龍本山 莫澤君 張靜瑤 彭麗沙 段麗麗 羅家駿 劉仁祥

摘要：為預(yù)測前期篩選到的可能影響煙草煙堿含量的NtABCC6L基因是否具有轉(zhuǎn)運煙堿功能，本研究采用生物信息學(xué)方法對NtABCC6L基因的啟動子序列以及編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進行分析，利用軟件對煙堿與NtABCC6L蛋白進行分子對接，并分別在煙株打頂0、7、14、21 d取根、莖、葉測定煙堿含量和NtABCC6L基因的相對表達量，以分析NtABCC6L基因表達量與煙堿轉(zhuǎn)運效率的關(guān)系。結(jié)果表明．NtBCC6L基因共編碼729個氨基酸；NtABCC6L蛋白分子量為81.29 kDa，理論pl值為8.97，含有ABC_transporter-like_ATP-bd、AB-CC_dom、ABC_2trans結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)主要由a-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，存在跨膜結(jié)構(gòu)，主要定位在細(xì)胞膜上，預(yù)測NtABCC6L是一個跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。NtABCC6L蛋白與煙堿可以通過氫鍵結(jié)合，結(jié)合能為-2.95。Nt-ABCC6L基因主要在煙草根部表達，打頂14 d表達量最高，其表達量與煙堿轉(zhuǎn)運系數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，初步推測NtABCC6L基因參與了煙堿的轉(zhuǎn)運過程。本研究結(jié)果可為進一步采用基因編輯技術(shù)明確其功能提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草；NtABCC6L基因；生物信息學(xué)分析；煙堿轉(zhuǎn)運；基因表達

中圖分類號：S572：Q786 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）04-0020-09

煙草（NicotiarLa tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟作物，煙堿是其植株體內(nèi)一種特有的生物堿，是人們吸食煙草的主要物質(zhì)。煙堿是一種在根系合成、由木質(zhì)部運輸至葉片積累的次生代謝產(chǎn)物，其轉(zhuǎn)運是一個非常復(fù)雜的過程，不僅要從根向葉進行長距離運輸，還需要借助大量的轉(zhuǎn)運蛋白，跨越根細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、根質(zhì)外體、木質(zhì)部汁液、葉質(zhì)外體、葉細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)等多個組織，實現(xiàn)胞內(nèi)和胞間運輸。如黃連素是一種異喹啉生物堿，Shitan等通過RT-PCR克隆到了編碼黃連素轉(zhuǎn)運蛋白的基因CjMDR，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達CjMDRJ后，發(fā)現(xiàn)該蛋白能將黃連素由胞外轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)：NtNUPI主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)外體的煙堿轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)內(nèi)，從而維持根部煙堿平衡：NtMATE1和NtMATE2編碼的蛋白可以把煙堿轉(zhuǎn)運至中央液泡中。煙堿轉(zhuǎn)運還受轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)調(diào)控。有研究表明，NtMYC2a可以與MYC相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子bHLH的同源物形成功能復(fù)合體來調(diào)控?zé)焿A的轉(zhuǎn)運，起到一個“總開關(guān)”的作用。另外，Mo等利用蛋白質(zhì)組學(xué)和共表達網(wǎng)絡(luò)分析揭示出中樞蛋白在煙堿轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用，并篩選到一些可能與煙堿轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白（GST，ABCE2，ABCF1和SLY1）。但這些蛋白在煙堿轉(zhuǎn)運過程中的功能并未得到進一步驗證，還需進行深入挖掘和驗證研究。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白是一類功能多樣的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，可直接利用水解ATP供能，實現(xiàn)對植物次生代謝物的跨膜轉(zhuǎn)運。ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)主要包含2個部分，分別是水解ATP的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ nucleotide binding domain，NBD）和提供轉(zhuǎn)運途徑的含有多個a-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane doman，TMD）。NBD位于膜的胞質(zhì)面，可以結(jié)合底物并水解ATP產(chǎn)生能量為轉(zhuǎn)運底物提供動力；TMD則是利用NBD釋放的能量選擇底物并進行跨膜運輸，兩者相輔相成共同實現(xiàn)了ABC轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運功能。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的不同，可以將大多數(shù)真核生物的ABC轉(zhuǎn)運蛋白分為8個主要亞家族（A-H），其中ABCG轉(zhuǎn)運蛋白是ABC家族中成員數(shù)量最多的亞家族。根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，植物ABCG蛋白又分為WBC和PDR兩個亞家族，其中，WBC為半分子ABC蛋白，必須與自身或者其他本家族的成員形成同源或異源二聚體才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運功能：而PDR為全分子ABC蛋白，可直接發(fā)揮轉(zhuǎn)運功能。ABCG轉(zhuǎn)運蛋白還有結(jié)構(gòu)域類型為NBD-TMD的反向序列，可區(qū)別于其他亞家族。ABCG轉(zhuǎn)運蛋白是植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白研究的熱點家族，在次生代謝物如萜類物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)物和金屬離子運輸中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）SmABCGl具有從胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運丹參酮ⅡA的作用；梅花PmABCG9能轉(zhuǎn)運苯甲醇；桃PpABCG14可以轉(zhuǎn)運細(xì)胞分裂素；AtABCG30/40具有轉(zhuǎn)運脫落酸（ABA）的作用；皺葉煙草NpPDRl參與香紫蘇醇的轉(zhuǎn)運過程；忽地笑（Lycoris aurea）LaABCG3和LaABCG5基因受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)上調(diào)表達，并且生物堿含量也相應(yīng)增加，表明這兩個基因可能參與生物堿的積累和轉(zhuǎn)運；NtWBC13轉(zhuǎn)運蛋白具有吸收體外煙堿的能力，在煙草根中起到積累或收集煙堿的作用。

本課題組前期對不同煙堿含量的煙草材料進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析時，篩選到可能影響煙堿含量的NtABCG6L蛋白（登錄號：AOAIS3X176）。該蛋白為ABC轉(zhuǎn)運蛋白G家族成員，推測NtABCG6L基因可能具有與煙堿轉(zhuǎn)運相關(guān)的功能。本研究利用生物信息學(xué)方法對NtABCG6L的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能進行預(yù)測，并分析該基因在煙草打頂不同時間、不同器官中的差異表達，以及其表達量與煙堿轉(zhuǎn)運效率的相關(guān)性，以期為進一步驗證和明確該基因的煙堿轉(zhuǎn)運功能提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料種植與樣品采集

供試煙草品種為K326，2022年2月26日播種，4月20日移栽，種植于貴州大學(xué)煙草科研基地（安順市楊武鄉(xiāng)）。選取土地平整、肥力均勻的地塊作為試驗地，將其劃分為3個小區(qū)，每個小區(qū)種植4行，每行15株，株距0.55 m，行距1.20 m。田間管理參照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)執(zhí)行。

分別在6月23日打頂當(dāng)天（打頂前）及打頂后7、14、21d，每個小區(qū)選3株長勢一致的煙株，采集根、莖、葉樣品，部分鮮樣迅速于液氮中凍存，帶回實驗室-80℃保存：剩余樣品105℃殺青30min，然后75℃烘干。

1.2NtABCG6L生物信息學(xué)分析

利用在線軟件對NtABCG6L蛋白進行理化性質(zhì)分析、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、信號肽分析、互作蛋白預(yù)測、蛋白質(zhì)磷酸化預(yù)測、亞細(xì)胞定位預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)和啟動子作用元件分析。通過NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和茄科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics.net）進行Blastp比對，挑選20種同源性較高的物種，下載其氨基酸序列，使用DNAMAN對煙草和這些物種的氨基酸序列進行多重比較，并用MEGA 11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。本研究所用軟件名稱及其相關(guān)信息見表1。

1.3NtABCG6L蛋白與煙堿的分子對接

分別在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫（www.uniprot.org）和ZINC數(shù)據(jù)庫（zinc.docking.org）下載NtABCG6L（AOAIS3X176）的pdb格式文件和煙堿（ZINC391812）的m012格式文件，導(dǎo)入Autodock軟件，加氫、去水分子后將兩者進行對接驗證，根據(jù)配體-蛋白對接模型的最低結(jié)合能判斷成分與靶點的親和能力，利用Discovery Studi0 4.5 Visualizer軟件將對接結(jié)果進行可視化。

1.4NtABCG6L基因表達量及煙堿含量測定

分別將凍存的煙草根、莖、葉鮮樣用滅菌預(yù)冷的研缽磨碎，利用RNA提取試劑盒（KK Fast Plant Total RNA Kit，莊盟生物公司）提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing cDNA，天根生化科技公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，所用引物見表2。PCR反應(yīng)體系（20 uL）：2xtalent qPCR PreMix 10uL，10 umol/L qABCG6L-F引物0.6 uL，10umol/L qABCG6L-R引物0.6 uL，cDNA模板1uL，RNase-Free ddH20 7.8 uL。PCR擴增程序：95℃3 min；95℃5 s，57℃10 s，72℃15 s，40個循環(huán)。以L25基因作為內(nèi)參計算Ct值，采用2-△△Ct法計算NtABCG6L基因的相對表達量。每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。

煙堿含量測定參考《煙草化學(xué)》的紫外分光光度法。煙堿轉(zhuǎn)運系數(shù)為煙葉煙堿含量與根部煙堿含量的比值。

2結(jié)果與分析

2.1NtABCG6L生物信息學(xué)分析

2.1.1蛋白理化性質(zhì)分析 如表3所示，NtAB-CG6L基因共編碼729個氨基酸，分子式為CX84H5714N97001W8S29，原子總數(shù)11 445個，pl值為8.97，分子量為81.29 kDa，脂肪系數(shù)為89.20，不穩(wěn)定系數(shù)為41.26，為不穩(wěn)定蛋白。NtABCG6L蛋白中絲氨酸（Ser）的含量最高，有76個，占比10.4%；其次是亮氨酸（Leu），有71個，占9.7%；半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）含量較低，均低于10個。帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）數(shù)和帶正電荷的殘基（Arg+Lys）數(shù)分別為61個和69個。從親／疏水性分析結(jié)果（圖1）看，該蛋白序列中第589位氨基酸疏水性最高，分值為3.100，而親水性最高的氨基酸分值為-2.878，處于第544位，平均親水系數(shù)（GRAVY）為0.013，且疏水性氨基酸數(shù)大于親水性氨基酸數(shù)，因此NtABCG6L屬于疏水性蛋白。潛在的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果（圖2）表明，NtABCG6L蛋白具有多個磷酸化位點，包括60個絲氨酸（senne）位點、25個蘇氨酸（threonine）位點以及7個酪氨酸（tyrosine）位點。預(yù)測到NtABCG6L蛋白主要被絲／蘇氨酸蛋白激酶（CK1、CK2、CaM、GSK3）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）等磷酸化，從而參與煙草的各種生理生化過程。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，NtABCG6L蛋白不含有信號肽，屬于非分泌型蛋白。

2.1.2保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測 結(jié)果（圖3）顯示，NtABCG6L蛋白存在ABC_transporter-Iike_ATP-bd、ABC_2_Uans等典型的ABC家族保守結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白屬于ABC超家族：還存在1個ABCG_dom結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于多個ABCG家族成員中，且為NBD-TMD的反向序列，說明該蛋白屬于ABCG亞家族成員。NtABCG6L蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域由6個d螺旋結(jié)構(gòu)組成。以上分析表明，NtABCG6L為NBD-TMD型的半分子ABCG跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。

2.1.3蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu) NtABCG6L蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖4A）主要由a-螺旋（alpha helix）和無規(guī)則卷曲（random coil）組成，分別占39.78qo和40.88%，延伸鏈（extended strand）和B轉(zhuǎn)角（beta turn）分別占12.62%和6.72%．NtABCG6L蛋白的三級結(jié)構(gòu)如圖4B所示，其內(nèi)部多個a-螺旋聚在一起形成較大的跨膜結(jié)構(gòu)域，還有由B-折疊、a-螺旋、無規(guī)則卷曲等形成的NBD結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，推測該蛋白通過NBD與底物結(jié)合并釋放能量，經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)通道進行運輸。

2.1.4亞細(xì)胞定位及互作蛋白預(yù)測分析 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NtABCG6L定位于細(xì)胞膜，表明該蛋白是跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。對NtABCG6L的互作蛋白進行預(yù)測，結(jié)果（圖5）共預(yù)測到10條與之可能存在互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的蛋白。其中AOAIS487Y3和AOAIS4D7E7是得分（均為0.905）最高的互作蛋白，通過Unipro數(shù)據(jù)庫查詢得知這兩個蛋白均來源于煙草，且屬于半分子ABCG家族的轉(zhuǎn)運蛋白，因此推測NtABCG6L蛋白可能通過與AOAIS487Y3或AOAIS4D7E7形成異源二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)運功能。

2.1.5順式作用元件預(yù)測分析 以NtABCC6L基因起始密碼子上游672 bp啟動子序列，利用PlantCARE對其順式作用元件進行分析，結(jié)果（表4）顯示，其啟動子區(qū)含有響應(yīng)干旱、低溫等非生物脅迫的作用元件（MYB和LTR），以及部分光響應(yīng)元件（GATA-motif、I-box）。成熟期低溫易造成煙堿含量增高，干旱也會使得煙堿含量發(fā)生顯著變化。據(jù)此推測煙草植株在干旱或低溫脅迫下NtABCG6L基因表達會發(fā)生變化，進而影響煙堿轉(zhuǎn)運。

2.1.6系統(tǒng)進化分析 由于煙草屬于茄科作物，因此在茄科數(shù)據(jù)庫下載了番茄、辣椒、馬鈴薯、咖啡、茄子的蛋白序列文件，利用TBtools將其與NtAB-CC6L蛋白序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)這些物種中均存在NtABCC6L的同源序列。用DNAMAN進行多序列比對，結(jié)果（圖6）顯示，茄子、馬鈴薯、番茄、辣椒的這些序列與NtABCG6L的序列相似性較高，分別為88.09%、88.09%、87.96%、86.60%，咖啡的序列與NtABCG6L序列相似度為74.83%。進一步對NtABCC6L蛋白和其他物種的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖7）顯示，親緣關(guān)系最近的是擬絨毛煙草和漸狹葉煙草，其次是茄子、馬鈴薯、番茄和辣椒。

2.2NtABCG6L蛋白與煙堿分子結(jié)合模式分析

為進一步驗證NtABCG6L蛋白是可以轉(zhuǎn)運煙堿的，下載NtABCG6L蛋白與煙堿分子的pdb文件，利用Autodock軟件進行分子對接，分析二者結(jié)合模式。結(jié)果（圖8）顯示，ABCG6L與煙堿的活性結(jié)合位點由3個核心氨基酸組成，Lys28、Arg29、Lys729與煙堿吡啶環(huán)形成2個Ⅱ鍵、1個鹽橋，Arg29與煙堿吡啶環(huán)上的氮原子形成氫鍵，Lys729與煙堿吡咯環(huán)上的氨基氫形成1個鹽橋，總結(jié)合能為-2.95。表明NtABCG6L蛋白與煙堿可通過1個氫鍵、2個鹽橋和2個Ⅱ鍵產(chǎn)生的結(jié)合力相互結(jié)合。推測NtABCG6L蛋白通過核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與煙堿結(jié)合，進而跨膜轉(zhuǎn)運煙堿。

2.3NtABCG6L基因表達的組織特異性及其與煙堿轉(zhuǎn)運的關(guān)系分析

結(jié)果（圖9）顯示，從打頂當(dāng)天（0d）到打頂后21d，煙株根系煙堿含量較高且呈下降趨勢，葉片煙堿含量呈上升趨勢，莖煙堿含量較低且變化較?。粺焿A轉(zhuǎn)運系數(shù)在打頂后也逐漸增加。表明，煙堿是在煙株根系合成的，打頂后有明顯的轉(zhuǎn)運，即從根系向葉片轉(zhuǎn)運積累，而莖提供運輸渠道，并未存儲煙堿。

NtABCG6L基因在打頂當(dāng)天和打頂后7、14、21 d的煙株根中的表達量顯著高于莖和葉中（P<0.01），而在莖、葉中的表達量差異不顯著（圖10），說明該基因具有組織表達特異性。對4個時期的煙堿轉(zhuǎn)運系數(shù)和根系NtABCG6L基因表達量進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖11）顯示，兩者間具有顯著的線性正相關(guān)關(guān)系，R2值為0.943，P<0.05。說明在一定的條件范圍內(nèi)，NtABCG6L基因在煙株根系中的表達量增加能夠增強煙堿的轉(zhuǎn)運，據(jù)此推測NtABCG6L基因主要在煙草根部發(fā)揮轉(zhuǎn)運煙堿的功能。

3討論與結(jié)論

煙草是一種嗜好性經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。煙堿是煙葉中最重要的化學(xué)成分，其含量是衡量煙草和卷煙質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，是煙草商品價值的主要體現(xiàn)，其含量調(diào)控機制一直是煙草學(xué)科研究的重點之一。調(diào)控?zé)焿A的轉(zhuǎn)運是調(diào)控?zé)熑~煙堿含量的途徑之一。

ABCG家族是ABC轉(zhuǎn)運蛋白中最為龐大的亞家族，已經(jīng)在擬南芥、亞麻、水稻、玉米、葡萄和番茄等基因組中分別鑒定出43、85、50、54、71、70個ABCG基因，在煙草基因組中則鑒定到了134個ABCG基因。前人研究發(fā)現(xiàn)ABCG基因在代謝物轉(zhuǎn)運方面起重要作用。如甘藍型油菜（Brassica napus L）的BnABCG8可能參與脂質(zhì)的運輸，調(diào)控植物的生長發(fā)育；蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）的MtABCGIO負(fù)責(zé)4-香豆酸和甘草素的膜轉(zhuǎn)運；螺旋藻（Spirulina）的SpTR2參與香紫蘇醇的運輸；青蒿（Artemisia caruifolia）的AaPDR3轉(zhuǎn)運倍半萜烯B-石竹烯；長春花（Catharanthus roseus）的CrTPT2介導(dǎo)長春堿向葉片表面分泌。另有研究表明，煙草打頂后各部位煙堿含量均顯著升高，其中葉片增加程度最大，說明打頂后煙堿的轉(zhuǎn)運更強。本研究結(jié)果表明，打頂后煙草根中的煙堿含量顯著下降，莖中的煙堿含量變化較小，葉中的煙堿含量顯著增加。這與前人的研究結(jié)果不完全一致，可能是打頂時期以及生態(tài)條件不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，煙堿轉(zhuǎn)運系數(shù)與NtABCG6L基因在煙株根中的表達量呈顯著線性正相關(guān)關(guān)系，表明NtABCG6L基因表達量越高，煙堿的轉(zhuǎn)運越強，而且NtABCG6L蛋白與煙堿分子能夠相互結(jié)合，因此推測NtABCG6L基因參與了煙堿的轉(zhuǎn)運，但具體轉(zhuǎn)運機制尚需深入研究。

綜上，本研究結(jié)果表明，NtABCG6L基因共編碼729個氨基酸：其編碼蛋白具有ABCG亞家族典型的結(jié)構(gòu)域ABC_transporter-Iike_ATP-bd．ABC_2_trans、ABCG_dom，屬于ABCG家族，能通過氫鍵與煙堿結(jié)合，定位于細(xì)胞膜，存在跨膜結(jié)構(gòu)，且具有多個磷酸化位點：打頂前后NtABCG6L主要在煙草根部高度表達，表達量與煙堿轉(zhuǎn)運系數(shù)呈顯著線性正相關(guān)關(guān)系，說明該基因可能主要在根部發(fā)揮轉(zhuǎn)運煙堿的功能。后續(xù)將通過創(chuàng)制該基因過表達和敲除突變體來進一步驗證NtABCG6L基因的功能。

作者貢獻：龍本山是實驗設(shè)計和實驗研究的執(zhí)行人：龍本山、莫澤君及羅家駿完成數(shù)據(jù)分析和論文初稿的寫作：張靜瑤、彭麗莎及段麗麗參與實驗設(shè)計和實驗結(jié)果分析；劉仁祥是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。