摘" 要：為研究大連市兩個(gè)海域潰爛海帶（Laminaria japonica）相關(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，于2023年3月分別自大李家海域和龍王塘海域采集海帶孢子體和海水，采用平板涂布法獲得測(cè)序菌群樣品，經(jīng)測(cè)序質(zhì)控處理后共得到132個(gè)物種注釋。結(jié)果表明，海帶的細(xì)菌群落中變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌群。在屬水平，海帶相關(guān)優(yōu)勢(shì)屬為假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）；海水相關(guān)優(yōu)勢(shì)屬為冷單胞菌屬（Psychromonas）。海帶和海水共同有的菌種有北極冷單胞菌（Psychromonas arctica）、葉氏假交替單胞菌（Pseudoalteromonas elyakovii）、識(shí)別假交替單胞菌（Pseudoalteromonas distincta）、北極假交替單胞菌（Pseudoalteromonas arctica）。產(chǎn)褐藻膠降解酶系的菌種和海帶潰爛的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：大連市；海帶（Laminaria japonica）；菌群；潰爛病

中圖分類號(hào)：S946.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""文章編號(hào)：1674-2419（2024）03-0254-07

中國(guó)是世界上主要的海帶養(yǎng)殖國(guó)之一，海帶（Laminaria japonica）養(yǎng)殖主要分布在中國(guó)遼東半島沿岸海域、山東半島沿岸海域。海帶產(chǎn)業(yè)在中國(guó)有著顯著的經(jīng)濟(jì)影響，海帶養(yǎng)殖及其加工業(yè)每年為國(guó)家創(chuàng)造約1000億元人民幣的經(jīng)濟(jì)效益，并且促進(jìn)了沿海地區(qū)和相關(guān)行業(yè)的就業(yè)和發(fā)展。大連市處于中國(guó)北端，海域遼闊，海洋藻類資源豐富，也是中國(guó)海帶養(yǎng)殖的發(fā)源地。海帶于20世紀(jì)20年代中期移入大連地區(qū)，建國(guó)以后海藻資源得到開(kāi)發(fā)利用，海帶養(yǎng)殖得到飛躍的發(fā)展，并帶動(dòng)了大連市海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。海帶作為一種可食用的海藻，豐富了老百姓的餐桌，同時(shí)因其富含褐藻膠、甘露醇、藻多糖等，是醫(yī)藥保健、海藻化工和農(nóng)業(yè)肥料等行業(yè)的重要原料[1]。海帶作為海洋初級(jí)生產(chǎn)力，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著固定光能、吸收二氧化碳、合成有機(jī)物質(zhì)、釋放氧氣、凈化水質(zhì)等重要作用。

據(jù)了解，2023年3月中旬開(kāi)始，大連市黃海近岸浮筏養(yǎng)殖海帶藻體梢部邊緣出現(xiàn)變黃、潰爛、滯長(zhǎng)等現(xiàn)象，從金普新區(qū)大李家海域開(kāi)始，蔓延至高新園區(qū)龍王塘海域、旅順口區(qū)柏嵐子海域，養(yǎng)殖產(chǎn)量受到不同程度的影響。金普新區(qū)登沙河街道海域歷史上出現(xiàn)過(guò)海帶潰爛情況，柴成林等的研究認(rèn)為海帶的潰爛和水質(zhì)無(wú)關(guān)[2]。孫丕海等通過(guò)對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌群落的分析發(fā)現(xiàn)不同海域的細(xì)菌群落有一定的差異[3]。為了進(jìn)一步找出造成海帶潰爛的主要因素，文章作者組織有關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行了該次的調(diào)查，通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)查和海水、海帶可培養(yǎng)菌的16S三代擴(kuò)增子測(cè)序，以期找出菌落組成和海帶發(fā)病的內(nèi)在關(guān)系。為完善海帶的健康養(yǎng)殖技術(shù)體系，做好海帶病害防治等提供可靠的數(shù)據(jù)支持，助力大連市海藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)及采樣時(shí)間

2023年3月金普新區(qū)大李家海域，高新園區(qū)龍王塘海域浮筏養(yǎng)殖海帶出現(xiàn)潰爛情況，該調(diào)查在上述兩海區(qū)采集海水（1個(gè)樣點(diǎn)）和海帶孢子體（3棵）樣品，樣品信息詳見(jiàn)表1。

1.2 養(yǎng)殖環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)

對(duì)兩采樣點(diǎn)海水的氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽-氮（NO-2-N）、硝酸鹽-氮（NO-3-N）、活性磷酸鹽（PO3-4-P）進(jìn)行了采樣檢測(cè)，采樣和實(shí)驗(yàn)室分析方法參照《海水增養(yǎng)殖區(qū)監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程》《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范GB 11607-89》和《海洋調(diào)查規(guī)范》執(zhí)行。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌操作剪取海帶孢子體潰爛處葉片0.5g，參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)》（GB 7378.7-2007）10.1 平板計(jì)數(shù)法分離培養(yǎng)海帶攜帶的細(xì)菌，培養(yǎng)結(jié)束依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)10.1.5.5 菌落計(jì)數(shù)法選出計(jì)數(shù)的平板，作為細(xì)菌16S rRNA測(cè)序樣品。海水樣品視為原液，用無(wú)菌PBS稀釋得到的10-2、10-3、10-4不同梯度樣品，分別吸取100 μL液體無(wú)菌操作涂布到TCBS培養(yǎng)基，室溫（約16℃）下培養(yǎng)24h，依據(jù)前述菌落計(jì)數(shù)法選出待測(cè)序平板樣品。

1.4 細(xì)菌16S" rRNA測(cè)序

在無(wú)菌環(huán)境下將待測(cè)平板樣品所有菌落收集到1.5mL無(wú)菌離心管中，送上海偉寰生物科技有限公司進(jìn)行微生物菌落16S三代擴(kuò)增子測(cè)序。采用PacBio測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序[4]，獲取下機(jī)原始數(shù)據(jù)，通過(guò)PacBio公司的SMRT Link version 5.0導(dǎo)出CCS文件，文件為fastq格式。

1.5 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)預(yù)處理，通過(guò)對(duì) CCS（Circular Consensus Sequencing）序列進(jìn)行過(guò)濾、聚類或去噪，以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫(kù)使用樸素貝葉斯分類器結(jié)合比對(duì)的方法對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋[5]，可得到每個(gè)特征對(duì)應(yīng)的物種分類信息[6]，進(jìn)而在各水平（門phylum， 綱class， 目order， 科 family，屬genus，種species）統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME2軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品種屬水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。使用QIIME2軟件計(jì)算alpha多樣性指數(shù)[7]，包括Chao1、Shannon、Simpson和Pielou-e指數(shù)[8]。比較不同海帶菌群alpha多樣性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果及分析

對(duì)金普新區(qū)大李家海域、高新園區(qū)龍王塘海域的監(jiān)測(cè)點(diǎn)位水文氣象記錄結(jié)果，見(jiàn)表2。

對(duì)兩監(jiān)測(cè)點(diǎn)位海水的四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分別為氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽-氮（NO-2-N）、硝酸鹽-氮（NO-3-N）、活性磷酸鹽（PO2-4-P），監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，監(jiān)測(cè)點(diǎn)位水質(zhì)滿足海水水質(zhì)一類標(biāo)準(zhǔn)，滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境要求（見(jiàn)表3）。

2.2 海帶和海水可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性差異

測(cè)序獲得5個(gè)樣品內(nèi)包含的細(xì)菌16S rRNA基因，經(jīng)過(guò)一系列質(zhì)控處理后，每個(gè)樣品中獲得有效序列數(shù)量在9762～11811，這些序列共形成了132個(gè)ASVs。單樣本的多樣性分析 （Alpha多樣性）可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性[9]。采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的有效序列數(shù)進(jìn)行ASV的分析，并分別計(jì)算各α多樣性指數(shù)，α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)如下表4：

根據(jù)chao1、ACE兩種算法估算的樣品物種數(shù)基本一致，五個(gè)樣品中物種數(shù)在30～117之間。Good Coverage指數(shù)結(jié)果均接近1，說(shuō)明五個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果接近真實(shí)值，樣品中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率極低。Shannon多樣性指數(shù)顯示兩個(gè)水樣的指數(shù)分別為3.37和4.31；三個(gè)生物樣品的指數(shù)分別為4.27、2.75、3.63之間，表明大李家海域海帶攜帶微生物多樣性更大，龍王塘海水的微生物多樣性最高。三個(gè)生物樣品Pielou-e指數(shù)0.55～0.62之間，說(shuō)明大李家海帶樣品指數(shù)0.62最大，說(shuō)明樣品內(nèi)菌群均勻性更好。

2.3 五個(gè)樣品中菌群相對(duì)豐度差異

圖1顯示五個(gè)樣品中相對(duì)豐度前20名的屬級(jí)差異。從屬水平看，龍王塘海水TCBS可培養(yǎng)菌群中優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬Vibrio，龍王塘海水可培養(yǎng)菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬為冷單胞菌屬（Psychromonas），三個(gè)海帶樣品可培養(yǎng)菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬均為假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）?？梢?jiàn)海水可培養(yǎng)菌群和海帶可培養(yǎng)菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。

圖2展示了五個(gè)樣品中聚類與不聚類的豐度top20屬級(jí)的熱圖。熱圖分析顏色越紅說(shuō)明這個(gè)物種的豐度越高，顏色越藍(lán)則反之。龍王塘海水TCBS可培養(yǎng)菌群中在屬水平上弧菌屬Vibrio和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）內(nèi)豐度最高；龍王塘海水可培養(yǎng)菌群中冷單胞菌屬（Psychromonas）和乳桿菌屬（Ligilactobacillus）屬內(nèi)豐度較高；大李家海域海帶可培養(yǎng)菌群中黃桿菌科不定屬（unclassified Flavobacteriaceae）、極地桿菌屬（Polaribacter）、冰冷桿菌屬（Gelidibacter）、沃雷氏菌屬（Olleya）、噬幾丁質(zhì)菌目不定屬（unclassified Chitinophagales）、棲砂桿菌屬Arenibacter、黃桿菌屬（Flavobacterium）、土地桿菌屬（Pedobacter）、漠河桿菌屬（Moheibacter）、湖食物鏈菌（Lacinutrix）和不滑動(dòng)菌屬（Nonlabens）的11個(gè)屬內(nèi)豐度較高；龍王塘海域輕病癥海帶可培養(yǎng)菌群中假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）屬內(nèi)豐度較高；龍王塘海域典型病癥海帶可培養(yǎng)菌群中科爾韋爾氏菌屬（Colwellia）、普雷沃氏菌科不定屬（Prevotellaceae UCG 001）、不定屬（unclassified Muribaculaceae）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）屬內(nèi)豐度較高。

2.4 五個(gè)樣品可培養(yǎng)菌群Krona 物種差異

利用Krona網(wǎng)頁(yè)工具對(duì)單樣品物種注釋結(jié)果及豐度進(jìn)行動(dòng)態(tài)可視化展示。對(duì)樣品物種分類學(xué)組成進(jìn)行交互展示，扇形的大小反映了不同分類水平的物種相對(duì)豐度高低，并可以查看具體的豐度數(shù)值。

見(jiàn)圖3-1，龍王塘海水TCBS可培養(yǎng)菌群物種水平看主要菌種：燦爛弧菌（Vibrio splendidus）64%、大西洋弧菌（Vibrio atlanticus）26%、巨大弧菌（Vibrio gigantis）9%、遲緩弧菌（Vibrio lentus）0.2%。

見(jiàn)圖3-2，龍王塘海水可培養(yǎng)菌群物種水平看主要菌種：北極冷單胞菌（Psychromonas arctica）70%、葉氏假交替單胞菌（Pseudoalteromonas elyakovii）12%、識(shí)別假交替單胞菌（Pseudoalteromonas distincta）6%、華美菌（Psychromonas aquatilis）3%、北極假交替單胞菌（Pseudoalteromonas arctica）3%、（Pseudocolwellia agarivorans）1%、發(fā)光弧菌（Vibrio toranzoniae）1%。

見(jiàn)圖3-3，大李家海帶可培養(yǎng)菌群物種水平看主要菌種：葉氏假交替單胞菌29%、北極冷單胞菌17%、北極假交替單胞菌17%、識(shí)別假交替單胞菌16%、假交替單胞菌未定種（Pseudoalteromonas sp.）4%、華美菌 2%、伯頓湖冷蛇菌 （Psychroserpens burtonensis）2%、（uncultured Flavobacteriia bacteriu）1%、（Pseudocolwellia agarivorans）1%、假交替單胞菌未定種（Pseudoalteromonas sp.BSw20057y ）1%、產(chǎn)黑假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）1%。

見(jiàn)圖3-4，龍王塘海域輕病癥海帶可培養(yǎng)菌群物種水平看主要菌種：葉氏假交替單胞菌49%、北極假交替單胞菌20%、識(shí)別假交替單胞菌20%、假交替單胞菌屬未定種（Pseudoalteromonas sp.）7%、產(chǎn)黑假交替單胞菌2%、北極冷單胞菌1%。

見(jiàn)圖3-5，龍王塘海域典型病癥海帶可培養(yǎng)菌群物種水平看主要菌種：葉氏假交替單胞菌33%、北極假交替單胞菌26%、識(shí)別假交替單胞菌15%、北極冷單胞菌12%、假交替單胞菌未定種（Pseudoalteromonas sp.）3%、（Pseudocolwellia agarivorans）3%、產(chǎn)黑假交替單胞菌2%、假交替單胞菌未定種（Pseudoalteromonas sp.BSw20057y）1%、海雪嗜冷桿菌（Psychrobacter nivimaris）1%。

3 討論

3.1 海水和海帶可培養(yǎng)菌群差異分析

該研究結(jié)果可知，海水和海帶可培養(yǎng)細(xì)菌中在門水平優(yōu)勢(shì)菌都是變形菌門。龍王塘海域的海水可培養(yǎng)菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬為冷單胞菌屬和假交替單胞菌屬。龍王塘兩個(gè)海帶樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬也為冷單胞菌屬和假交替單胞菌屬。龍王塘海域的海水和海帶可培養(yǎng)細(xì)菌共同有4個(gè)菌種，北極冷單胞菌、葉氏假交替單胞菌、識(shí)別假交替單胞菌、北極假交替單胞菌，分別占到各自樣品的91%、90%和86%，他們的比例較高。由此可以推測(cè)，海水中可培養(yǎng)細(xì)菌組成和海帶可培養(yǎng)細(xì)菌的組成息息相關(guān)，海藻上細(xì)菌主要來(lái)源可能是海水。這一推測(cè)和孫丕海的研究觀點(diǎn)一致[3]。龍王塘海水和大李家海帶可培養(yǎng)細(xì)菌共有的4個(gè)菌種，占大李家海帶樣品的79%。大李家海域海帶和龍王塘海域海帶先后出現(xiàn)潰爛情況，實(shí)地調(diào)研了解到，大李家海域海帶先出現(xiàn)潰爛，后沿黃海近岸向南經(jīng)龍王塘海域、鮑魚肚海域，逐漸向旅順口區(qū)鹽場(chǎng)海域，至旅順口區(qū)鐵山海域養(yǎng)殖海帶均出現(xiàn)不同程度的潰爛。推測(cè)有一股海流沿該線路流經(jīng)各地，所以會(huì)出現(xiàn)共同菌種比例較高。

大李家海域和龍王塘海域海水四項(xiàng)指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，監(jiān)測(cè)點(diǎn)位水質(zhì)滿足海水水質(zhì)一類標(biāo)準(zhǔn)，未有異常值。但只能表明海水指標(biāo)沒(méi)有直接對(duì)海帶生長(zhǎng)造成影響。細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到溫度[10]、鹽度[11]、pH等指標(biāo)的影響。馮磊等的研究推測(cè)鹽度和溫度變化導(dǎo)致海水菌群結(jié)構(gòu)變化，引起海帶爛孔病[12]。北極冷單胞菌、葉氏假交替單胞菌、識(shí)別假交替單胞菌、北極假交替單胞菌4種菌與水環(huán)境因子的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

3.2 海帶潰爛原因的分析探討

在屬水平海帶可培養(yǎng)細(xì)菌相關(guān)優(yōu)勢(shì)屬為假交替單胞菌屬和冷單胞菌屬。種水平海帶可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌有葉氏假交替單胞菌、北極冷單胞菌、北極假交替單胞菌、識(shí)別假交替單胞菌、華美菌、伯頓湖冷蛇菌、產(chǎn)黑假交替單胞菌、海雪嗜冷桿菌、Pseudoalteromonas sp.uncultured Flavobacteriia bacteriu、Pseudocolwellia agarivorans、Pseudoalteromonas sp.BSw20057y、Pseudocolwellia agarivorans。

有研究表明褐藻酸降解菌感染海帶苗可導(dǎo)致海帶表面潰爛[13-14]，褐藻酸降解菌能入侵海帶皮層細(xì)胞分泌褐藻酸分解酶，從而破壞海帶的組織結(jié)構(gòu)[15]。有研究表明北極假交替單胞菌能造成裙帶菜潰爛[16]，假交替單胞菌屬和弧菌屬細(xì)菌是海帶孔蘭病的潛在病原[17]。查閱山東大學(xué)海洋生物工程技術(shù)研究中心菌種數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，巨大弧菌、遲緩弧菌、北極冷單胞菌、華美菌、產(chǎn)黑假交替單胞菌潛在分泌海藻多糖降解酶，褐藻酸[18]是海帶的重要組成。

海帶潰爛的原因較多，有水環(huán)境、光照、透明度等[19]，該次海帶潰爛期間養(yǎng)殖場(chǎng)監(jiān)測(cè)到海區(qū)海水透明度下降，海浪翻滾攪起沉積物。產(chǎn)黑假交替單胞菌、海雪嗜冷桿菌[20]是沉積物中常分離到的菌種[21]，說(shuō)明海帶菌群結(jié)構(gòu)也受水文環(huán)境的影響。經(jīng)了解旅順口區(qū)鐵山區(qū)海域浮筏養(yǎng)殖的海帶“中寶1號(hào)”未發(fā)生潰爛，說(shuō)明不同品種對(duì)潰爛的抵抗能力不同?，F(xiàn)在中國(guó)已培育出12個(gè)海帶新品種，可以更換養(yǎng)殖品種，減少海帶潰爛的風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)褐藻膠降解酶系的菌種和海帶潰爛的內(nèi)在關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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Preliminarystudy on the structure of the nearshore decomposing Laminaria japonica microbial community in Dalian City

BI Xianchen1， WANG Xiaolong2， WANG Lu1， XU Yan1， WANG Zhen1， ZHANG Saisai1， SUN Yang1

（1. Dalian Ocean Development Affairs Service Center， Dalian 116023， Liaoning China；2. Dalian Pulandian district Agriculture and rural Bureau， Dalian 116200， Liaoning China）

Abstract：In order to study the culturable bacterial community structure of Laminaria japonica in two sea areas of Dalian City， the sporophytes and seawater of Laminaria japonica were collected from Dalijia Sea Area and Longwangtang Sea Area respectively in March 2023. Plate coating method was used to obtain the sequenced bacterial flora samples. A total of 132 species annotations were obtained after sequencing quality control treatment. The results showed that Proteobacteria was the dominant bacterial group in Laminaria. At the genus level， the related dominant genus of Laminaria japonica is Pseudoalteromonas. The dominant genus related to seawater is Psychromonas. The common strains of Laminaria japonica and seawater include Psychromonas arctica and Pseudoalteromonas elyakovii， Pseudoalteromonas distincta， and Pseudoalteromonas arctica. The relationship between the algin-producing strain and the ulceration of Laminaria japonica remains to be further studied.

Keywords：Dalian City; Laminaria japonica; bacterial community; festering disease

作者簡(jiǎn)介：畢賢臣（1988- ），男，助理農(nóng)藝師。研究方向：養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)。E-mail：707385997@qq.com。

通訊作者：張賽賽（1989- ），男，高級(jí)農(nóng)藝師。研究方向：水生動(dòng)物疫病防控。E-mail：finfish@yeah.net。