摘 要：PCR技術(shù)因具有高靈敏度、高特異性和快速性的特點，在食品微生物檢測領(lǐng)域廣泛使用。本文闡述食品中常見的致病微生物、PCR技術(shù)的基本原理、食品中常見致病微生物的PCR檢測方法，探討PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用，并介紹PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；食品微生物；致病微生物；實時熒光定量PCR；多重PCR

Study on the Application of PCR Technique in Food Microbiological Detection

WANG Di

（Center for Disease Control and Prevention， Wujin District， Changzhou City， Jiangsu Province，

Changzhou 213100， China）

Abstract： PCR technology is widely used in the field of food microbiological detection because of its high sensitivity， high specificity and rapidity. This paper describes the common pathogenic microorganisms in food， the basic principle of PCR technology， the PCR detection method of common pathogenic microorganisms in food， discusses the application of PCR technology in food microbial detection， and introduces the development trend of PCR technology in food microbial detection.

Keywords： PCR technology; food microorganism; pathogenic microorganism; real-time fluorescence quantitative PCR; multiplex PCR

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，食品安全問題日益受到政府和公眾的高度關(guān)注。為保障食品安全、維護公眾健康，我國出臺了相關(guān)政策。食品微生物污染是導(dǎo)致食品安全問題的主要原因之一。傳統(tǒng)的食品微生物檢測方法，如培養(yǎng)法，存在檢測周期長、靈敏度低等缺點。PCR技術(shù)以其快速、靈敏、特異等優(yōu)點，在食品微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文將詳細分析PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的原理和應(yīng)用，探討其未來發(fā)展趨勢，為食品安全保障提供新思路和新方法。

1 食品中常見的致病微生物

常見的食品致病微生物有沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌。沙門氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌，通常會導(dǎo)致腸道感染和食物中毒，主要在禽肉、蛋制品等食品中引起污染。李斯特菌是一種革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，在自然界中廣泛分布[1]。這種細菌會引發(fā)李斯特菌病，患者的死亡率相對較高。它主要通過污染生鮮食品，如乳制品和肉制品等，傳播給人們。大腸桿菌O157：H7是一種致病性細菌，能夠分泌志賀毒素，會導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血尿毒癥綜合征。大腸桿菌O157：H7主要污染生牛肉和未經(jīng)過巴氏殺菌的奶制品等食品。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性球菌，能夠產(chǎn)生腸毒素，主要污染食物包括乳制品和肉制品，可能引起食物中毒。彎曲桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，屬于微需氧或兼性厭氧生物，會導(dǎo)致食源性腸炎和菌血癥，主要在禽肉、未經(jīng)徹底加熱的奶制品等食品中引發(fā)污染。這些病原微生物經(jīng)常引起食品安全問題，對人體健康構(gòu)成威脅。

2 PCR技術(shù)概述

聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)是一種在體外快速擴增特定DNA片段的技術(shù)。它基于DNA的半保留復(fù)制原理，通過反復(fù)循環(huán)的變性、退火、延伸過程，實現(xiàn)目標(biāo)DNA的指數(shù)擴增。PCR反應(yīng)體系主要包括模板DNA、一對特異性引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（如Taq酶）、4種脫氧核苷酸和緩沖液等。PCR反應(yīng)在特定的溫度程序下進行，通常包括94～96 ℃變性、50～65 ℃退火和72 ℃延伸這3個步驟，循環(huán)30～40次，每個循環(huán)使目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)增幅。PCR技術(shù)具有快速、高靈敏和高特異的特點，能夠迅速擴增微量DNA樣本，被廣泛運用于基因克隆、疾病診斷和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域[2]。隨著PCR技術(shù)的不斷進步和創(chuàng)新，包括多重PCR、實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR等在內(nèi)的PCR技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴大，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

3 食品中常見致病微生物的PCR檢測方法

PCR檢測的關(guān)鍵在于引物和探針的設(shè)計、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以及PCR產(chǎn)物的檢測和鑒定。引物和探針的設(shè)計需要根據(jù)目標(biāo)微生物的特異性基因序列，如毒力基因、致病基因等，利用生物信息學(xué)軟件進行設(shè)計和優(yōu)化，以提高PCR檢測的特異性和靈敏度[3]。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化包括反應(yīng)體系的配制（如DNA聚合酶、鎂離子濃度等）、退火溫度和時間、循環(huán)數(shù)等，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，可提高PCR檢測的效率和重現(xiàn)性。PCR產(chǎn)物的檢測和鑒定主要采用凝膠電泳、測序、探針雜交等方法，凝膠電泳可根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小進行定性分析，測序可對PCR產(chǎn)物進行準確鑒定，探針雜交可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的特異性檢測。

4 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

4.1 多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

多重PCR技術(shù)是利用多對特異性引物，在相同的反應(yīng)條件下，同時擴增多個目標(biāo)基因片段，通過優(yōu)化引物設(shè)計和反應(yīng)條件，可有效避免引物間的相互干擾，提高檢測的特異性和靈敏度[4]。與傳統(tǒng)的單個PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)可顯著提高檢測效率，縮短檢測時間，降低檢測成本，適用于食品中多種致病微生物的同時檢測。多重PCR檢測食品中多種致病微生物的方法主要包括多重常規(guī)PCR和多重實時熒光定量PCR。多重常規(guī)PCR技術(shù)擴增的多個目標(biāo)片段可通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離和鑒定。利用多重實時熒光定量PCR，可以通過多個熒光標(biāo)記的特異性探針來同時檢測和量化多種致病微生物。例如，通過多重PCR技術(shù)，可以同時檢測食品中的沙門氏菌、李斯特菌以及大腸桿菌O157：H7等多種致病菌。

4.2 實時熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

隨著PCR反應(yīng)的進行，熒光信號強度不斷積累，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可獲得PCR產(chǎn)物的動態(tài)積累曲線，從而實現(xiàn)目標(biāo)微生物的定量分析。與傳統(tǒng)的PCR檢測相比，實時熒光定量PCR具有更高的靈敏度、特異性和重現(xiàn)性，可實現(xiàn)目標(biāo)微生物的絕對定量和相對定量，避免了PCR后處理的交叉污染風(fēng)險[5]。在食品微生物定量檢測中，實時熒光定量PCR技術(shù)能夠精確測量食品中致病微生物的數(shù)量，評估食品的微生物安全風(fēng)險，并指導(dǎo)制定食品安全管理和控制措施。例如，通過實時熒光定量PCR技術(shù)，可以迅速而準確地檢測食品中沙門氏菌、李斯特菌等病原菌的污染水平，從而為評估食品安全風(fēng)險提供重要參考依據(jù)。

4.3 數(shù)字PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

數(shù)字PCR技術(shù)是將待測樣品與PCR反應(yīng)液混合，通過微流控芯片或油包水乳液將其分隔為大量獨立的微反應(yīng)腔，每個反應(yīng)腔作為一個獨立的PCR反應(yīng)單元。經(jīng)過PCR擴增后，根據(jù)各反應(yīng)腔的熒光信號，可判斷每個反應(yīng)腔中是否含有目標(biāo)微生物的DNA模板，并統(tǒng)計陽性反應(yīng)腔的數(shù)量，通過泊松分布計算得到待測樣品中目標(biāo)微生物的絕對含量[6]。與傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR無須標(biāo)準曲線，可直接實現(xiàn)目標(biāo)微生物的絕對定量，具有更高的靈敏度、準確性和重現(xiàn)性，特別適用于低拷貝數(shù)模板的定量分析。在食品微生物檢測中，數(shù)字PCR技術(shù)可精確定量食品中致病微生物的含量，即使在復(fù)雜基質(zhì)和低污染水平下也能實現(xiàn)準確定量。例如，數(shù)字PCR技術(shù)可以在食品樣品中高效地檢測出沙門氏菌、李斯特菌等病原微生物，為評估和控制食品安全風(fēng)險提供了可靠的手段。數(shù)字PCR技術(shù)的高靈敏度、準確性和重現(xiàn)性使其成為食品微生物定量檢測的新選擇。

4.4 PCR技術(shù)與其他檢測技術(shù)聯(lián)用在食品微生物檢測中的應(yīng)用

PCR-ELISA技術(shù)是一種結(jié)合了PCR擴增和ELISA檢測的方法，它利用特異性探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合，并通過酶標(biāo)記進行反應(yīng)，從而產(chǎn)生可測量的信號，以實現(xiàn)對目標(biāo)微生物的特異性檢測和定量分析。PCR-ELISA技術(shù)是一種比單獨使用PCR或ELISA更具敏感性和特異性的檢測方法，尤其適用于食品中低濃度致病微生物的檢測[7]。PCR-生物芯片技術(shù)是將PCR擴增和DNA微陣列芯片相結(jié)合，利用PCR擴增來富集目標(biāo)微生物的核酸，然后利用芯片上固定的多種特異性探針進行雜交和檢測，從而實現(xiàn)對食品中多種致病微生物的同時檢測和鑒定。PCR-質(zhì)譜技術(shù)是將PCR擴增和質(zhì)譜分析相結(jié)合的一種方法。它首先使用PCR擴增特定微生物的核酸片段，然后利用MALDI-TOF-MS對PCR產(chǎn)物進行精確的分子量測定和序列分析。該技術(shù)可以快速、準確地鑒定食品中的致病微生物。將PCR技術(shù)與ELISA、生物芯片和質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合起來，能夠充分發(fā)揮各種技術(shù)的優(yōu)勢，為食品微生物的高靈敏、多重和快速檢測提供了新的解決方案。這種聯(lián)合運用在食品安全監(jiān)測和風(fēng)險控制領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的發(fā)展趨勢

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在4個方面。①自動化、微型化和便攜化。利用微流控芯片技術(shù)和集成化技術(shù)，實現(xiàn)樣品制備、擴增反應(yīng)和產(chǎn)物檢測等步驟的自動化和一體化，同時結(jié)合無線傳輸技術(shù)，實現(xiàn)檢測數(shù)據(jù)的實時傳輸和遠程監(jiān)控[8]。②多重化和高通量化。多重PCR技術(shù)可在單個反應(yīng)中同時檢測多種目標(biāo)微生物，高通量PCR檢測平臺可同時處理數(shù)十至數(shù)百個樣品，極大地提高了檢測通量和效率。③定量化和數(shù)字化。實時熒光定量PCR和數(shù)字PCR技術(shù)可實現(xiàn)目標(biāo)微生物的準確定量，為食品安全風(fēng)險評估提供更加豐富和可靠的數(shù)據(jù)支持。④與其他檢測技術(shù)的聯(lián)用。將PCR技術(shù)與培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、生物傳感器等技術(shù)聯(lián)用，可發(fā)揮各種技術(shù)的優(yōu)勢，實現(xiàn)食品微生物檢測的全流程優(yōu)化和綜合效能提升，為食品安全和公眾健康提供更加全面、可靠、高效的保障[9]。

6 結(jié)語

PCR技術(shù)在食品微生物檢測中扮演著關(guān)鍵的角色，主要因其具備高度敏感性、特異性和快速性等優(yōu)點。近年來，一系列新型PCR技術(shù)相繼推出，其中包括多重PCR、實時熒光定量PCR和數(shù)字PCR等。這些技術(shù)的出現(xiàn)進一步增強了對食品中病原微生物的檢測效能和準確性。將PCR技術(shù)、ELISA、生物芯片和質(zhì)譜等多種技術(shù)相結(jié)合，可以為食品微生物的全面分析提供全新的研究方向。未來，食品微生物檢測領(lǐng)域?qū)⒂瓉鞵CR技術(shù)的自動化、微型化、便攜化、多重化、高通量化、定量化和數(shù)字化發(fā)展趨勢。這一技術(shù)將與其他檢測方法相結(jié)合，為食品微生物檢測提供更快速、更靈敏、更準確和更經(jīng)濟的解決方案。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，它將在食品安全保障體系中扮演日益重要的角色，為維護人們健康提供更加有力的支持。

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