李卉　王艷　王海宏　梁珂珂　李建龍

摘 要：通過(guò)構(gòu)建高羊茅高溫脅迫下的消減文庫(kù)，并使用斑點(diǎn)印跡技術(shù)從中篩選出差異表達(dá)基因，以期深入研究高羊茅適應(yīng)高溫的分子機(jī)制。以冷季型草坪草高羊茅為研究對(duì)象，在兩年生理指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上通過(guò)構(gòu)建高羊茅在高溫脅迫下的SSH文庫(kù)，分別以正、反向SSH探針與尼龍膜上的消減cDNA質(zhì)粒進(jìn)行雜交，并經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)得到雜交信號(hào)，比較了38/30 °C（晝/夜）的培養(yǎng)箱中高溫脅迫6 h的高羊茅葉片和對(duì)照組高羊茅葉片的RNA差異。結(jié)果表明：試驗(yàn)得到的差減文庫(kù)中大量組成型表達(dá)基因已經(jīng)被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集；利用斑點(diǎn)雜交共得到252個(gè)差異片段，庫(kù)中陽(yáng)性克隆約占50%以上；陽(yáng)性克隆中91個(gè)為上調(diào)基因，161個(gè)為下調(diào)基因，這些與高羊茅的耐熱性密切相關(guān)的基因即為試驗(yàn)所尋的差異表達(dá)基因。本試驗(yàn)為找出高羊茅耐熱相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)，為草坪草的轉(zhuǎn)基因育種工作提供了相關(guān)依據(jù)，結(jié)合恰當(dāng)?shù)乃收{(diào)控措施可有效提高草坪草的抗逆性。

關(guān)鍵詞：高溫脅迫；逆境生理；差異表達(dá)基因；抑制差減雜交；斑點(diǎn)印跡技術(shù)；陽(yáng)性克隆

中圖分類號(hào)：S688.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.01.001

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和城市化水平的不斷提高，人們的健康意識(shí)和審美意識(shí)不斷提高，使得城市綠化越來(lái)越受到重視。草坪作為一種優(yōu)良的綠化材料，種植面積迅速擴(kuò)大。草坪草可分為暖季型草坪草和冷季型草坪草。其中，在寒冷條件下能正常生長(zhǎng)發(fā)育的草坪草就是冷季型草坪草，常見(jiàn)于溫帶和副極帶地區(qū)，如早熟禾（Poa Prateusis）、黑麥草（Lolium perenne）、剪股穎（Agrostis tenui）和羊茅（Festuca avina）等。其生長(zhǎng)的最適溫度為15～24 ℃，高于30 ℃一般會(huì)出現(xiàn)夏季枯黃和死亡現(xiàn)象。冷季型草坪草的綠期相對(duì)較長(zhǎng)，但隨著全球氣溫的升高以及城市熱島效應(yīng)的日益凸顯，越夏就成了冷季型優(yōu)良草坪草品種亟需解決的問(wèn)題。如何提高冷季型草坪草的抗熱性顯得尤為重要，因此，研究草坪草的高溫脅迫機(jī)理特別是其生理機(jī)制和分子機(jī)制對(duì)于鑒定和選育耐熱的冷季型草坪草具有重要的理論和實(shí)踐意義。當(dāng)植物受到低溫或者高溫脅迫時(shí)，正常的生理過(guò)程受到干擾，細(xì)胞代謝紊亂，生長(zhǎng)被抑制。但是植物也可以通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)延緩或者阻止傷害的發(fā)生，這就為人們通過(guò)各種管理和調(diào)控措施改善草坪草的抗熱性和抗寒性提供了可能性。對(duì)于逆境生理和抗性調(diào)控機(jī)理的研究可以更詳細(xì)地了解草坪草的生理特性，為草坪草的建植、養(yǎng)護(hù)和管理，以及新品種的選育提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

冷季型草坪草抗熱性有相關(guān)研究主要從生理生態(tài)學(xué)角度對(duì)比熱敏感和耐熱植株在高溫脅迫下的形態(tài)和生理指標(biāo)，以及植株在熱脅迫前后的生理生態(tài)變化，通過(guò)一些物理、化學(xué)等手段，改善草坪草的耐熱性，例如管理措施（覆蓋、澆水、修剪等）、抗性鍛煉、施肥、施用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和育種等。然而基因才是真正調(diào)控植物對(duì)環(huán)境響應(yīng)方式的物質(zhì)，因此，草坪草耐熱性相關(guān)基因必然成為深入研究草坪草耐熱性的關(guān)鍵和熱點(diǎn)。目前，分離并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分報(bào)道。李廣存等[1]對(duì)草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB進(jìn)行了克隆及功能鑒定；Li等[2]利用抑制差減雜交的方法研究了耐高溫剪股穎的高溫脅迫響應(yīng)基因；George 等[3]和Velculescu等[4]在熱脅迫下對(duì)比了剪股穎耐熱與不耐熱品種根、莖中的基因差異表達(dá)，鑒定和描述了蘋果菌素基因AsEXP1與剪股穎耐熱性的關(guān)系。

抑制消減雜交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技術(shù)己成功地從植物中克隆了很多重要基因[5]。SSH的主要缺點(diǎn)就是產(chǎn)生假陽(yáng)性，因?yàn)樵谙麥p過(guò)程中，只有一個(gè)過(guò)程可富集目的基因，因此不可避免地會(huì)增加背景序列。而將斑點(diǎn)印跡技術(shù)應(yīng)用于抑制消減雜交差別表達(dá)基因克隆的初篩，一方面可以鑒定文庫(kù)質(zhì)量，另一方面它可以進(jìn)一步剔除文庫(kù)中的假陽(yáng)性克隆，真正獲得目的優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因。高羊茅（Festuca arundinacea）作為耐熱性相對(duì)較好的冷季型草坪草，近年來(lái)在亞熱帶地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)以冷季型草坪草高羊茅為研究對(duì)象，在兩年生理生態(tài)指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上進(jìn)一步做了分子水平的研究，進(jìn)行了高溫脅迫下草坪草高羊茅抑制差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建和差異表達(dá)基因的斑點(diǎn)雜交，通過(guò)信號(hào)掃描獲得陽(yáng)性克隆，為后續(xù)的序列特征和功能預(yù)測(cè)試驗(yàn)提供依據(jù)，同時(shí)為草坪草引入編碼代謝途徑的大片段DNA的轉(zhuǎn)基因育種工作提供相關(guān)依據(jù)，結(jié)合恰當(dāng)?shù)乃收{(diào)控措施有效提高草坪草的抗熱性等逆境承受能力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)品種 試驗(yàn)所選品種為凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），種子購(gòu)自北京克勞沃種子公司。選擇健康的草坪草種子播種在裝有混合培養(yǎng)基質(zhì)（沙子/蛭石/有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土 = 3/1/1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直徑為13 cm，深14 cm，每盆播種175～180粒種子。所有盆缽在室外自然光照下進(jìn)行培養(yǎng)，氣溫為15～26 °C。盆缽內(nèi)的草坪草每天用自來(lái)水澆灌至盆缽底有水從小孔滲出，每周用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[6]澆灌一次。20 d后將所有盆缽再轉(zhuǎn)移到人工氣候箱（型號(hào)：LRH-300-CS，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）培養(yǎng)14 d，管理方式同上，人工氣候箱被設(shè)置為14 h的光周期，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1， 相對(duì)濕度為（65 ±10）%， 溫度為26 °C /15 °C （晝/夜，對(duì)照溫度）。盆缽在人工氣候箱內(nèi)隨機(jī)擺放并定期交換以保證每盆所受內(nèi)部環(huán)境影響一致。

一半草坪草轉(zhuǎn)入38/30 °C（晝/夜）的培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫（處理植株），光照、相對(duì)濕度以及管理方式均與對(duì)照溫度下光照培養(yǎng)箱中的一致。另一半仍舊在原條件下培養(yǎng)作為對(duì)照植株。在脅迫第6 h時(shí)取處理和對(duì)照的高羊茅葉片分別提取總RNA進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試劑 RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa； PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech；DL2000，條帶依次為2 000，1 000， 750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa。

1.2 試驗(yàn)儀器

PCR儀，ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀；離心機(jī)，5418型，eppendorf；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度計(jì)，GeneQuant II，Pharmacia Biotech。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高羊茅總RNA提取與mRNA的分離、純化 取50～100 mg組織于液氮中研磨，加入1 mL緩沖液提取組織總RNA。將總RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃處理30 min，抽提純化RNA。用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 高羊茅SSH文庫(kù)的構(gòu)建 將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行純化以及cDNA RsaI酶切，將雙鏈cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差減和接頭連接，具體可參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit說(shuō)明書。接頭連接和差減雜交，進(jìn)行兩輪差減雜交，并且對(duì)兩輪差減雜交結(jié)果進(jìn)行差減PCR。純化PCR產(chǎn)物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector連接消減雜交片段。用氯化鈣二次重懸法制備感受態(tài)大腸桿菌。取出儲(chǔ)存于-80 ℃的大腸桿菌菌株的保存菌液，37 ℃下，轉(zhuǎn)速為225 r·min-1，擴(kuò)大培養(yǎng)約至2.5～3.0 h，OD600=0.4時(shí)結(jié)束。將0.1 mol·L-1CaCl2溶液冰水浴冷卻，提取2 mL并輕輕震蕩菌體至均勻，冰水浴30 min后，得到感受態(tài)細(xì)胞懸液；加入5 mL連接產(chǎn)物，在恒溫振蕩器上復(fù)蘇培養(yǎng)80 min，讓受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)； 37 ℃在LB固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中14～16 h，直至長(zhǎng)出大小合適的藍(lán)、白菌落。取白色飽滿菌落置于96細(xì)胞培養(yǎng)板，于37 ℃下靜置培養(yǎng)16～20 h，加入13 μL甘油（甘油經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌）混勻，-70 ℃保存，即可建成SSH文庫(kù)。

1.3.3 斑點(diǎn)雜交 根據(jù)下列方陣點(diǎn)膜，每個(gè)點(diǎn)各取0.6 μLPCR產(chǎn)物（插入片斷鑒定PCR產(chǎn)物）。

2 結(jié)果與分析

SSH和基因芯片技術(shù)的相結(jié)合是從陽(yáng)性克隆中篩選差異基因比較理想的方法，它在一次雜交中就可對(duì)成千上萬(wàn)的基因進(jìn)行檢測(cè)，但是首先要有預(yù)先制備好的基因表達(dá)譜芯片。制備一張較完備的基因芯片經(jīng)費(fèi)要求較高，需要對(duì)研究對(duì)象的遺傳背景有較好的了解。另外，運(yùn)用基因芯片研究基因表達(dá)時(shí)，低豐度的基因往往難以檢測(cè)出來(lái)。因此，對(duì)于一些遺傳背景不清晰的物種來(lái)說(shuō)，利用傳統(tǒng)意義上的基因芯片技術(shù)研究其在不同代謝或生理狀態(tài)的基因表達(dá)譜的變化是困難而且不經(jīng)濟(jì)的。因此，將斑點(diǎn)印跡技術(shù)應(yīng)用于抑制消減雜交差別表達(dá)基因克隆的初篩，一方面可以鑒定文庫(kù)質(zhì)量，更重要的是可以進(jìn)一步剔除文庫(kù)中的假陽(yáng)性克隆，真正獲得目的優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因。本試驗(yàn)即在應(yīng)用SSH技術(shù)建立高羊茅耐熱基因抑制消減文庫(kù)，然后使用斑點(diǎn)印跡技術(shù)對(duì)差別表達(dá)基因克隆進(jìn)行初步篩選，獲得陽(yáng)性克隆。

根據(jù)陽(yáng)性克隆信號(hào)強(qiáng)弱的數(shù)據(jù)，變化倍數(shù)取log2，然后進(jìn)行升序排列的結(jié)果，得到上調(diào)和下調(diào)結(jié)果。上調(diào)的基因?yàn)?1個(gè)；下調(diào)基因?yàn)?2個(gè)，這兩部分?jǐn)?shù)據(jù)與草坪草抗熱性的獲得顯著相關(guān)，是研究所關(guān)注的基因組，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和分析。其余還有下調(diào)基因145個(gè)，這部分基因與抗熱性的獲得相關(guān)，但不是關(guān)鍵基因，這部分?jǐn)?shù)據(jù)可以作為選測(cè)數(shù)據(jù)，以便對(duì)抗熱相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析。

3 討 論

在本研究中，為了從已構(gòu)建好的消減文庫(kù)中篩選差異表達(dá)基因，分別以正向和反向SSH探針與尼龍膜上的消減cDNA質(zhì)粒進(jìn)行雜交，消減cDNA質(zhì)粒與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的質(zhì)粒，經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)顯出雜交信號(hào)。通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)度差異篩選出陽(yáng)性克隆。

當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，正常的生理過(guò)程受到干擾，細(xì)胞代謝紊亂。同時(shí)，植物也可以通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)延緩或者阻止傷害的發(fā)生。有關(guān)逆境生理和抗性調(diào)控機(jī)理已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[7-10]，試驗(yàn)表明：在植物受到脅迫時(shí)，體內(nèi)的各種生化指標(biāo)都會(huì)發(fā)生變化，甚至產(chǎn)生一些新的蛋白，如熱激蛋白，保護(hù)植物免受或延緩傷害[11]?，F(xiàn)有研究已經(jīng)知道植物對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的大多數(shù)生理響應(yīng)都得通過(guò)改變基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在中等脅迫或者外源物質(zhì)的刺激下，各種保護(hù)機(jī)制也會(huì)快速反應(yīng)[12]，從而減輕了進(jìn)一步的脅迫對(duì)植物體造成的傷害?？梢?jiàn)，抗逆基因的響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于生理指標(biāo)的變化。

植株對(duì)逆境的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)過(guò)程，所表達(dá)的差異基因涉及到生理代謝的各個(gè)方面[13]。傳統(tǒng)的研究受到研究手段和方法的限制，往往只能從一個(gè)方面去認(rèn)識(shí)逆境下的生理或者基因的變化規(guī)律，而不能全面地揭示逆境引起的基因組變化[14]。現(xiàn)代基因組學(xué)為系統(tǒng)研究逆境差異基因提供了條件，避免了研究的盲目性。在本試驗(yàn)中共獲得252個(gè)差異基因，通過(guò)進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析可以知道他們的功能、涉及的代謝系統(tǒng)，以及與抗熱性的相關(guān)性，從而為后續(xù)的基因克隆、調(diào)控提供試驗(yàn)支持。

4 結(jié) 論

（1）本試驗(yàn)從正向和反向文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選了384個(gè)克隆，利用斑點(diǎn)雜交共得到252個(gè)差異片段，庫(kù)中陽(yáng)性克隆約占50%以上。

（2）陽(yáng)性克隆中，91個(gè)為上調(diào)基因，161個(gè)為下調(diào)基因。這些基因即為試驗(yàn)所要尋找的差異表達(dá)基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關(guān)。

（3）本試驗(yàn)為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎(chǔ)，可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和功能鑒定工作，同時(shí)也為草坪草轉(zhuǎn)基因育種提供了相關(guān)依據(jù)，結(jié)合恰當(dāng)?shù)乃收{(diào)控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長(zhǎng)青綠期，提高生態(tài)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李廣存，金黎平，謝開(kāi)云，等. 抑制差減雜交（SSH）技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志， 2004， 24（9）： 26-32.

[2] Li L， Techel D， Gret N， et al. A novel transcriptome subtraction method for the detection of differentially expressed genes in highly complex eukaryotes [J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33： 16-36.

[3] George P Y， Douglas T R， Wayne W K， et al. Combining SSH and Cdna microarrays for rapid identification of differentially expressed genes [J]. Nucleic Acids Research， 1999， 27： 1 517-1 523.

[4] Velculescu V E， Zhang L， Vogelstein B. Serial analysis of gene expression [J]. Science， 1995， 270（5253）： 484-487.

[5] Cui L J， Fan Y M. High temperature effects on photosynthesis， PSII functionality and antioxidant activity of two Festuca arundinacea cultivars with different heat susceptibility [J]. Bot Stud， 2006， 47： 61-69.

[6] 李建龍，晏笳，蔣平，等. 亞熱帶主要草坪草抗性生理研究進(jìn)展[J].中國(guó)草地， 2002， 24（4）： 41-46.

[7] Xu S， Li J L， Zhang X Q， et al. Effects of heat acclimation pretreatment on changes of membrane lipid peroxidation， antioxidant metabolites and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turfgrass species under heat stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2006， 56： 274-285.

[8] 繆穎，伍炳華. 植物抗逆性的獲得與信息傳導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊， 2001， 37（2）： 71-76.

[9] 耶興元，馬鋒旺. 植物熱激蛋白研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2004， 13（2）： 109-114.

[10] Horváth E， Pál M， Szalai G， et al. Exogenous 4-hydroxybenzoic acid and salicylic acid modulate the effect of short-term drought and freezing stress on wheat plants[J]. Bio Plant，2007，51：480-487.

[11] 蘇紅英，張鵬飛. 抑制性消減雜交技術(shù)研究進(jìn)展[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（3）：354-357.

[12] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[13] 王海宏，王艷，李卉，等.草坪草高羊茅高溫誘導(dǎo)抑制差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，20（8）：1-7.

[14] 李建龍.草坪草抗性生理生態(tài)研究進(jìn)展[M]. 南京：南京大學(xué)出版社，2008：24-25.

4 結(jié) 論

（1）本試驗(yàn)從正向和反向文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選了384個(gè)克隆，利用斑點(diǎn)雜交共得到252個(gè)差異片段，庫(kù)中陽(yáng)性克隆約占50%以上。

（2）陽(yáng)性克隆中，91個(gè)為上調(diào)基因，161個(gè)為下調(diào)基因。這些基因即為試驗(yàn)所要尋找的差異表達(dá)基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關(guān)。

（3）本試驗(yàn)為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎(chǔ)，可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和功能鑒定工作，同時(shí)也為草坪草轉(zhuǎn)基因育種提供了相關(guān)依據(jù)，結(jié)合恰當(dāng)?shù)乃收{(diào)控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長(zhǎng)青綠期，提高生態(tài)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李廣存，金黎平，謝開(kāi)云，等. 抑制差減雜交（SSH）技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志， 2004， 24（9）： 26-32.

[2] Li L， Techel D， Gret N， et al. A novel transcriptome subtraction method for the detection of differentially expressed genes in highly complex eukaryotes [J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33： 16-36.

[3] George P Y， Douglas T R， Wayne W K， et al. Combining SSH and Cdna microarrays for rapid identification of differentially expressed genes [J]. Nucleic Acids Research， 1999， 27： 1 517-1 523.

[4] Velculescu V E， Zhang L， Vogelstein B. Serial analysis of gene expression [J]. Science， 1995， 270（5253）： 484-487.

[5] Cui L J， Fan Y M. High temperature effects on photosynthesis， PSII functionality and antioxidant activity of two Festuca arundinacea cultivars with different heat susceptibility [J]. Bot Stud， 2006， 47： 61-69.

[6] 李建龍，晏笳，蔣平，等. 亞熱帶主要草坪草抗性生理研究進(jìn)展[J].中國(guó)草地， 2002， 24（4）： 41-46.

[7] Xu S， Li J L， Zhang X Q， et al. Effects of heat acclimation pretreatment on changes of membrane lipid peroxidation， antioxidant metabolites and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turfgrass species under heat stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2006， 56： 274-285.

[8] 繆穎，伍炳華. 植物抗逆性的獲得與信息傳導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊， 2001， 37（2）： 71-76.

[9] 耶興元，馬鋒旺. 植物熱激蛋白研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2004， 13（2）： 109-114.

[10] Horváth E， Pál M， Szalai G， et al. Exogenous 4-hydroxybenzoic acid and salicylic acid modulate the effect of short-term drought and freezing stress on wheat plants[J]. Bio Plant，2007，51：480-487.

[11] 蘇紅英，張鵬飛. 抑制性消減雜交技術(shù)研究進(jìn)展[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（3）：354-357.

[12] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[13] 王海宏，王艷，李卉，等.草坪草高羊茅高溫誘導(dǎo)抑制差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，20（8）：1-7.

[14] 李建龍.草坪草抗性生理生態(tài)研究進(jìn)展[M]. 南京：南京大學(xué)出版社，2008：24-25.

4 結(jié) 論

（1）本試驗(yàn)從正向和反向文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選了384個(gè)克隆，利用斑點(diǎn)雜交共得到252個(gè)差異片段，庫(kù)中陽(yáng)性克隆約占50%以上。

（2）陽(yáng)性克隆中，91個(gè)為上調(diào)基因，161個(gè)為下調(diào)基因。這些基因即為試驗(yàn)所要尋找的差異表達(dá)基因，他們與高羊茅的耐熱性比密切相關(guān)。

（3）本試驗(yàn)為草坪草耐熱基因的研究提供了基礎(chǔ)，可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和功能鑒定工作，同時(shí)也為草坪草轉(zhuǎn)基因育種提供了相關(guān)依據(jù)，結(jié)合恰當(dāng)?shù)乃收{(diào)控，可有效提高草坪草的逆境耐受力，從而延長(zhǎng)青綠期，提高生態(tài)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李廣存，金黎平，謝開(kāi)云，等. 抑制差減雜交（SSH）技術(shù)及其在植物基因分離上的應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志， 2004， 24（9）： 26-32.

[2] Li L， Techel D， Gret N， et al. A novel transcriptome subtraction method for the detection of differentially expressed genes in highly complex eukaryotes [J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33： 16-36.

[3] George P Y， Douglas T R， Wayne W K， et al. Combining SSH and Cdna microarrays for rapid identification of differentially expressed genes [J]. Nucleic Acids Research， 1999， 27： 1 517-1 523.

[4] Velculescu V E， Zhang L， Vogelstein B. Serial analysis of gene expression [J]. Science， 1995， 270（5253）： 484-487.

[5] Cui L J， Fan Y M. High temperature effects on photosynthesis， PSII functionality and antioxidant activity of two Festuca arundinacea cultivars with different heat susceptibility [J]. Bot Stud， 2006， 47： 61-69.

[6] 李建龍，晏笳，蔣平，等. 亞熱帶主要草坪草抗性生理研究進(jìn)展[J].中國(guó)草地， 2002， 24（4）： 41-46.

[7] Xu S， Li J L， Zhang X Q， et al. Effects of heat acclimation pretreatment on changes of membrane lipid peroxidation， antioxidant metabolites and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turfgrass species under heat stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2006， 56： 274-285.

[8] 繆穎，伍炳華. 植物抗逆性的獲得與信息傳導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊， 2001， 37（2）： 71-76.

[9] 耶興元，馬鋒旺. 植物熱激蛋白研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2004， 13（2）： 109-114.

[10] Horváth E， Pál M， Szalai G， et al. Exogenous 4-hydroxybenzoic acid and salicylic acid modulate the effect of short-term drought and freezing stress on wheat plants[J]. Bio Plant，2007，51：480-487.

[11] 蘇紅英，張鵬飛. 抑制性消減雜交技術(shù)研究進(jìn)展[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（3）：354-357.

[12] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[13] 王海宏，王艷，李卉，等.草坪草高羊茅高溫誘導(dǎo)抑制差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，20（8）：1-7.

[14] 李建龍.草坪草抗性生理生態(tài)研究進(jìn)展[M]. 南京：南京大學(xué)出版社，2008：24-25.