莫莊非/編譯

借助定向演化的力量，科學家距離開發(fā)能穿越

人類血腦屏障以提供基因治療的病毒載體又近了一步。

血腦屏障（BBB）是調控物質進出大腦的細胞堡壘。它確保大腦能夠獲取關鍵營養(yǎng)物質，同時保護其免受病原體和毒素侵害。另一方面，血腦屏障卻也阻礙了許多有潛力的治療方法。不過眼下，基因遞送載體系統(tǒng)升級換代，有望很快帶來高效療法。

科學家正在研究脂質納米顆粒和其他遞送載體，但腺相關病毒（AAV）載體因其靶向能力超強，能在非分裂細胞內持久表達而對人類無致病性，仍是較好的體內基因治療遞送平臺。

美國賓夕法尼亞大學基因和細胞療法研究員貝弗利 · 戴維森（Beverly Davidson）表示：“可以肯定地說，如果我們能將AAV送達目的地，那么這就是種一勞永逸的療法。”

越來越多基于AAV的基因療法獲批，還有數百種正在臨床研發(fā)中。然而，許多為治療中樞神經系統(tǒng)疾病而開發(fā)的療法需要侵入性措施，包括直接注射大腦或腰椎穿刺，這也會限制療法作用的范圍。

美國加州理工學院神經科學家維維安娜 · 格拉迪納魯（Viviana Gradinaru）表示：“理論上，脈管系統(tǒng)將是最適合療法輸送的‘高速公路，原因很簡單，人腦有600多公里長的脈管系統(tǒng)?！边@個廣泛分布的動脈網絡為大腦近1000億個神經元提供服務，但要沿著大腦的脈管高速公路行進，靜脈注射的AAV必須穿過血腦屏障的邊界管制。我們如果了解這個高度選擇性門戶的規(guī)律，就能從該基本生物學原理中獲益，讓療法進入大腦。

過去十年間，在規(guī)律還沒有揭示的情況下，格拉迪納魯領銜的團隊開發(fā)了以驅動基因療法傳遞至大腦的AAV工程策略。

載體選擇

腺相關病毒的兩大基本組成是病毒DNA及其蛋白質外殼（又稱衣殼）。為將病毒轉化為基因療法，科學家用需要遞送的基因替換病毒的DNA，并控制基因表達?？茖W家已經確定許多遺傳性疾病的遺傳原因，不過明確所需基因是一方面，安全遞送基因貨物是另一方面——這方面工作難度很大，其關鍵在于病毒衣殼。除了保護病毒攜帶的基因組，這種二十面體結構的籠形蛋白還決定著病毒通過與細胞表面受體的相互作用進入哪些組織和細胞?？茖W家已經發(fā)現(xiàn)了13種天然存在的AAV血清型，許多血清型都能以不同效率感染腦細胞，不過只有AAV9和AAVrh.10（較少被研究）能穿過血腦屏障。

脊髓性肌萎縮基因療法Zolgensma由諾華制藥研發(fā)——一種在兩歲以下兒童中取得巨大成功、已獲美國食品藥品管理局（FDA）批準的AAV9療法——能從根本上治療脊髓性肌萎縮癥。然而，AAV9并非科學家理想中的中樞神經系統(tǒng)靶向基因治療的萬能平臺。大腦發(fā)育的變化伴隨病毒對不同細胞類型傾向性的變化。一項非臨床研究表明，雖然該病毒能穿過血腦屏障，但它優(yōu)先靶向新生小鼠的神經元和成年小鼠的星形膠質細胞。

鑒于上述變化，給兒童用的劑量對成年人來說就只能影響大腦神經元的一小部分，而增加劑量又會超出安全極限。尤其令人擔憂的是該病毒對肝臟的偏愛。

美國博德研究所分子生物學家本 · 德弗曼（Ben Deverman）指出：“你如果查看以該劑量傳遞給單個肝細胞的載體基因組數量，就會發(fā)現(xiàn)每個細胞對應數百個病毒基因組，但平均而言，給大腦的遞送量遠少于每個細胞攜帶一個病毒基因組的水平?！?/p>

為提高遞送水平，同時使AAV遠離脆弱區(qū)域而直指目標器官或細胞，德弗曼、格拉迪納魯和戴維森等科學家開發(fā)了病毒衣殼工程策略，促使新的AAV模型投入生產線。

創(chuàng)建衣殼

衣殼工程有兩種主要方法。格拉迪納魯表示：“如果了解規(guī)律，就可以根據規(guī)律進行設計?！睂ρX屏障上特定受體的了解，令科學家能通過合理設計編輯衣殼，但科學家只識別出了其中的幾個。

十多年前，格拉迪納魯認為，在不了解規(guī)律的情況下，設計AAV的最佳方式是利用一種機制未知的方法。這一工程解決方案的靈感來自她與同事弗朗西斯 · 阿諾德（Frances Arnold）的交流，后者曾憑借在酶的定向演化方面的工作而獲得諾貝爾獎。

格拉迪納魯說道：“我們意識到，定向演化可以解決衣殼方面的問題，因為你無須理解其生物學規(guī)律即能取得進展?！钡@方面工作離不開一個理想的模板和嚴格的選擇標準。

格拉迪納魯團隊的第一步就是聚焦AAV9。

當病原體與宿主相互作用時，它通過演化提高自身毒力、靶向能力和生存能力。宿主數量越多，病原體就有更多演化機會，不斷出現(xiàn)的SARS-CoV-2變體就證明了這一點。格拉迪納魯指出：“這正是被我們運用于AAV9工作的經驗?！毖芯咳藛T發(fā)現(xiàn)，他們可以利用定向演化，通過重復生成、測試和選擇表現(xiàn)出特定特征（例如增強的靶向能力）的病毒載體來加快進化過程。

2010年代初，德弗曼作為博士后加入了加州理工學院格拉迪納魯團隊，并在那里開發(fā)出一條用于創(chuàng)建和測試新型AAV的管線。為創(chuàng)制新衣殼庫，德弗曼編輯了AAV基因組的一部分，其中包含一段7個氨基酸的序列，他發(fā)現(xiàn)這些氨基酸能在稍作改變后仍形成衣殼。通過編輯這一微小病毒結構，德弗曼和同事產出許多衣殼并進行測試。用德弗曼的話說，借助蛋白質工程，“可能創(chuàng)建得到的衣殼數量多過宇宙中的恒星數，雖然其中大多數無法形成衣殼，但最后成功的小部分依然數量龐大，我們永遠測試不完”。

研究團隊選擇了那些能最有效地將基因貨物遞送至大腦的理想衣殼。為針對性地選出能成功穿過血腦屏障的病毒，德弗曼將衣殼庫注射到Cre轉基因小鼠中，從它們腦組織中分離出DNA，接著對成功感染Cre表達細胞的病毒基因組進行測序，然后使用這些序列生成第二個衣殼庫，用于另一輪測試。該管線產出了多種病毒變體，但德弗曼和同事決定推進其中最成功的AAV-PHP.B，將其與AAV9作直接對比。在該實驗中，他們將綠色熒光蛋白加載到每種病毒中，再通過靜脈注射施予小鼠，然后比較綠色熒光蛋白分子在大腦中的遞送效率。結果顯示，AAV-PHP.B的基因轉移效益比標準AAV9高至少40倍。

德弗曼表示：“這讓大家對AAV-PHP.B的潛力充滿興趣?！眻F隊其他研究人員繼續(xù)開發(fā)工程化AAV——其向大腦遞送基因的效率比標準AAV提高400倍。

格拉迪納魯表示：“上述工作是我們在不了解機制的情況下設計AAV的第一章?！贝送猓麄冞€完成了AAV工程的另外幾個章節(jié)。不過難題也隨之而來。

物種特異性

當其他科學家開始使用這種新衣殼時，一個關鍵發(fā)現(xiàn)引起關注。實驗顯示，AAV-PHP.B在狨猴和恒河猴等非人靈長類動物體內的遞送效率有限，這表明衣殼與血腦屏障相互作用的方式存在潛在物種差異。此外，衣殼的高效率似乎只在C57BL/6J品系實驗小鼠身上展現(xiàn)。

德弗曼團隊和其他學者利用上述差異探究了工程AAV在C57BL/6J小鼠品系中穿過血腦屏障的機制，并發(fā)現(xiàn)一種新受體，即淋巴細胞抗原6家族成員A（LY6A）。由此可知，缺乏功能性LY6A的物種將表現(xiàn)出有限的AAV-PHP.B表達（如果有的話）。

非人靈長類動物體在演化層面與人類相似，因此是測試療法的理想模型。然而，實驗用的非人靈長類動物供應少、成本高，選擇過程需深思熟慮。當格拉迪納魯開始在非人靈長類動物身上測試病毒載體時，她仍需依賴AAV在小鼠中的定向演化。

格拉迪納魯想跳過小鼠這個中間環(huán)節(jié)，從生成衣殼庫直接邁向測試非人靈長類動物體內的工程變體，這就需要運用新方法。由于目前無法獲得Cre轉基因狨猴，因此無法使用類似的Cre驅動非人靈長類動物系統(tǒng)產生選擇壓力。于是她的團隊使用從成功進入大腦的病毒變體中收集到的下一代測序數據來構建遞送網絡。他們得到了最高效的衣殼，但并未只選擇它們進行第二輪測試，因為這類衣殼進入大腦的機制可能只適用于狨猴。在第二輪圍繞新生恒河猴（2500萬年前與人類分離）的測試中，研究團隊選用了多種AAV開展工作。

最后AAV.CAP-Mac脫穎而出。格拉迪納魯等人改進此變體，并在多種靈長類動物和培養(yǎng)的人類神經元中做進一步測試，結果顯示它在整個大腦范圍內的基因傳遞效率更高。

上述關于非人靈長類動物的研究使AAV測試離人類更近，也證明可以有傾向性地引導AAV進入大腦。格拉迪納魯團隊僅改變肽序列中的一兩個氨基酸，就使得AAV偏向內皮細胞或神經元而非肝臟。研究人員能通過提高特異性來降低劑量并減少脫靶毒性。

戴維森說道：“在我看來，真正的障礙在于，怎樣使它們完全不會靶向大腦以外的器官?！?/p>

道路規(guī)則

雖然機制未知，科學家已生成數千種新的AAV，它們在全身范圍內表現(xiàn)出不同的基因遞送特征。格拉迪納魯說道：“我們可以利用這些AAV庫來探究作用機制，這是該領域前所未有的機會?！?/p>

德弗曼將關于小鼠大腦中LY6A門戶的發(fā)現(xiàn)稱作自己團隊的轉折點?！耙牢覀冊O計的AAV穿越血腦屏障時的效率比AAV9高100倍以上，但我們不知道為什么?！痹诘玫叫掳l(fā)現(xiàn)之前，德弗曼等人不確定他們設計的衣殼是使用了與AAV9相同的受體而更好，還是能夠結合一個完全不同的受體導致。LY6A的發(fā)現(xiàn)表明，在針對衣殼開展耗時且燒錢的體內實驗前，他們能測試工程化AAV結合特定已知蛋白質的能力。

德弗曼和同事最近將這一概念轉化為高通量蛋白質檢測。為了選擇與LY6A結合的衣殼，他們將大型AAV庫與附著于純化蛋白上的磁珠懸浮液混合，并提取黏附于磁珠上的衣殼。結果如預期，他們確定了AAV-PHP.B家族的代表。德弗曼預測，他們可以使用這種方法從新靶點開發(fā)衣殼。為測試這一點，他們?yōu)長Y6家族成員C1（LY6C1，所有小鼠品系中一致表達）開發(fā)了另一種蛋白珠制劑，并發(fā)現(xiàn)了數千個結合LY6C1的序列。當他們在小鼠身上進行測試時，數百個衣殼成功進入大腦并感染神經元和神經膠質細胞。德弗曼表示：“這太棒了，它確實超出了我們的預期?！?/p>

這種方法也比較靈敏。通過體內篩選，研究人員將數千個衣殼變體丟向大腦，然后收回通過血腦屏障的衣殼。但德弗曼也指出，現(xiàn)階段AAV庫過于多樣化，很難收回每個AAV，而這就會限制重現(xiàn)性。

德弗曼表示：“如果將相同的AAV庫放入三只小鼠，就可從每只小鼠處獲得10 000個獨特序列，且?guī)缀鯖]有重疊，因為你是從數千萬個衣殼中進行采樣和抓取的?！?/p>

通過更新的方法，研究團隊不斷收到具有更大多樣性的衣殼，然后使用這些序列來訓練生成機器學習模型，從而預測更多具有相同功能的序列。德弗曼表示：“進入第二輪篩選后，我們已經可以使序列成熟，并探索比第一輪更多的內容?！?/p>

格拉迪納魯還使用新的計算和蛋白質結構預測工具來發(fā)現(xiàn)新型AAV。在探究某些具備增強大腦表達的AAV變體穿過血腦屏障的機制時，兩個目標突然出現(xiàn)：已經確定的LY6C1和另一個更不尋常的蛋白——碳酸酐酶IV（CA-IV）。

格拉迪納魯說道：“碳酸酐酶IV是人體所擁有的一種酶，在血腦屏障處含量豐富，能調節(jié)血液pH值。此外，它在演化上是保守的——老鼠有它，人類也有?！?/p>

酶上有一些位點是完全保守的，另一些位點則有顯著的序列修飾，因此根據工程化AAV的具體結合位置，它可能在不同物種之間產生相似或不同的效應。格拉迪納魯團隊想通過更先進的方法讓工程化AAV更具靶向性，于是轉向AlphaFold——一款基于人工智能的蛋白質折疊預測工具。為此，他們讓AlphaFold學習碳酸酐酶IV結合袋（binding pocket）以及工程化AAV中發(fā)現(xiàn)的肽。

格拉迪納魯說道：“AlphaFold告訴我們哪些藥物可以在嚙齒類動物、獼猴中發(fā)揮作用，而無須在人體中進行測試?！?/p>

考慮到物種特異性的潛力，在非人靈長類動物中演化的AAV可能無法在人類中很好地發(fā)揮作用。格拉迪納魯的AlphaFold預測工具和德弗曼的體外結合實驗等方法可提供信息，幫助我們開發(fā)更多人類特異性基因遞送載體和可穿過大腦的生物制劑。

科學家正更深入理解健康和病變的腦血管系統(tǒng)，而這可能為新型AAV衣殼的機制選擇提供新的靶點。此外，進入大腦只是一個障礙。科學家可以進一步設計穿越血腦屏障的衣殼以滿足各種靶向需求——只要衣殼在大腦內移動，就能實現(xiàn)更大特異性。

德弗曼說道：“在接下來幾年里，該領域將學到很多關于何種類型受體能介導AAV胞移作用的知識。我覺得我們即將取得一些重大進展?！?/p>

許多尚無有效療法的腦部疾病，包括神經退行性疾病、神經肌肉疾病和溶酶體貯積病，皆可受益于載體工程的進步。

資料來源 The Scientist

本文作者丹妮爾 · 格哈德（Danielle Gerhard）博士在耶魯大學獲得心理學和行為神經科學博士學位，并在威爾康奈爾醫(yī)學院擔任神經科學和精神病學博士后研究職位