、OVC 21 d）呈正相關(guān)，這與感官評價中異味評分變化一致，均表明VP冷卻貯藏牛排在展示期間會由于微生物大量生長而導(dǎo)致DC牛排產(chǎn)生令人不愉快的異味。

a. OPLS-DA評分圖，橙色、紅色和綠色點(diǎn)分別代表樣品、感官特征和VOCs，VOCs編碼見表2～5；b. VIP評分圖。

圖 4 利用OPLS-DA繪制不同母袋包裝類型和貯藏溫度下DC牛排VOCs與異味的關(guān)系圖

Fig. 4 Orthogonal partial least-squares discrimination analysis

（OPLS-DA） map of the relationship between VOCs and off-odor of DC beef steaks under different packaging types and storage temperatures during storage and display periods

變量投影重要性（variable importance projection，VIP）是反映自變量對因變量解釋能力的重要指標(biāo)，其值越大，說明該自變量對因變量的解釋能力越強(qiáng)，一般

VIP＞1時，自變量在解釋因變量時具有重要性[35]。由圖4b可知，本研究中VIP值大于1的VOCs為1-辛烯-3-醇

（V6，2.39）、1-戊醇（V3，1.58）、己酸乙烯酯（V10，1.24）、2-辛烯-1-醇（V13，1.14）、己醛（V1，1.05）和1-己醇（V4，1.01），表明這6 種VOCs對DC牛排貯藏過程中產(chǎn)生的異味貢獻(xiàn)最為顯著。然而上述6 種VOCs與異味、氣味新鮮度和打開包裝15 min后的異味無關(guān)，并不會賦予牛排持續(xù)的難聞異味，這與本研究的感官評價結(jié)果一致。

2.6 細(xì)菌生長與VOCs的相關(guān)性分析

不同細(xì)菌利用肉中糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的能力不同，進(jìn)而會產(chǎn)生的不同的VOCs[12]。為清晰展示整個貯藏和展示期間不同母袋包裝類型及貯藏溫度中細(xì)菌演替與VOCs變化間的關(guān)系，本研究將貯藏21 d配合展示14 d期間排名前10的OTU與VOCs建立了逐步回歸模型。如表6所示，80% CO2 MP冰溫貯藏經(jīng)高氧展示后的DC牛排中，明串珠菌和腸球菌是導(dǎo)致己醛和己酸乙烯酯產(chǎn)生的主要微生物；1-戊醇和1-己醇由明串珠菌和李斯特菌的生長導(dǎo)致；肉食桿菌的生長則導(dǎo)致雙乙酰的產(chǎn)生；明串珠菌是2-辛烯-1-醇產(chǎn)生的原因。在40% CO2 MP冰溫貯藏經(jīng)高氧展示后的DC牛排中，沙雷氏菌是3-甲基-3-庚醇和雙乙酰產(chǎn)生的主要微生物；明串珠菌和環(huán)絲菌的交互生長導(dǎo)致1-戊醇和1-己醇的產(chǎn)生；明串珠菌是產(chǎn)生1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的主要微生物。對于VP冰溫貯藏后經(jīng)高氧展示的DC牛排，腸球菌是導(dǎo)致1-戊醇和己酸乙烯酯產(chǎn)生的主要原因；環(huán)絲菌和沙雷氏菌的交互生長則可產(chǎn)生己醛，而1-己醇與環(huán)絲菌呈正相關(guān)。

鑒于肉食桿菌是無氧包裝（冰溫和冷卻貯藏）向高氧HiOx-MAP轉(zhuǎn)換過程中的優(yōu)勢細(xì)菌（圖3b），本研究發(fā)現(xiàn)肉食桿菌是80% CO2 MP冷卻貯藏配合高氧展示牛排產(chǎn)生雙乙酰、己酸乙烯酯、1-己醇、1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的主要細(xì)菌。在40% CO2 MP冷卻貯藏后的高氧展示牛排中，肉食桿菌則是產(chǎn)生雙乙酰、己醛和3-甲基-3-庚醇的關(guān)鍵微生物，另外，肉食桿菌和沙雷氏菌的交互生長則導(dǎo)致2-辛烯-1-醇和1-壬烯-4-醇的產(chǎn)生。對于經(jīng)VP冷卻貯藏的高氧展示牛排，沙雷氏菌和肉食桿菌的生長導(dǎo)致己醛和1-辛烯-3-醇的產(chǎn)生[36]，沙雷氏菌和明串珠菌的生長則增加了1-戊醇的含量，腸球菌可促進(jìn)2-辛烯-1-醇的產(chǎn)生。因此，肉食桿菌、沙雷氏菌和明串珠菌的生長可能是造成DC牛排整個貯藏及展示期間異味產(chǎn)生的主要原因。

3 結(jié) 論

相較于CO2母袋包裝和VP冷卻貯藏的DC牛排，經(jīng)CO2母袋包裝與冰溫協(xié)同貯藏的牛排具有更高的氣味新鮮度和肉色評分。其中80% CO2 MP冰溫貯藏更有利于抑制微生物生長和VOCs的產(chǎn)生，進(jìn)而延長DC牛排的貯藏貨架期。HiOx-MAP展示過程中，經(jīng)冰溫VP和CO2母袋包裝貯藏DC牛排的1-辛烯-3-醇等關(guān)鍵VOCs含量顯著低于VP冷卻貯藏后的牛排，賦予牛排更好的氣味新鮮度。使用CO2母袋包裝貯藏DC牛排的微生物多樣性比VP包裝牛排微生物多樣性更復(fù)雜，但在HiOx-MAP展示后肉食桿菌成為各種包裝體系下的優(yōu)勢微生物。DC牛排貯藏與展示期間，肉食桿菌、沙雷氏菌及明串珠菌的交互生長可能是導(dǎo)致DC牛排異味產(chǎn)生的主要微生物。未來可通過代謝組學(xué)對不同包裝條件下特定關(guān)鍵菌群的代謝活動開展進(jìn)一步研究，從而深入了解該菌內(nèi)在代謝通路對氣調(diào)包裝DC牛排產(chǎn)生特定VOCs的作用機(jī)制。

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