吳家炎 袁振光 陳依敏

【摘 要】 目的：采用生物信息學(xué)的方法來分析冠心病相關(guān)的基因，通路，轉(zhuǎn)錄因子和miRNA。方法：從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO下載冠心病基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)基因（DEGs），并對差異基因進(jìn)行GO、KEGG以及PPI網(wǎng)絡(luò)分析。最后利用Webgestalt預(yù)測CHD相關(guān)的miRNA以及轉(zhuǎn)錄因子，并構(gòu)建miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：共篩選出1449個DEGs。GO功能分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞 - 細(xì)胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)肽信號通路等生物學(xué)過程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs參與神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化和吸收、維生素的消化吸收等通路。并且篩選出20個與冠心病發(fā)病相關(guān)的基因，特別是發(fā)現(xiàn)了少有文獻(xiàn)報(bào)道的POMC、MYOD1等基因。最后我們還預(yù)測了與CHD相關(guān)的7個轉(zhuǎn)錄因子和3個miRNA。結(jié)論：通過生物信息學(xué)對基因芯片數(shù)據(jù)的分析，我們得到了冠心病相關(guān)的基因、通路、miRNA以及轉(zhuǎn)錄因子，為冠心病的精準(zhǔn)治療提供了新思路。

【關(guān)鍵詞】 冠心??；生物信息學(xué)；差異表達(dá)基因 ；miRNA；轉(zhuǎn)錄因子

【中圖分類號】 R249 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）17-001-01

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD） 是由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，簡稱為冠心病，是 21 世紀(jì)威脅人類健康的主要疾病之一 [1]。冠心病的發(fā)生和發(fā)展是在遺傳因素和環(huán)境因素基礎(chǔ)上，多重危險(xiǎn)因素共同作用導(dǎo)致的[2]。高血壓、糖尿病等疾病，以及過度肥胖、不良生活習(xí)慣如吸煙等是誘發(fā)該病的主要因素。冠心病是全球死亡率最高的疾病之一[3]，目前對冠心病發(fā)病的遺傳因素還不清楚，對其基因方面的研究相對不足。

近年來，生物信息學(xué)發(fā)展迅速，為疾病在基因方面的研究提供了非常廣闊的平臺。生物信息學(xué)（Bioinformatics）是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索和分析的科學(xué)。它是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一，同時也是21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。本文從GEO 數(shù)據(jù)庫下載冠心病相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，為在基因?qū)哟紊涎芯抗谛牟〉陌l(fā)生發(fā)展及其精準(zhǔn)治療提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 利用美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI平 臺 下 的GEO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行芯片篩選，目標(biāo)芯片需滿足如下篩選標(biāo)準(zhǔn)：①人類標(biāo)本，排除細(xì)胞株和動物；②入選芯片需具有冠心病信息；③需為基因表達(dá)芯片，各探針具有歸一化的表達(dá)值； 經(jīng)篩選及芯片質(zhì)量分析，我們選取了6個樣本：冠心病CHD3例和健康對照組3例。

1.2 方法

1.2.1 差異基因篩選 下載CEL格式原始數(shù)據(jù)，利用R軟件包affy進(jìn)行讀取，采用RMA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理（包括Background correction， Normalization， Expression calculation），利用平臺注釋文件對探針進(jìn)行注釋，去除沒有匹配到基因的探針；對于不同探針映射到同一基因，我們?nèi)〔煌结樀木底鳛檫@個基因最終的表達(dá)值?；赗包limma篩選差異表達(dá)基因，采用矯正T檢驗(yàn)計(jì)算基因表達(dá)顯著性P值，BH方法矯正P值。每個差異表達(dá)基因，要求P<0.05。

1.2.2 差異表達(dá)基因功能分析 使用常用的富集分析工具DAVID分析差異表達(dá)基因參與的GO（gene ontology） 功能和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes） 通路。參數(shù)富集基因個數(shù)count>=2，超幾何檢驗(yàn)顯著性閾值P <0.05。

1.2.3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析所有差異表達(dá)基因的差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)可揭示蛋白之間的互作關(guān)系。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)軟件為Cytoscape。并統(tǒng)計(jì)節(jié)點(diǎn)degree值，觀察節(jié)點(diǎn)之間的連接情況。

1.2.4 miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用webgestalt網(wǎng)站分別對差異基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子TF富集預(yù)測和miRNA富集預(yù)測。取富集結(jié)果顯著的TF和miRNA。并整理TF-gene和miRNA-gene關(guān)系對，構(gòu)建miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 最終我們共篩選出1449個差異基因，與對照組相比，冠心病樣品組得到726個上調(diào)基因，723個下調(diào)基因。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析 通過G0功能分類體系對差異基因進(jìn)行注釋后發(fā)現(xiàn)，顯著富集的生物過程GO富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞-細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、

神經(jīng)肽信號通路、G蛋白偶聯(lián)受體-環(huán)核苷酸通路、G蛋白偶聯(lián)受體-蛋白信號通路的正調(diào)控等生物學(xué)過程。以KEGG數(shù)據(jù)庫中的pathway為基本單位，向背景基因組映射，明確差異基因所參與的主要代謝途徑和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，結(jié)果表明差異基因顯著富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化和吸收、黑素瘤、維生素的消化吸收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、脂肪的消化吸收等具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 結(jié)合PPI數(shù)據(jù)庫，分別對上調(diào)差異基因和下調(diào)差異基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，得到的PPI網(wǎng)絡(luò)。上調(diào)ppi網(wǎng)絡(luò)包括392個節(jié)點(diǎn)，下調(diào)ppi網(wǎng)絡(luò)包括419個節(jié)點(diǎn)。上調(diào)基因按照節(jié)點(diǎn)度大小排名的top 20 ，見表1。此處插入表12.4 miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：通過Webgestalt，我們找到富集結(jié)果排名前七的轉(zhuǎn)錄因子TF：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及排名前三的miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。整理相應(yīng)的TF和miRNA的靶基因，構(gòu)建miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

3 討論

目前對冠心病的發(fā)病機(jī)制，還不是特別的清楚。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，炎癥反應(yīng)對冠狀動脈形成粥樣硬化具有重要的作用。Luczak[4]FanWH[5]楊海燕[6]等研究表明，慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子，是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)；同時炎癥指標(biāo)可用來預(yù)測心血管疾病的發(fā)生。但是目前在基因水平上對該病的了解還是非常的有限，因此本研究對正常人和冠心病患者的表達(dá)譜進(jìn)行差異基因篩選，共篩選出1449個差異基因。利用string 在線軟件對1449個差異基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析，按節(jié)點(diǎn)度大小篩選出排名前20的上調(diào)基因：POMC、FPR2、MYOD1、GATA1、C3、GRM4、DRD4、SSTR5、PYY、FGF13、RGS6、CXCR1、、CCR10、SSTR4、CNR2、GALR3、APLN、NPBWR1、CDX2、PTGDR2。

對以上基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，我們發(fā)現(xiàn)已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道APLN、CXCR1、C3、FPR2與冠心病的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制以及預(yù)后關(guān)系密切 ；NR2、PYY、NPBWR1、PTGDR2與冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)因素有關(guān)，比如：糖尿病、高血壓、肥胖；POMC、MYOD1等至今少有跟冠心病相關(guān)的報(bào)道。Guang Yang等研究表明，載脂蛋白C3單核苷酸多態(tài)性增加了冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7] ；Ye zhang等認(rèn)為CXCR1通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，使冠心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加[8]；CAPLN是APJ受體的內(nèi)源性肽配體，已經(jīng)成為心血管系統(tǒng)的新型調(diào)節(jié)劑，APLN的缺乏使血管和內(nèi)皮祖細(xì)胞生成減少，從而體內(nèi)心肌血管生成受損，同時也會增加對缺血性損傷的易感性，這也增加了冠心病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)[9]。值得一提的是，我們發(fā)現(xiàn)POMC、MYOD1等基因與冠心病之間的關(guān)系報(bào)道較少。MyoD1基因，別名MYF3，是一種蛋白質(zhì)編碼基因。Davis等人在1987年通過與小鼠MyoD1探針的弱交叉雜交分離出3種不同的人肌源性因子MYF3，MYF4和MYF5的cDNA，證明MYF3是小鼠MyoD1的人類同系物。Weintraub等人在1991年研究發(fā)現(xiàn)MyoD1僅在骨骼肌及其前體中表達(dá)，在非肌肉細(xì)胞中，基因被特定基因所抑制。但這與冠心病的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)一步的研究。

值得一提是，我們還利用Webgestalt和Cytoscape構(gòu)建了miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Webgestalt的富集結(jié)果中，我們得到與CHD關(guān)系最為密切的7個轉(zhuǎn)錄因子：PAX8、EVI1、AR、NRSF、GATA、IK1、MYOD，以及3個miRNA：MIR-26A/B，MIR-29A/B/C，MIR-122A。

總之，通過生物信息學(xué)方法對冠心病芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，我們得到了冠心病患者和正常健康人之間的差異表達(dá)基因。對這些差異表達(dá)基因的進(jìn)一步篩選得到包括MYOD1和POMC在內(nèi)的20個關(guān)鍵基因；同時我們發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)、維生素的消化吸收等過程和神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用等通路；最后我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了一些與CHD相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA：PAX8、EVI1、AR、MIR-26A/B、MIR-29A/B/C，MIR-122A。這些基因，轉(zhuǎn)錄因子和miRNA可能在CHD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，但是具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探討，這對于CHD以后的精準(zhǔn)治療具有一定的臨床意義

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