摘 要：利用傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測序技術(shù)分析黃羽肉雞打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝屠宰過程中雞胴體表面和預(yù)冷水的微生物污染情況。結(jié)果表明：經(jīng)打毛、凈膛和預(yù)冷后的雞胴體菌落總數(shù)分別為4.82、5.03、4.68（lg（CFU/g）），說明該屠宰工藝未起到較好的減菌效果，宰后胴體微生物污染嚴(yán)重；高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，肉雞屠宰加工過程中的胴體表面和預(yù)冷水的優(yōu)勢腐敗菌在屬水平上為莫拉氏菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、巨大球菌屬、嗜冷桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬等。主成分分析表明，一階、二階預(yù)冷水、預(yù)冷后雞胴體及包裝后雞胴體相距較近，差異性不大，但與打毛雞胴體和凈膛后雞胴體2 組樣品有較大差異，說明預(yù)冷水中的污染菌組成決定了宰后胴體的污染菌種類。本研究說明不同屠宰流程后的黃羽肉雞胴體污染菌的組成與豐度存在差異，需針對不同屠宰流程特性采取對應(yīng)的控制手段保障黃羽肉雞制品的質(zhì)量與安全。

關(guān)鍵詞：高通量測序；黃羽肉雞屠宰；菌落總數(shù)；菌群多樣性；優(yōu)勢菌屬

High-Throughput Sequencing Analysis of Bacterial Diversity during the Slaughter Process of Yellow-Feathered Broilers

XIAO Yapei1，2， WANG Zaitian2， SUN Zhilan2， LIU Fang2，*， WANG Daoying1，2，*

（1. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;

2. Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： This study used traditional culture and high-throughput sequencing techniques to analyze the status of microbial contamination on the surface of chicken carcasses and that of pre-cooled water during the slaughter process of yellow-feathered broilers， including plucking， evisceration， pre-cooling， and packaging. The results demonstrated that the total bacterial count of chicken carcasses after plucking， evisceration， and pre-cooling were 4.82， 5.03， and 4.68 （lg （CFU/g）），

respectively， indicating that the slaughtering process did not achieve good decontamination; instead， there was severe microbial contamination in the carcasses after slaughter. High-throughput sequencing analysis showed that at the genus level， the dominant spoilage bacteria on the surface of broiler carcasses and in pre-cooled water during slaughter and processing were Moraxella， Pseudomonas， Staphylococcus， Lactobacillus， Macrococcus， Psychrobater， and Acinetobacter. Principal component analysis （PCA） showed no significant difference among primary and secondary pre-cooled water， pre-cooled chicken carcasses， and packaged chicken carcasses in terms of bacterial community composition at the genus level， but a significant difference between them and plucked carcasses and eviscerated carcasses. This indicates that the composition of bacteria contaminating pre-cooled water determines that on the slaughtered carcasses. Considering the changes in the composition and abundance of bacteria contaminating yellow-feathered broiler carcasses during the slaughter process， control approaches are needed to ensure the quality and safety of yellow-feathered broiler products.

Keywords： high-throughput sequencing; yellow-feathered broiler slaughter; total bacterial count; bacterial diversity; dominant bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240318-057

中圖分類號(hào)：TS251.55 " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）03-0001-09

引文格式：

肖亞培， 王在天， 孫芝蘭， 等. 基于高通量測序的黃羽肉雞屠宰過程中菌群多樣性分析[J]. 肉類研究， 2024， 38（3）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240318-057. " "http：//www.rlyj.net.cn

XIAO Yapei， WANG Zaitian， SUN Zhilan， et al. High-throughput sequencing-based analysis of bacterial diversity in

yellow-feathered broiler slaughtering process[J]. Meat Research， 2024， 38（3）： 1-9. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240318-057. " "http：//www.rlyj.net.cn

雞肉的營養(yǎng)價(jià)值較高，其含有豐富的蛋白質(zhì)、VC、VE等營養(yǎng)物質(zhì)，且因其能量、脂肪含量、膽固醇含量較低，以及蛋白質(zhì)含量較高等而深受廣大消費(fèi)者喜愛[1-2]。經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，雞肉逐漸成為世界第一大肉類，同時(shí)也是我國第二大肉類[3-4]。2023年我國肉雞產(chǎn)量為1 430萬 t，排名較2022年略有下降，為全球第三，但其產(chǎn)量與2022年持平[5]。目前，我國禽肉消費(fèi)的主要市場是白羽肉雞和黃羽肉雞。較短的生長周期、較高的飼料利用率和先進(jìn)的育種技術(shù)使白羽肉雞產(chǎn)業(yè)成為我國規(guī)?；潭茸畲?、生產(chǎn)力最高、實(shí)力最強(qiáng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)[6-7]。此外，經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展和其他技術(shù)的改進(jìn)，白羽肉雞的屠宰已開始采用自動(dòng)化流水線作業(yè)[8]。我國以活禽交易為主流，黃羽肉雞是其中的傳統(tǒng)雞種，然而隨著城市內(nèi)活禽禁宰等規(guī)定的開展，冷鮮禽肉逐漸成為主要烹飪原料[9]。

然而，以當(dāng)前技術(shù)水平，黃羽肉雞不能像白羽肉雞一樣實(shí)行自動(dòng)化流水線屠宰作業(yè)。黃羽肉雞的屠宰加工主要依賴于人工，特別是凈膛等一些關(guān)鍵工序。

在標(biāo)準(zhǔn)操作條件下，剛屠宰的肉雞深層組織是無菌的，但在隨后的屠宰、切割、運(yùn)輸和消費(fèi)過程中，來自各種污染源的微生物會(huì)不可避免地侵入屠宰體及其各部位，使肉雞胴體表面甚至肌肉組織變質(zhì)[10]。此外，在集中屠宰過程中，進(jìn)行大量屠宰時(shí)，一些屠宰場的環(huán)境很容易導(dǎo)致微生物交叉污染[11]。大部分病原微生物的生長繁殖可以通過低溫冷藏來控制，但許多腐敗微生物為嗜冷菌，可以在冷藏條件下大量生長、繁殖[12]。梁慧等[13]以

冰鮮雞為研究對象，發(fā)現(xiàn)其冷藏過程中的主要腐敗菌為乳酸菌、葡萄球菌、腸桿菌和假單胞菌；賴宏剛等[14]通過對在4 ℃存放的冷鮮雞進(jìn)行菌相分析，得出其主要腐敗菌為假單胞菌和乳酸菌；張莉等[15]發(fā)現(xiàn)，在4 ℃托盤和真空包裝貯藏雞胸肉的特征腐敗菌均為假單胞菌，而25 ℃托盤貯藏的雞胸肉特征腐敗菌則包括腸桿菌、芽孢桿菌、梭菌和腸球菌等。

使用傳統(tǒng)方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異需要在分析前分離和鑒定可培養(yǎng)的微生物，因此無法全面評估微生物群落組成[16]。高通量測序技術(shù)是DNA測序發(fā)展的里程碑式產(chǎn)物[17-19]。由于成本低、通量高、速度快等特點(diǎn)[20]，其可以分析整個(gè)樣本中微生物的種類和相對豐度[21]，全面反映微生物群落組成。黃柳娟等[22]利用高通量測序技術(shù)分析得出冷鮮雞肉產(chǎn)品表面和內(nèi)部組織中細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)及增殖趨勢存在差異；同時(shí)，桂國弘等[23]

通過高通量測序技術(shù)對冷鮮雞冷藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，得出冷鮮雞肉的腐敗變質(zhì)主要由肉雞自身攜帶的微生物在冷藏后期逐漸演替為優(yōu)勢菌群所導(dǎo)致。Wang Ying等[24]結(jié)合傳統(tǒng)依賴培養(yǎng)和高通量測序技術(shù)確定德州燒雞中的腐敗微生物為假交替單胞菌、彎曲乳桿菌、德氏腸球菌和金黃色葡萄球菌等；唐林等[25]

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合高通量測序技術(shù)進(jìn)一步證明豬胴體分割環(huán)節(jié)為關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)。關(guān)于肉雞在包裝、貯藏等過程中菌群組成的多樣性分析研究較多，然而關(guān)于其在不同屠宰加工過程中雞胴體菌群組成及多樣性差異的研究較少，因此利用高通量測序技術(shù)研究肉雞屠宰加工過程中的微生物組成及動(dòng)態(tài)變化是揭示冰鮮雞肉質(zhì)量安全與腐敗菌群的關(guān)系，以及保證冰鮮雞肉品質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵。目前，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[26]。

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與高通量測序技術(shù)結(jié)合的方法測定黃羽肉雞打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝屠宰過程中各階段雞胴體表面及加工環(huán)境中預(yù)冷水的菌群多樣性，研究屠宰至加工不同過程中肉雞胴體表面及預(yù)冷水的細(xì)菌及不同屠宰工序優(yōu)勢菌群的消長規(guī)律，旨在分析黃羽肉雞屠宰、加工環(huán)節(jié)胴體表面的菌群組成，為后續(xù)企業(yè)對屠宰各工序的優(yōu)化提供參考依據(jù)，同時(shí)為冰鮮雞產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃羽肉雞取自江蘇某冰鮮雞屠宰加工企業(yè)不同屠宰工藝點(diǎn)；菌樣從雞胴體表面、預(yù)冷水及加工過程所接觸的加工臺(tái)面及工人手套表面取得。

氯化鈉（分析純） 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；PCA平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 南京翼飛雪生物科技有限公司；假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基添加劑（凍干）、氣單胞菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)（aeromonas medium base，RYAN）、氣單胞菌培養(yǎng)基添加劑（RYAN添加劑） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M124A電子分析天平 意大利BEL公司；SW-CJ-1FD

無菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

Centrifuge 5810 R離心機(jī)、Centrifuge 5424 R離心機(jī)

德國Eppendorf公司；Unicen MR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國 Hero Lab公司；Direct-Q3純水/超純水一體化系統(tǒng) 默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

為分析黃羽肉雞屠宰過程各工藝點(diǎn)胴體及所接觸臺(tái)面的菌群組成，在各屠宰工藝流程取樣（打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體及包裝后雞胴體），每個(gè)取樣點(diǎn)隨機(jī)選取3 只黃羽肉雞進(jìn)行微生物檢測。在接觸面及預(yù)冷水（打毛后臺(tái)面、凈膛臺(tái)面、包裝間轉(zhuǎn)掛臺(tái)面、預(yù)冷前臺(tái)面、預(yù)冷后臺(tái)面、凈膛工人手、預(yù)冷后轉(zhuǎn)掛工人手、掛腳環(huán)工人手、包裝工人手、包裝秤、一階預(yù)冷水及二階預(yù)冷水）取樣，并進(jìn)行微生物檢測。測定不同工藝點(diǎn)的胴體、接觸面和預(yù)冷水所取樣品的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)和氣單胞菌數(shù)；同時(shí)將所有肉雞胴體的樣本及一階、二階預(yù)冷水樣品洗菌后，菌懸液離心獲得菌泥，并將其保存于－20 ℃，用于菌群多樣性分析。

1.3.2 各屠宰工藝雞胴體及預(yù)冷水測試菌液制備

從不同屠宰工藝流程隨機(jī)抽取3 只黃羽肉雞，每只黃羽肉雞胴體與等質(zhì)量的無菌生理鹽水一起稱質(zhì)量，隨后放入無菌勻漿袋中，在室溫條件下劇烈振蕩10 min，吸取0.5 mL細(xì)菌懸浮液，用4.5 mL無菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，以稀釋后的菌液為實(shí)驗(yàn)用菌液。稱取一定質(zhì)量一階、二階預(yù)冷水與等質(zhì)量無菌生理鹽水放入無菌均質(zhì)袋中，按同樣方法制備稀釋菌液。

1.3.3 加工環(huán)境表面測試菌液制備

將肉雞胴體可直接觸及表面選為加工環(huán)境表面的取樣部位，使用無菌棉球在5 cm×5 cm的取樣器范圍內(nèi)擦拭取樣部位，然后把帶有菌落的棉球放入裝有225 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中。重復(fù)取樣3 次，搖晃均勻，然后將菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，配制成測

試菌液。

1.3.4 菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)及氣單胞菌數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[27]測定菌落總數(shù)，對30～300 CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；參照SN/T 4044—2014

《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計(jì)數(shù)方法》[28]測定假單胞菌數(shù)，對30～300 CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；參照SN/T 0751—2010《進(jìn)出口食品中嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法》[29]測定氣單胞菌數(shù)，對30～300 CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 樣品菌體的收集

分別取打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝4 個(gè)屠宰工藝流程的雞胴體、一階預(yù)冷水及二階預(yù)冷水未稀釋的菌懸液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，去除上清液，收集沉淀并保存于－20 ℃冰箱中，各組樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.3.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及高通量測序

由北京奧維森基因科技有限公司對預(yù)先制備好的菌體樣品進(jìn)行測試。首先，對所有菌體樣品的

16S rDNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選取的引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’）。隨后，利用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺(tái)對擴(kuò)增樣品進(jìn)行測序與分析。根據(jù)每個(gè)樣本的數(shù)據(jù)對序列進(jìn)行質(zhì)控與篩選，去除數(shù)據(jù)中的嵌合體、序列末端質(zhì)量讀數(shù)小于20的序列、引物錯(cuò)配和短序列（通常小于150 bp）后得到優(yōu)化序列，然后進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析及物種分類學(xué)分析。根據(jù)OTU聚類結(jié)果進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析及測序深度檢測；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。所有分析均使用最小顯著性差異方法檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin Pro 2024和R語言的venn包、reshape2、ggplot2包等工具對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并生成Venn圖、PCA析圖和熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰過程中黃羽肉雞胴體表面及預(yù)冷水菌落

總數(shù)、假單胞菌數(shù)和氣單胞菌數(shù)變化

由圖1A可知，在黃羽肉雞的屠宰過程中，打毛后黃羽肉雞胴體表面的菌落總數(shù)為4.82（lg（CFU/g））、凈膛后雞胴體菌落總數(shù)為5.03（lg（CFU/g））。這可能是由凈膛過程中一些外源性操作或屠宰過程中的二次污染所造成。經(jīng)過第1次和第2次預(yù)冷洗滌后，雞胴體菌落總數(shù)降至4.68（lg（CFU/g）），表明預(yù)冷對減少雞胴體上的細(xì)菌數(shù)量有一定的作用。包裝后雞胴體的菌落總數(shù)為4.65（lg（CFU/g）），與預(yù)冷后雞胴體菌落總數(shù)相當(dāng)，這可能是由于預(yù)冷和包裝2 個(gè)工藝流程之間沒有采取相應(yīng)措施以減少細(xì)菌數(shù)量。一階預(yù)冷水和二階預(yù)冷水菌落總數(shù)分別為5.07、4.76（lg（CFU/mL）），污染較嚴(yán)重，與未采用較合適的減菌措施有關(guān)。通過雞胴體整體菌落總數(shù)的變化看，凈膛后未采取合適的減菌措施致使預(yù)冷后菌落總數(shù)太高，從而導(dǎo)致產(chǎn)品菌落總數(shù)偏高。由此可知，凈膛和預(yù)冷是黃羽肉雞細(xì)菌數(shù)量增長的主要污染源，因此應(yīng)更加關(guān)注屠宰過程中以上工序的衛(wèi)生操作及這些過程中微生物控制情況。

假單胞菌和氣單胞菌因耐低溫、蛋白酶產(chǎn)量高、易致腐，為冷鮮黃羽肉雞的主要致腐菌。由圖1B可知，成品雞胴體假單胞菌數(shù)為3.98（lg（CFU/g）），一階、二階預(yù)冷水中假單胞菌數(shù)分別達(dá)到4.72、

4.33（lg（CFU/mL））。由圖1C可知，包裝后雞胴體氣單胞菌數(shù)為3.19（lg（CFU/mL）），一階、二階預(yù)冷水中氣單胞菌數(shù)分別為4.81、3.29（lg（CFU/mL）），結(jié)果與假單胞菌相似，表明雞胴體中攜帶較多假單胞菌和氣單胞菌，而目前的屠宰線未起到較好的減菌效果，致使優(yōu)勢菌污染嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)品在后期貯藏過程中易腐敗變質(zhì)。

2.2 加工環(huán)境表面菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)和氣單胞菌數(shù)變化

選擇不同的加工臺(tái)面及工人的手為取樣點(diǎn)，由圖2A可知，加工臺(tái)面檢測結(jié)果顯示，預(yù)冷前臺(tái)面菌落總數(shù)最高，為4.07（lg（CFU/cm2））；預(yù)冷后臺(tái)面次之，為4.05（lg（CFU/cm2））。屠宰加工過程中前區(qū)的凈膛工人手和轉(zhuǎn)掛工人手菌落總數(shù)分別高達(dá)4.81、

4.49（lg（CFU/cm2）），前區(qū)工人手套菌落總數(shù)較高，這可能與前區(qū)工人手套沒有定時(shí)消毒有關(guān)，同時(shí)在現(xiàn)場觀察前區(qū)出現(xiàn)工人未戴手套、裸手操作的情況。包裝車間電子秤、工人手及臺(tái)面的菌落總數(shù)未超過

4.00（lg（CFU/cm2）），達(dá)到預(yù)期效果，這應(yīng)該與每日班后保持清潔擦拭的習(xí)慣有關(guān)。由此可以看出，在凈膛和預(yù)冷這2 個(gè)屠宰流程中，凈膛工人手、預(yù)冷前后臺(tái)面及轉(zhuǎn)掛工人手是影響黃羽肉雞菌落總數(shù)變化的主要污染源。由圖2B、C可知，打毛后臺(tái)面、預(yù)冷后臺(tái)面、包裝間轉(zhuǎn)掛臺(tái)面中假單胞菌數(shù)和氣單胞菌數(shù)均未超過3.00（lg（CFU/cm2）），表明加工臺(tái)面清洗達(dá)到預(yù)期效果。

2.3 基于Illumina MiSeq PE300平臺(tái)的高通量測序結(jié)果分析

2.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與OTU分析

通過Illumina Miseq高通量測序，獲得肉雞屠宰分割過程中各工藝點(diǎn)的胴體和一階、二階預(yù)冷水總菌數(shù)的序列數(shù)據(jù)，其中18 個(gè)樣品得到767 個(gè)OTU，抽平處理后剩余759 個(gè)。此外，在對18 個(gè)樣本進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化后，共獲得1 060 635 條有效序列，高質(zhì)量序列主要集中在420～440 bp長度區(qū)間內(nèi)。當(dāng)樣本量逐漸增大到約30 000 個(gè)時(shí)，稀釋曲線（圖3A）和Shannon曲線（圖3B）開始趨向于平緩，樣本中OTU數(shù)量也不再增加，表明數(shù)據(jù)量足以描述樣本中的大部分微生物種類[30]。

由圖4A可知，6 組樣品共有的OTU為229 個(gè)；隨后再對所有樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊，得到花瓣圖（圖4B）。從這2 個(gè)圖中可以得出6 組樣本之間有相同的菌群結(jié)構(gòu)。

2.3.2 α多樣性指數(shù)分析

所測樣本的生物多樣性、物種豐富度和均勻度及樣本測序深度主要體現(xiàn)在α多樣性上，主要包含4 個(gè)指標(biāo)[31-32]。其中Chao1指數(shù)與群落豐富度呈正相關(guān)；測

序深度體現(xiàn)在observed_species指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)；而Shannon指數(shù)則與群落的多樣性密切相關(guān)，Shannon指數(shù)越高，表明群落多樣性越大。由圖5可知，凈膛后雞胴體樣品Chao1指數(shù)最高，即細(xì)菌群落豐度最高，而其他5 個(gè)樣本的豐度則相對下降。同樣地，observed_species和PD_whole_tree指數(shù)也用于分析樣本中微生物群落的豐富度和多樣性，由圖5B、C可知，凈膛后雞胴體樣本的菌群多樣性更高，但是這2 個(gè)指數(shù)反映的測序深度和采樣次數(shù)密切相關(guān)，因此可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果偏離實(shí)際采樣樣本的情況，從而出現(xiàn)誤差。通過Shannon指數(shù)可以看出各樣本間群落多樣性的變化。由圖5D可知，樣品打毛后雞胴體的Shannon指數(shù)最低，說明屠宰加工初期的雞胴體表面菌群多樣性比較低。但是，隨著屠宰加工的進(jìn)行，凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體、一階預(yù)冷水、二階預(yù)冷水和包裝后雞胴體的Shannon指數(shù)均明顯增高，特別是包裝后雞胴體的Shannon指數(shù)達(dá)到最高。結(jié)果表明，肉雞胴體表面的群落多樣性很可能會(huì)因屠宰分割肉雞過程中使用的工具及加工方法而增加。

2.3.3 物種組成和聚類分析

參考肖英平等[33]的方法，使用RDP Classifier算法對每個(gè)樣本的序列進(jìn)行比較和分析，并對每個(gè)采樣點(diǎn)的細(xì)菌群落物種信息進(jìn)行科、屬級別的分析。由圖6A可知，打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體、包裝后雞胴體4 組不同加工過程的雞胴體樣本攜帶的微生物菌群在科水平上的優(yōu)勢菌群基本相同，其主要組成有莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、威克斯氏菌科（Weeksellaceae）和李斯特氏菌科（Listeriaceae）等。而在屬水平上，各組樣品的優(yōu)勢菌群發(fā)生變化。由圖6B可知，4 組雞胴體樣本攜帶的微生物菌群主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）、巨大球菌屬（Macrococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等。凈膛后雞胴體與打毛后雞胴體相比，優(yōu)勢菌群有較大差別，可能是因?yàn)閮籼艜r(shí)人工操作造成的一些外源性污染。與肉雞胴體表面菌群相比，預(yù)冷水中的菌群多樣性差別不大，其主要菌群和胴體表面基本相同，但比例略有不同。此外，不同加工過程中雞胴體表面的菌群比例也存在差異。預(yù)冷前打毛后雞胴體和凈膛后雞胴體的優(yōu)勢菌有巨大球菌屬（Macrococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），在經(jīng)過預(yù)冷水后，巨大球菌屬和乳桿菌屬相對豐度大幅下降，說明預(yù)冷水中的消毒劑對它們有一定的減菌效果。YD和BD 2 組胴體的優(yōu)勢菌也發(fā)生變化，假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度明顯增高，逐漸演變?yōu)樽钪饕膬?yōu)勢菌屬。原因可能是假單胞菌是嗜冷菌，其在低溫環(huán)境下依然可以生長繁殖[34]。

2.3.4 樣品菌群變化熱圖分析

樣品菌群變化熱圖顯示了對所有樣本中的微生物多樣性相對豐度的詳細(xì)分析，圖中不同顏色的深淺代表每個(gè)物種的聚集狀態(tài)[35]。如圖7所示，6 組樣本均出現(xiàn)明顯聚集，打毛后雞胴體中優(yōu)勢菌為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、巨大球菌屬（Macrococcus）和鏈球菌屬（Streptocpccus）；凈膛后雞胴體中優(yōu)勢菌為乳桿菌屬、巨大球菌屬、嗜冷桿菌屬和短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter），然而，在后續(xù)的預(yù)冷加工處理過程中它們的數(shù)量明顯減少，并且優(yōu)勢種屬也發(fā)生改變。一階預(yù)冷水和二階預(yù)冷水組樣品優(yōu)勢菌均為假單胞菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬，短穩(wěn)桿菌屬在這2 組樣品中差異較大，其在樣品一階預(yù)冷水中的聚集度明顯多于樣品二階預(yù)冷水。預(yù)冷后雞胴體主要優(yōu)勢菌為假單胞菌屬和巨大球菌屬，而包裝后雞胴體主要優(yōu)勢菌為環(huán)絲菌屬（Brochothrix）和假單胞菌屬。這2 組樣品，特別是樣品預(yù)冷后雞胴體假單胞菌屬的相對豐度明顯增大，并且通過屠宰加工線可以看出假單胞菌屬的豐度整體呈現(xiàn)上升趨勢。目前，減少黃羽肉雞屠宰過程中胴體細(xì)菌的主要措施是在預(yù)冷水中添加消毒劑，但綜合以上檢測數(shù)據(jù)，僅依靠預(yù)冷水中的消毒劑不能保障終產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，建議在屠宰過程中增加減菌措施，比如在凈膛后增加含次氯酸鈉消毒劑的清洗池或者增加一階預(yù)冷水中消毒劑的添加量，以降低預(yù)冷后的微生物數(shù)量。同時(shí)可以配備工人清洗手部的消毒池，定時(shí)洗手，以減少二次污染量。

2.3.5 冰鮮雞加工過程中菌群變化的PCA

不同樣品中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成越相近，樣本間的距離就越小[36]。如圖8所示，PCA進(jìn)一步顯示6 組樣本細(xì)菌群落的組成存在顯著差異。PC1對樣品差異的貢獻(xiàn)率為46.62%，PC2為26.15%。在PCA圖中，打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體、包裝后雞胴體、一階預(yù)冷水和二階預(yù)冷水6 個(gè)組別的3 個(gè)樣品之間的距離均較近，表示各平行樣本的組成差異較小。其中，在PC1和PC2方向上，打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體、包裝后雞胴體4 個(gè)雞胴體表面取樣點(diǎn)中，預(yù)冷后雞胴體和包裝后雞胴體較為接近，表明2 組雞胴體表面菌群特征在2 個(gè)PC水平上較為相近。然而，打毛后雞胴體與凈膛后雞胴體2 組樣本從PCA來看距離較遠(yuǎn)，說明表面的菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。從打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體、預(yù)冷后雞胴體和包裝后雞胴體4 組樣本中的PCA數(shù)據(jù)可以得出，打毛后雞胴體、凈膛后雞胴體2 組相比存在較大差異，而預(yù)冷后雞胴體和包裝后雞胴體差異較小，說明打毛、凈膛后的雞胴體菌群差異較大，而預(yù)冷后雞胴體和包裝后雞胴體的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了較大變化并基本趨于一致。在PCA圖上，一階預(yù)冷水與二階預(yù)冷水組間的距離接近，說明菌群特征較接近，2 種水樣的整體菌群結(jié)構(gòu)差異不大。

3 討 論

微生物是影響黃羽肉雞屠宰至加工整個(gè)過程及后期貯藏腐敗變質(zhì)的主要因素[37]。肉雞除了自身攜帶的污染物，在整個(gè)屠宰加工過程中所有的操作程序及接觸面也都可能會(huì)成為肉雞胴體的污染源。因此，通過分析黃羽肉雞打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝等屠宰過程中雞胴體表面和預(yù)冷水的微生物菌群組成，可以為后續(xù)企業(yè)對屠宰各工序的優(yōu)化提供一定的參考依據(jù)。本研究監(jiān)測黃羽肉雞胴體屠宰過程中菌落總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，隨生產(chǎn)時(shí)間延長，菌落總數(shù)呈增長趨勢，相較于工人手、分割臺(tái)面等部分，雞胴體和預(yù)冷水的菌落總數(shù)明顯略高。通過高通量測序技術(shù)對黃羽肉雞打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝等屠宰過程中雞胴體表面和預(yù)冷水菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，得出凈膛后雞胴體樣品的細(xì)菌群落豐度最高，這是由凈膛過程中一些外源性操作或屠宰過程中的二次污染所造成的；包裝后雞胴體樣品的菌群多樣性最高，主要是因?yàn)槿怆u在屠宰和分割等加工過程中所使用的工具和處理方法增加了肉雞胴體表面微生物群落的多樣性。預(yù)冷前黃羽肉雞胴體在屬水平上主要優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、嗜冷桿菌屬和乳球菌屬，巨大球菌屬和假單胞菌屬次之。經(jīng)預(yù)冷后優(yōu)勢菌群豐度減少，而假單胞菌屬、巨大球菌屬、不動(dòng)桿菌屬等占比增加，逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢菌群。王倩等[38]對冰鮮雞預(yù)冷過程中的微生物菌群多樣性進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析得出，經(jīng)過2 次預(yù)冷水后雞胴體的金黃桿菌屬、假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的豐度增加。劉夢竹等[39]基于16S rRNA研究貨架期前后雞肉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)低溫貯藏末期的優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和沙雷氏菌屬等。麥栩滔等[40]通過對不同包裝方式下冰鮮雞肉的菌群多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在貯藏后期優(yōu)勢腐敗菌逐漸變?yōu)榧賳伟鷮佟h(huán)絲菌屬和希瓦氏菌屬。這些結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測序技術(shù)分析黃羽肉雞打毛、凈膛、預(yù)冷和包裝屠宰過程中雞胴體表面和預(yù)冷水的微生物污染情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)打毛、凈膛和預(yù)冷后的雞胴體菌落總數(shù)分別為4.82、5.03、

4.68（lg（CFU/g）），說明該屠宰工藝未起到較好的減菌效果，宰后胴體微生物污染嚴(yán)重。通過高通量測序技術(shù)對黃羽肉雞屠宰加工過程中的胴體和預(yù)冷水的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，從屬水平上看，隨著屠宰進(jìn)行，預(yù)冷水中假單胞菌屬、乳桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬等豐度增加；經(jīng)預(yù)冷后乳桿菌屬、嗜冷桿菌屬和乳球菌屬豐度減少，假單胞菌屬、巨大球菌屬和不動(dòng)桿菌屬等豐度增加，說明預(yù)冷工藝對乳桿菌屬、嗜冷桿菌屬和乳球菌屬有較好的減菌效果，但是對假單胞菌屬、巨大球菌屬和不動(dòng)桿菌屬減菌效果不佳。PCA表明，一階、二階預(yù)冷水、預(yù)冷后雞胴體及包裝后雞胴體相距較近，差異性不大，但與打毛雞胴體和凈膛后雞胴體2 組樣品有較大差異，說明預(yù)冷水中的污染菌組成決定了宰后胴體的污染菌種類。本研究說明不同屠宰流程后黃羽肉雞胴體污染菌的組成與豐度存在差異，需針對不同屠宰流程特性采取對應(yīng)的控制手段保障肉雞制品的質(zhì)量與安全，同時(shí)也為冷鮮雞肉保鮮技術(shù)的開發(fā)提供了一定參考。

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