安雪姣 楊蘭 文彬 陳利鋼

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202308024

安雪姣， 楊蘭， 文彬， 等， 2024.

‘曼賽龍柚種子不同發(fā)育期高溫耐性研究 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（5）： 961-971.

AN XJ， YANG L， WEN B， et al.， 2024.

High-temperature tolerance of Citrus maxima ‘Mansailong seeds at different developmental stages ［J］.

Guihaia， 44（5）： 961-971.

摘? 要：? 全球變暖導(dǎo)致極端高溫頻發(fā)，植物種子不可避免地置身于高溫脅迫環(huán)境之中。為探究種子高溫耐性的生理基礎(chǔ)，該文以中間型種子‘曼賽龍柚（Citrus maxima ‘Mansailong）為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)不同發(fā)育階段的種子進(jìn)行高溫處理，并同步檢測(cè)各個(gè)發(fā)育時(shí)期種子的形態(tài)變化、可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量以及細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：（1）在花后23周到49周的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，種子含水量明顯降低，鮮重顯著增加，干重與鮮重的百分比也有明顯的提高，這些指標(biāo)均是在花后31周前后快速變化，到花后41周趨于穩(wěn)定。（2）種子在花后29周獲得完全的成苗能力和初步的高溫耐性，此后高溫耐性逐漸增加，并在花后37～49周之間快速提高。與種子高溫耐性的變化相似，種子中可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量在花后23～49周均呈連續(xù)升高趨勢(shì)，相關(guān)性分析表明在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中這兩者的積累與種子的高溫耐性呈顯著正相關(guān)。（3）超顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著種子的發(fā)育，線粒體逐漸減少，胚軸細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞中脂質(zhì)體逐漸增多并且排列趨于規(guī)則，同時(shí)液泡由小變大且后期的液泡中充斥著黑色絮狀物。綜上所述，‘曼賽龍柚種子在花后41周達(dá)到生理成熟，沒(méi)有明顯的成熟脫水過(guò)程；其高溫耐性是在發(fā)育過(guò)程中獲得并逐漸提高，直到種子發(fā)育的后期；種子中可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量的增加及細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的變化對(duì)種子高溫耐性的發(fā)育具有重要貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞： 高溫脅迫， 中間型種子， 細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)， 可溶性蛋白， 熱穩(wěn)定蛋白， 種子發(fā)育

中圖分類號(hào)：? Q944.59

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2024）05-0961-11

收稿日期：? 2023-10-11? 接受日期： 2023-11-20

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（31971573）。

第一作者： 安雪姣（1996—），碩士研究生，主要從事種子生物學(xué)研究，（E-mail）anxuejiao@xtbg.ac.cn。

*通信作者：? 文彬，博士，研究員，主要從事保護(hù)生物學(xué)和種子生物學(xué)研究，（E-mail）wenb@xtbg.org.cn。

High-temperature tolerance of Citrus maxima

‘Mansailong seeds at different developmental stages

AN Xuejiao1，2， YANG Lan1， WEN Bin1*， CHEN Ligang1

（ 1. CAS Key Laboratory of Tropical Plant Resources and Sustainable Use， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of

Sciences， Mengla 666303， Yunnan， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China ）

Abstract：? The seeds are invariably exposed to high-temperature conditions since global warming frequently causes abnormally high temperature. In order to investigate the physiological basis of high-temperature tolerance in seeds， we used intermediate Citrus maxima ‘Mansailong seeds as the research material， heated the seeds at different developmental stages， and simultaneously detected changes in seed morphology， contents of soluble protein and heat-stable protein， and cellular ultrastructure. The results were as follows： （1） The seed moisture content dramatically dropped between 23 and 49 weeks after flowering （WAF）， whereas the percentage of DW/FW and fresh weight increased significantly. All of these indicators began to change quickly from 31 WAF and stabilized around 41 WAF. （2） At 29 WAF， the seeds acquired full seedling formation ability and a preliminary tolerance to high temperature; from there， the high-temperature tolerance gradually grew and improved quickly between 37 and 49 WAF. The improvement in high-temperature tolerance was accompanied by a steady increase in? contents of soluble protein and heat-stable protein of seeds， from 23 to 49 WAF. The results of the correlation analysis showed a substantial positive correlation between the accumulation of heat-stable? protein and soluble protein and the ability of seeds to tolerate high temperature. （3） Ultrastructural observation showed that the number of mitochondria progressively dropped as the seed developed， the volume of the embryonic axis cells gradually decreased， and the number of lipid bodies in the cells gradually rose and their arrangement became more and more regular. In addition， the vacuoles enlarge at the same time， and at a later stage， they were packed with black floccules. In conclusion， the C. maxima ‘Mansailong seeds reach physiological maturity at 41 WAF without any noticeable maturation drying; the ability to tolerate high temperature is acquired during seed development and is further enhanced until a later stage; changes in cellural ultrastructure and an increase in contents of soluble? protein and heat-stable protein of seeds are essential in helping the seeds develop their high-temperature tolerance.

Key words： high-temperature stress， intermediate seeds， cellular ultrastructure， soluble protein， heat-stable protein， seed development

種子發(fā)育是植物個(gè)體發(fā)育的最初階段，對(duì)外界環(huán)境條件極為敏感，種子發(fā)育的好壞，不僅影響種子本身的品質(zhì)，同時(shí)也可能影響到下一代的生長(zhǎng)發(fā)育（毛培勝等，2001）。隨著全球變暖，高溫和極端高溫天氣愈加頻繁，植物不可避免地被置身于高溫環(huán)境中，種子發(fā)育也會(huì)受到高溫脅迫。種子在發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷高溫對(duì)其質(zhì)量和產(chǎn)量都會(huì)產(chǎn)生極大影響，如水稻種子在發(fā)育過(guò)程中暴露于高溫中一段時(shí)間，會(huì)對(duì)其壽命、含水量、發(fā)芽能力等產(chǎn)生極大的影響（Rahman & Ellis， 2019）。高桂珍（2015）比較了具有不同高溫耐性的油菜種子，發(fā)現(xiàn)高溫處理后種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均與單株產(chǎn)量和全株干重成極顯著正相關(guān)，發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率與產(chǎn)量和千粒重呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明種子的耐熱性與植株的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，植物生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)好、產(chǎn)量高，種子的耐熱性也強(qiáng)。

目前，關(guān)于種子不同發(fā)育期高溫耐性的研究還很匱乏，但很顯然種子的高溫耐性與其脫水耐性密切相關(guān)，我們從種子的脫水耐性研究中可以得到許多啟示。種子的高溫耐性可能在發(fā)育過(guò)程中逐步獲得，不同發(fā)育階段的種子具有不同的高溫耐性。同時(shí)，不同儲(chǔ)藏特性的種子具有不同的發(fā)育模式：正常性種子在發(fā)育后期經(jīng)歷成熟脫水，細(xì)胞代謝活動(dòng)減弱，出現(xiàn)細(xì)胞脫分化現(xiàn)象，同時(shí)大量積累熱穩(wěn)定蛋白和可溶性蛋白（Prieto-Dapena et al.， 2006），在發(fā)育的最后階段，干物質(zhì)積累停止，含水量急劇下降；而在頑拗性種子的發(fā)育過(guò)程中，干物質(zhì)持續(xù)積累，直到脫落時(shí)種子仍保持很高的含水量（Bewley et al.， 2013）?？扇苄缘鞍讓?duì)種子萌發(fā)也很重要，其含量增加不僅能夠使種子保持較低的滲透勢(shì)，利于種子吸水萌發(fā)，而且會(huì)增強(qiáng)種子對(duì)逆境的適應(yīng)能力（秦堯等，2022）?？扇苄缘鞍自诿{迫條件下具有保護(hù)生物膜和大分子的作用，對(duì)種子的抗逆性獲得至關(guān)重要（Wehmeyer et al.， 1996；Trk et al.， 2001），其中與種子的高溫耐性具有密切聯(lián)系的是熱穩(wěn)定蛋白（黎茵等，2010）。如秦堯等（2022）對(duì)正常性的菜豆種子高溫耐性的研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度水楊酸處理可以提高其可溶性蛋白的含量，同時(shí)增加了其高溫耐性。相反，原產(chǎn)于熱帶雨林中的頑拗性種子，在發(fā)育后期可能缺少熱穩(wěn)定蛋白或熱穩(wěn)定蛋白積累不夠（Farrant et al.， 1992），其抗逆性明顯不足，并且隨著萌發(fā)的啟動(dòng)，種子的熱穩(wěn)定蛋白含量逐漸減少，其高溫耐性也逐步降低（Burke & O′Mahony， 2001）。據(jù)此我們推測(cè)，種子高溫耐性的獲得與種子發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝活性及保護(hù)性蛋白質(zhì)合成有關(guān)。

柚（Citrus maxima）是著名的熱帶亞熱帶水果，栽培廣、產(chǎn)量大、耐貯藏，我國(guó)的種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。我國(guó)是柚的起源中心和分布中心，具有豐富的種質(zhì)資源和悠久的種柚歷史（沈德緒等，1998）。前期的研究表明，‘曼賽龍柚種子是中間型種子（Wen et al.， 2010），雖然在脫水耐性方面與正常性種子比較靠近，其高溫耐性卻與頑拗性種子比較相近，但又不完全相同，因此具有一定的特殊性（An et al.， 2023）。本文通過(guò)研究發(fā)育過(guò)程中‘曼賽龍柚種子高溫耐性的變化，探討‘曼賽龍柚種子高溫耐性形成的生理機(jī)制，為今后制定抗高溫技術(shù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用在西雙版納廣為栽培的‘曼賽龍柚（Citrus maxima ‘Mansailong），其花期大致在每年1月中旬至3月下旬，果實(shí)成熟期10月中旬（楊坤，2001）。有研究表明，‘曼賽龍柚種子在花后180天達(dá)到生理成熟，完成形態(tài)建成并獲得發(fā)芽能力（薛鵬和文彬，2015）。我們觀測(cè)到，2022年西雙版納熱帶植物園經(jīng)濟(jì)推廣站果園‘曼賽龍柚的集中開(kāi)花時(shí)間在1月6日前后。據(jù)此，從2022年6月至12月，以花后周數(shù)標(biāo)記種子的發(fā)育，每?jī)芍芤淮螐脑摴麍@選擇大小、顏色相近的果實(shí)，采摘10～15個(gè)，去掉果皮果肉以及外種皮，獲得近1 300粒種子。在完成千粒重、含水量等基本數(shù)據(jù)的收集后，其余種子一部分用于高溫耐性評(píng)價(jià)，另一部分用于細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)觀察和蛋白分析。

1.2 方法

1.2.1 種子基本參數(shù)的測(cè)定? 種子鮮重測(cè)定： 隨機(jī)取出100粒種子稱重，重復(fù)10次，取平均值。

種子含水量測(cè)定： 按照國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程（ISTA， 1996），隨機(jī)取1粒種子，重復(fù)8次，放入（103±2） ℃的烘箱中烘（17±1） h。以種子鮮重為基礎(chǔ)表示含水量，即含水量（%）=（鮮重-干重）/鮮重×100。

種子生命力測(cè)定： 按發(fā)芽端朝上的方式，將種子播種在含1%瓊脂的培養(yǎng)皿中，每皿25粒種子為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。每周定期觀測(cè)并記錄萌發(fā)情況，胚根伸出約0.5 cm為萌發(fā)或存活，形成形態(tài)正常的幼苗為成苗。萌發(fā)期為1個(gè)月左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢查未萌發(fā)種子是否腐爛。用最終發(fā)芽率與成苗率來(lái)衡量種子的生命力。

1.2.2 不同發(fā)育時(shí)期種子的高溫耐性評(píng)價(jià)

前期的研究表明，在30 ℃條件下，‘曼賽龍柚種子萌發(fā)率最高、發(fā)芽速度最快，是其萌發(fā)的最適溫度；在40 ℃條件下其萌發(fā)受到了嚴(yán)重的抑制（An et al.， 2023），而西雙版納地區(qū)空曠地地表溫度經(jīng)常達(dá)到或超過(guò)40 ℃（劉文杰等，2000），因此采用40 ℃的連續(xù)性高溫處理評(píng)價(jià)種子的高溫耐性，具體做法如下：將種子播種在含有1%瓊脂的培養(yǎng)皿中，置于40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中高溫處理不同時(shí)間。高溫處理完成后，取出放在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按前述方法定期觀測(cè)并記錄萌發(fā)與成苗情況。在40 ℃高溫處理的最長(zhǎng)時(shí)間依種子的發(fā)育階段不同，從12 h到1 032 h。依據(jù)高溫處理后種子的存活率和成苗率變化評(píng)價(jià)不同發(fā)育階段種子的高溫耐性。

1.2.3 可溶性和熱穩(wěn)定蛋白的測(cè)定

提?。?從上述不同發(fā)育時(shí)期的‘曼賽龍柚種子中取10～20粒種子，用鑷子剝?nèi)シN皮，切碎，放入冷凍管中，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前，取約0.1 g（鮮重）的樣品，置于研缽中，加入0.5 mL PBS緩沖液，冰浴勻漿后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，再用0.5 mL PBS緩沖液沖洗研缽并轉(zhuǎn)移至離心管中。充分混勻后，在4 ℃下15 000 g離心2次，每次15 min。收集上清液約400 μL，一半用作可溶性蛋白測(cè)定。另一半在95 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，冷卻后在4 ℃下15 000 g低溫離心15 min，收集上清液并用作熱穩(wěn)定蛋白分析（Thierry et al.， 1999）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： 根據(jù)Bradford（1976）的考馬斯亮藍(lán)法，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量（陳美林等，2018）。稱取50 mg牛血清蛋白，加入PBS溶解并定容至50 mL，配制為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，再用PBS溶液稀釋成蛋白量濃度分別為0、100、200、400、600、800、1 000 μg·mL-1，然后加入考馬斯亮藍(lán)G-250染液在595 nm處測(cè)定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定： 可溶性蛋白按25 μL樣品加入75 μL提取液進(jìn)行稀釋，再加入0.5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻后靜置5～20 min，用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)定吸光值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算種子中的蛋白含量。熱穩(wěn)定蛋白則按50 μL樣品加同等的提取液稀釋，再加入0.5 mL的考馬斯亮藍(lán)染液混勻，靜置5～20 min，用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.2.4 不同發(fā)育時(shí)期種子胚軸細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)觀察

種子最重要的使命是萌發(fā)和發(fā)育成幼苗，而胚軸是種子最重要組成部分，是種子能否發(fā)育成為正常幼苗的關(guān)鍵部位。種子在受到逆境脅迫時(shí)，胚軸受到傷害最容易導(dǎo)致喪失活力（Priestley， 1986； 程紅焱等，1991）。前人關(guān)于種子超顯微結(jié)構(gòu)的研究也經(jīng)常是以胚（對(duì)胚比較小的種子）或胚軸（對(duì)胚比較大的種子）開(kāi)展的，如玉米（Wen et al.， 2009）和蒲葵（Wen，2011）。為此，從上述不同發(fā)育時(shí)期的‘曼賽龍柚種子中取5粒種子作為樣品，用解剖刀和鑷子去除種皮并切下種子包含胚軸的尖端。取3 mL電鏡固定液對(duì)樣品進(jìn)行固定并保存在4 ℃下備用。在電鏡觀察前需要先制作超薄切片，切取約1 mm的胚根組織，用3.5%戊二醛和1%的鋨酸固定，用丙酮逐級(jí)脫水后將材料放進(jìn)環(huán)氧樹(shù)脂中包埋1周。材料處理好后先切成半薄切片，于光學(xué)顯微鏡下篩選出完好的樣品制作超薄切片（王若蘭等，2014）。將制作好的超薄切片用檸檬酸鉛和醋酸鈾染色后放電鏡下觀察。研究細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器發(fā)育變化對(duì)種子高溫耐性的影響。

1.2.5? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)并計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤，使用Origin 2023制作圖表。使用SPSS 22.0在P＜0.05水平上進(jìn)行單因素方差分析。通過(guò)Probit analysis計(jì)算種子50%致死率時(shí)的高溫處理時(shí)長(zhǎng)，以評(píng)價(jià)種子的高溫耐性。

2? 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)育過(guò)程中鮮重、干鮮重比和含水量的變化

花后23～49周的‘曼賽龍柚種子，其鮮重、干鮮重比以及含水量存在顯著變化和階段性特點(diǎn)（圖1）。在花后23～35周，種子鮮重顯著增加，隨后在37周開(kāi)始降低并保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。種子含水量在花后23周、25周和27周維持在一個(gè)很高的水平（82%左右），從花后29周到39周含水量顯著降低（P<0.05），下降速度迅猛，平均每周降低2.8%，從41周開(kāi)始維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平（約42%）。種子干鮮重比在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出從上升到穩(wěn)定的變化，花后23～27周種子的干鮮重比保持在17%左右，此后至41周呈逐漸上升的趨勢(shì)，到花后41周時(shí)種子的干鮮重比達(dá)57%，增加了近39%，此后趨于穩(wěn)定。以上結(jié)果說(shuō)明，‘曼賽龍柚種子在花后41周前后達(dá)到生理性成熟，并且在此之后種子的含水量趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定在42%左右。種子成熟時(shí)含水量依然很高，說(shuō)明該種子沒(méi)有成熟脫水過(guò)程。

所有數(shù)據(jù)為10個(gè)或8個(gè)重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

All data are expressed as x ±sx of 10 or 8 replicates.

2.2 種子發(fā)育過(guò)程中高溫耐性的變化

不同發(fā)育階段的種子對(duì)40 ℃連續(xù)高溫的耐受性差異極大。在發(fā)育早期，種子的高溫耐性極差，如開(kāi)花后23周時(shí)種子已經(jīng)具有發(fā)芽的能力，此時(shí)有43%的發(fā)芽率，但不能形成幼苗，即使不經(jīng)過(guò)高溫處理的種子也不能成苗。直到花后27周才具有成苗的能力，在適宜溫度條件下（30 ℃）有15%的種子可以萌發(fā)成苗，但經(jīng)過(guò)12 h高溫處理后成苗率降低到不足4%，處理24 h后種子全部死亡?；ê?9周的種子成苗率達(dá)到90%，并且在高溫處理90 h后種子才完全失去活力，此階段的種子已經(jīng)具有初步的高溫耐性。之后隨著種子的成熟其高溫耐性逐漸增強(qiáng)，花后49周的種子經(jīng)過(guò)600 h的高溫處理后，成苗率仍高達(dá)84%（圖2）。

經(jīng)過(guò)高溫處理后種子的存活率和成苗率分別在花后25周和29周超過(guò)50%。因此，分別以存活率和成苗率為基礎(chǔ)，使用概率單位回歸分析，分別計(jì)算了此后階段的‘曼賽龍柚種子在40 ℃高溫下經(jīng)歷連續(xù)高溫處理的半致死時(shí)間。隨著種子的發(fā)育，種子耐受高溫處理的半致死時(shí)間逐漸延長(zhǎng)?；ê?5～31周高溫處理半致死時(shí)間從8 h增加到111 h，平均每周增加18 h?；ê?1～37周增長(zhǎng)緩慢，平均每周增加6 h。從花后39周到41周是種子高溫耐性提高最快的階段，種子半致死時(shí)間直線提升，僅兩周時(shí)間種子的半致死時(shí)間增加296 h。之后高溫耐性仍逐漸升高，至最后一個(gè)階段種子的半致死時(shí)間增加到近800 h?；ê?9周及之前，根據(jù)存活率和成苗率計(jì)算出來(lái)的高溫處理半致死時(shí)間幾乎沒(méi)有差別，花后39周及之后，僅出現(xiàn)較小的差別（圖3）。

所有數(shù)據(jù)為6重復(fù)×25粒種子的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，下同。WAF表示開(kāi)花后周數(shù)，下同。

All data are expressed as x ±sx of 6 replicates of 25 seeds， the same below. WAF indicates the weeks of after flowering， the same below.

2.3 種子發(fā)育過(guò)程中可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量的變化

由于不同發(fā)育階段的種子含水量差異很大，因此需要以干重為基礎(chǔ)來(lái)計(jì)算發(fā)育過(guò)程中種子的可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白的含量。由圖4可知，隨著種子的發(fā)育，其可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量呈上升的趨勢(shì)，其中花后25～31周是可溶性蛋白的快速積累期，在此期間，可溶性蛋白含量從7.21 mg·g-1增加到38.35 mg·g-1，平均每周增加5.19 mg·g-1，差異顯著（P<0.05）。之后積累速度變慢，每周僅增加0.67 mg·g-1，相鄰各階段無(wú)顯著性差異。熱穩(wěn)定蛋白含量變化的總體趨勢(shì)與可溶性蛋白相似，花后25～31周也是熱穩(wěn)定蛋白的快速積累期，熱穩(wěn)定蛋白含量上升趨勢(shì)明顯，增加了18.77 mg·g-1（P<0.05），花后35～45周熱穩(wěn)定蛋白含量無(wú)顯著性變化，花后47周增加了4.62 mg·g-1（P<0.05），隨后保持不變。因此，花后25～31周是種子可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白快速積累的重要階段。對(duì)照種子高溫耐性的變化，發(fā)現(xiàn)此階段種子的高溫耐性也快速增加，說(shuō)明種子可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白的積累對(duì)種子高溫耐性的獲得起到了重要的作用。

2.4 不同發(fā)育時(shí)期胚軸細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)變化

不同發(fā)育階段的種子，具有不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。發(fā)育早期以花后23周的種子為例，其胚軸細(xì)胞核較大，核膜核仁清晰，細(xì)胞中脂質(zhì)體小而少，在細(xì)胞質(zhì)中不規(guī)則分布；線粒體較多，出現(xiàn)大量零散的小液泡，說(shuō)明早期細(xì)胞幼嫩且代謝旺盛（圖5：A-C）。到發(fā)育中期（花后37周），細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了明顯的變化，如脂質(zhì)體體積變大，靠細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)排列；胞內(nèi)液泡逐漸變大，液泡中有少量黑色絮狀物；線粒體數(shù)量多，此時(shí)細(xì)胞還在進(jìn)行旺盛的代謝活動(dòng)并積累儲(chǔ)藏物質(zhì)（圖5：D-F）。發(fā)育后期（花后47周）的種子，胚軸細(xì)胞較小，觀察到的線粒體少；液泡中黑色絮狀物增加，幾乎充斥著整個(gè)液泡；本階段種子成熟度高，細(xì)胞內(nèi)積累了大量的脂質(zhì)體，在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)規(guī)則排列（圖5：G-I）。這些說(shuō)明，在‘曼賽龍柚種子的發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)了一定的代謝關(guān)閉、貯藏物質(zhì)積累的過(guò)程，這些生理生化變化對(duì)種子高溫耐性的獲得具有重要的貢獻(xiàn)。

2.5 ‘曼賽龍柚種子發(fā)育相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

在種子發(fā)育過(guò)程中，根據(jù)存活率和成苗率計(jì)算出來(lái)的高溫處理半致死時(shí)間與種子發(fā)育過(guò)程中可溶性蛋白、熱穩(wěn)定蛋白以及干鮮重比呈顯著的正相關(guān)，與種子鮮重和含水量呈負(fù)相關(guān)。含水量與干鮮重比、熱穩(wěn)定蛋白和可溶性蛋白之間呈極顯著負(fù)相關(guān)。種子干鮮重比與熱穩(wěn)定蛋白和可溶性蛋白之間均呈極顯著正相關(guān)，可溶性蛋白與熱穩(wěn)定蛋白之間也呈極顯著正相關(guān)（表1）。

3? 討論與結(jié)論

種子的成熟包括生理成熟和形態(tài)成熟兩個(gè)方面，生理成熟主要表現(xiàn)在干物質(zhì)含量穩(wěn)定、含水量減低、種子具有萌發(fā)能力；形態(tài)成熟包括種子的形狀、大小和顏色等形態(tài)特征不再發(fā)生變化（齊永平，2009）。據(jù)Hamilton等（2007）報(bào)道，柑橘屬Citrus garrawayi的種子含水量從未成熟時(shí)的（82±1）%下降到（40±1）%時(shí)種子即達(dá)到成熟狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中 ‘曼賽龍柚種子的含水量變化與此一致，

花后23周種子的含量為82%左右，到花后41周時(shí)下降到42%，之后再無(wú)顯著變化。此外，種子的鮮重和干鮮重比也在花后41周趨于穩(wěn)定，進(jìn)一步說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)達(dá)到生理性成熟。但種子鮮重在花后35周以后有些不穩(wěn)定，在花后47周和49周甚至出現(xiàn)降低，這可能是由于實(shí)驗(yàn)后期果園里剩余的可供實(shí)驗(yàn)的果實(shí)不多，采摘的果實(shí)較小所導(dǎo)致。

Bewley等（2013）對(duì)正常性種子和頑拗性種子發(fā)育的研究表明，正常性種子在成熟脫落前有一個(gè)成熟脫水階段，此時(shí)干物質(zhì)積累停止，種子含水量和鮮重顯著下降。頑拗性種子的發(fā)育則與此有所不同，其干物質(zhì)持續(xù)積累直至種子成熟脫落，發(fā)育過(guò)程中種子含水量有所下降，但是種子脫落時(shí)仍保持很高的含水量，無(wú)明顯的成熟脫水。本研究結(jié)果表明，‘曼賽龍柚種子在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中含水量變化和干物質(zhì)積累與正常性和頑拗性種子都有所不同，其含水量在發(fā)育前期維持在一個(gè)較高的水平（81%左右），隨后開(kāi)始逐漸降低，在花后41周以后維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，這與頑拗性種子類似。種子干重在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，種子的鮮重先增加隨后降低并最終保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，這方面則與正常性種子類似。因此，‘曼賽龍柚種子的發(fā)育模式是介于正常性種子和頑拗性種子之間的中間型。

種子的脫水耐性是個(gè)數(shù)量性狀，正常性種子的脫水耐性在發(fā)育過(guò)程中逐漸形成， 并且可能在種子生理成熟后繼續(xù)加強(qiáng)（Sun & Leoplod， 1993；楊期和等，2002；文彬，2008）；頑拗性種子則在生理成熟時(shí)最大，之后可能會(huì)有輕微下降（彭業(yè)芳和傅家瑞，1994）。‘曼賽龍柚種子發(fā)育過(guò)程中高溫耐性的獲得也與正常性種子較為相似，花后25～41周種子的高溫耐性逐漸上升，并在花后41周即種子生理成熟期直線上升，此后種子的高溫耐性持續(xù)增加，與中間型葡萄柚種子的脫水耐性發(fā)育模式相似（張楠，2014）。在發(fā)育過(guò)程中，‘曼賽龍柚種子高溫耐性的增強(qiáng)與種子可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量的提高幾乎同步，因?yàn)榛ê?3～49周種子可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量均呈連續(xù)升高趨勢(shì)。相關(guān)性分析進(jìn)一步表明在發(fā)育過(guò)程中這兩類蛋白的積累與種子的高溫耐性呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量的積累降低了高溫對(duì)種子細(xì)胞膜等組織的傷害，從而增加了種子的高溫耐性。這與前人關(guān)于可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白具有保護(hù)功能的研究結(jié)果相符（黎茵等，2010； 付豪，2019； 秦堯等，2022）。

正常性種子發(fā)育早期的胚細(xì)胞，細(xì)胞體積大、核小，細(xì)胞大小不均、排列疏松、間隙大，細(xì)胞內(nèi)液泡大而多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器多；發(fā)育后期細(xì)胞排列緊密且規(guī)則、胞小核大，液泡較小或沒(méi)

有，此階段積累了大量的蛋白體和脂質(zhì)體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器減少（Wen et al.， 2009）。而在頑拗性種子發(fā)育早期胚細(xì)胞排列疏松，胞大核小，含有一個(gè)大液泡，幾乎占據(jù)細(xì)胞的大部分空間，線粒體和核糖體等細(xì)胞器較多；發(fā)育中期細(xì)胞排列較緊密，體積小核大，液泡由大液泡轉(zhuǎn)為幾個(gè)小液泡，胞內(nèi)細(xì)胞器較少，并出現(xiàn)了脂質(zhì)體；發(fā)育后期周邊的細(xì)胞為成熟細(xì)胞，被一個(gè)充滿黑色顆粒狀物質(zhì)的液泡占據(jù)大部分空間，中間位置由幼嫩細(xì)胞和成熟細(xì)胞組成（Wen， 2011）。本研究通過(guò)對(duì)‘曼賽龍柚種子胚軸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，中間型種子早期和中期的發(fā)育與正常性種子相似，即發(fā)育早期的‘曼賽龍柚種子胚軸細(xì)胞個(gè)體大且具有小而少的液泡和脂質(zhì)體，線粒體多，代謝旺盛的特點(diǎn)；發(fā)育中期胚軸細(xì)胞較早期小，脂質(zhì)體較多且靠細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)排列，同時(shí)液泡變大且里面還出現(xiàn)了黑色絮狀物。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這種富含黑色物質(zhì)的液泡為發(fā)育中的蛋白體（Klein & Pollock， 1968）。中間型種子后期的發(fā)育與正常性種子和頑拗性種子均有所不同，但比較而言，與頑拗性種子更接近?！慅堣址N子發(fā)育后期，其胚軸細(xì)胞更小，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體數(shù)量增加，占據(jù)細(xì)胞大部分空間；液泡中的黑色物質(zhì)大大增加，但到種子成熟時(shí)也沒(méi)有完全意義上的蛋白體出現(xiàn)，與頑拗性種子發(fā)育后期的成熟細(xì)胞相似，與正常性種子不同（Wen et al.， 2009）。這與王姍（2020）對(duì)中間型種子寶華玉蘭胚乳細(xì)胞發(fā)育研究所得到的結(jié)果相似。因此，從發(fā)育的角度而言，中間型種子的發(fā)育也是介于頑拗性和正常性種子之間的類型。

‘曼賽龍柚種子的高溫耐性是在發(fā)育過(guò)程中逐步獲得的，并與種子的可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白含量及細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的變化相關(guān)。發(fā)育早期的‘曼賽龍柚種子，其高溫耐性差，同時(shí)細(xì)胞幼嫩且代謝旺盛，細(xì)胞內(nèi)只有少量的脂質(zhì)體；發(fā)育中期的種子具有較高的高溫耐性，細(xì)胞中脂質(zhì)體開(kāi)始大量積累并緊靠細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)排列，液泡中也出現(xiàn)了黑色物質(zhì)；在發(fā)育后期，種子的高溫耐性達(dá)到最大時(shí)，細(xì)胞中的脂質(zhì)體大量增加，占據(jù)了細(xì)胞大部分空間，同時(shí)液泡被黑色物質(zhì)幾乎完全占滿。因此，‘曼賽龍柚種子逐漸發(fā)育直到成熟的過(guò)程，也是種子獲得并提高高溫耐性的過(guò)程，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體也在不斷增加，液泡中的黑色物質(zhì)也在增加，對(duì)種子高溫耐性的獲得和提高具有重要的作用。據(jù)此，可以認(rèn)為‘曼賽龍柚種子的高溫耐性獲得與細(xì)胞形態(tài)變化、代謝變化和儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累密不可分，是其高溫耐性的生理基礎(chǔ)。

根據(jù)貯藏特性，種子可以分為正常性、頑拗性和中間型3種類型，現(xiàn)存物種中以生產(chǎn)正常性種子的植物占優(yōu)。在Dickie和Pritchard（2002）統(tǒng)計(jì)的7 146種物種中，絕大多數(shù)（約90%）是正常性的種子，頑拗性的約7%，中間型的僅2%。劉明航等（2019）整理了英國(guó)皇家植物園邱園千年種子庫(kù)的種子信息數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的24 781種植物種子，其中頑拗性種子共620種，占2.5%，中間型種子149種占0.6%。中間型種子在自然界中的占比較少，而且中間型種子這個(gè)概念也是相對(duì)較晚才提出，因此對(duì)這類種子的研究還不夠充分，對(duì)其特性了解還不夠?？Х群透涕偈巧a(chǎn)中間型種子較多的兩個(gè)類群，也是目前中間型種子中研究得比較多的兩個(gè)類群。因?yàn)榭Х仍a(chǎn)于非洲，相對(duì)而言，國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘類，特別是其中的柚種子研究較多。另外，前人的這一類工作通常集中在種子的脫水耐性、低溫耐性和貯藏耐性方面，這主要為了與種子的貯藏聯(lián)系起來(lái)，我們關(guān)注種子的高溫耐性，更多的是為了與種子生態(tài)建立聯(lián)系，如種子在野外的老化、壽命、存活、萌發(fā)等。就柚種子而言，我們先前的工作已經(jīng)對(duì)其超低溫保存（Zhang et al.， 2014；Yan et al.， 2014；楊佩儒等，2021）、脫水耐性發(fā)育（薛鵬和文彬，2015；Xue & Wen， 2018）、超低溫耐性發(fā)育（Wen， 2018）、不同品種種子的超低溫耐性（Wen et al.， 2010）和高溫耐性（An et al.， 2023）等方面進(jìn)行了研究。本文對(duì)柚種子的高溫耐性發(fā)育進(jìn)行研究，檢測(cè)了種子發(fā)育過(guò)程中高溫耐性的變化，并探究了細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)變化及可溶性蛋白和熱穩(wěn)定蛋白積累與種子高溫耐性的聯(lián)系，這一方面讓我們對(duì)種子高溫耐性的生理基礎(chǔ)有了一定的認(rèn)識(shí)，另一方面也豐富和加深了我們對(duì)中間型種子的了解。

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（責(zé)任編輯? 周翠鳴）