摘要： 基于石油污染地下水微生物降解機制， 針對我國東北某石油污染地下水低溫、 低氧、 寡營養(yǎng)環(huán)境的特點， 采集石油污染地下水， 研究生物小分子物質(zhì)刺激石油污染地下水中土著菌降解石油烴效率. 結(jié)果表明： 以石油烴為唯一碳源， 在無機鹽基礎(chǔ)營養(yǎng)液中分別添加生物小分子氨基酸和有機磷源時， 氨基酸類物質(zhì)抑制土著菌降解石油烴， 其中抑制能力為甘氨酸（-20.49%）gt;谷氨酸（-7.81%）gt;丙氨酸（-4.88%）； 有機磷酸脂類促進(jìn)土著菌降解石油烴， 其中促進(jìn)能力為卵磷脂（7.91%）gt;甘油磷酸二鈉（7.01%）gt;磷酸三乙脂（0.03%）； 進(jìn)一步補充生物小分子碳源可提升土著菌降解效率， 其中提升能力為蔗糖（8.03%）gt;葡萄糖（6.01%）gt;麥芽糖（2.91%）； 在石油烴初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的地下水中添加無機鹽、 卵磷脂和蔗糖， 作用7 d時， 受生物小分子物質(zhì)刺激作用， 降解率可提升至77.26%； 聯(lián)合16SrRNA擴增子測序， 對刺激前后土著菌進(jìn)行高通量測序， 證明生物小分子促進(jìn)土著菌群協(xié)同代謝降解石油烴時， 石油烴優(yōu)勢菌屬豐度和功能基因表達(dá)呈正效應(yīng)關(guān)系.

關(guān)鍵詞： 生物小分子； 生物刺激； 土著菌； 石油污染地下水； 降解

中圖分類號： X523" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A" 文章編號： 1671-5489（2024）03-0750-09

Degradation Characteristics of Indigenous Bacteria in Petroleum Contaminated Groundwater Stimulated by Biological" Small Molecules

ZHANG Yi1， SHI Yujia1，2，" WANG Jili1， WANG Yiliang1， CHI Chongzhe2 ， ZHANG Yuling1

（1. College of New Energy and Environment，" Jilin University， Changchun 130021， China；

2. Changchun Gold Research Institute Co.，" Ltd.，" Changchun 130012，" China）

收稿日期：" 2023-10-19." 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)日期： 2024-03-08.

第一作者簡介：" 張" 藝（1999—），" 女，" 漢族，" 碩士研究生，" 從事地下水土污染控制與修復(fù)的研究， E-mail： 2310395168@qq.com.

通信作者簡介："" 張玉玲（1973—）， 女， 蒙古族， 博士， 教授， 從事地下水土污染控制與修復(fù)的研究， E-mail： lingling29@126.com;""" 石宇佳（1998—）， 男， 漢族， 碩士， 從事地下水土污染控制與修復(fù)的研究， E-mail： shiyj1244060668@126.com.

基金項目："" 國家重點研發(fā)計劃課題項目（批準(zhǔn)號： 2020YFC1808805; 2020YFC1808804）.

網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址：" https：//link.cnki.net/urlid/22.1340.O.20240306.1211.001.

Abstract：

Based on the microbial degradation mechanism of petroleum contaminated groundwater and the characteristics of low temperature，" low oxygen，" and oligotrophic environments in a certain petroleum contaminated groundwater in Northeast China， we collected" petroleum contaminated groundwater and" studied the efficiency of" indigenous bacteria" degrading petroleum hydrocarbons in petroleum contaminated groundwater stimulated by microbial small molecule substances. The" results show that when petroleum hydrocarbons are used as the sole carbon source and biological small molecule substances such as amino acids and organic phosphorus sources are added to the inorganic salt based nutrient solution，"" amino acid substances inhibit the degradation of petroleum hydrocarbons by indigenous bacteria，" with inhibitory ability of glycine （-20.49%）gt;glutamic acid （-7.81%）gt;alanine （-4.88%）. Organic phosphate lipids promote the degradation of petroleum hydrocarbons by indigenous bacteria，" with promoting ability of lecithin （7.91%）gt;disodium glycerophosphate （7.01%）gt;triethyl phosphate （0.03%）. Further supplementing biological small molecule carbon sources can improve the degradation efficiency of indigenous bacteria，" with the enhancement ability of sucrose （8.03%）gt;glucose （6.01%）gt;maltose （2.91%）. Adding inorganic salts，" lecithin，" and sucrose to groundwater with an initial mass concentration"" of 10 mg/L of petroleum hydrocarbon， after 7 d of stimulation，" the degradation rate can be increased to 77.26% due to the" stimulation of" biological small molecule substances. Combined with 16SrRNA amplicon sequencing，" high-throughput sequencing is performed on indigenous bacteria before and after the stimulation，" demonstrating that" there is a positive correlation between the abundance of dominant petroleum hydrocarbon genera and the expression of functional genes when biological small molecules promote the synergistic metabolism and degradation of petroleum hydrocarbons by indigenous bacterial communities.

Keywords：" biological small molecule；" bio-stimulation; indigenous bacteria； petroleum pollution of groundwater； degradation

微生物修復(fù)作為一種集綠色、 環(huán)保、 低成本等優(yōu)點為一體的石油烴污染地下水處理技術(shù)， 能很好地解決地下水中石油烴污染反彈問題， 因此受到人們廣泛關(guān)注［1-4］. 受限于地下水環(huán)境低溫、 低氧和寡營養(yǎng)等特點， 微生物缺少生長代謝必要條件， 石油烴降解效率低［5］， 通過向含水層中投加微生物代謝必需的營養(yǎng)、 能量和電子供/受體等物質(zhì)， 強化土著功能微生物代謝能力和菌群豐度， 有利于地下水中石油烴的降解［6-7］. 目前， 人們已開展了一系列基于生物刺激的石油烴修復(fù)藥劑研究：" Liao等［8］以鼠李糖脂和皂苷為表面活性劑進(jìn)行生物刺激， 發(fā)現(xiàn)隨著表面活性劑濃度的增加， 土著微生物的數(shù)量增加， 對石油烴的降解明顯增加； Wu等［9］用氮磷物質(zhì)進(jìn)行周期性的生物刺激， 使難降解石油烴的去除效率提高了10.4%～25.5%； 吳仁人等［10］發(fā)現(xiàn)谷氨酸、 脯氨酸和賴氨酸等氨基酸混合物對石油烴降解菌GS3C的代謝促進(jìn)作用最好，" 賴氨酸和脯氨酸最關(guān)鍵.

基于內(nèi)在土著微生物系統(tǒng)， 快速凈化石油污染地下水原位強化修復(fù)的關(guān)鍵是具有高效刺激性、 良好生物降解性能和遷移性能的生物刺激有效成分. 生物小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，" 易溶解、 擴散和滲透， 具有多種生物化學(xué)功能， 可提供碳、 氮、 磷等營養(yǎng)組分， 并能進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)被微生物利用， 解除石油烴對微生物生長的抑制作用、 保護(hù)和修復(fù)細(xì)胞. 在實際應(yīng)用中， 單一物質(zhì)生物刺激對土著微生物菌群的作用效果有限， 能在生物刺激過程中發(fā)揮不同功能的多物質(zhì)復(fù)合生物刺激更能高效發(fā)揮作用［11-12］. 本文以石油烴污染地下水中土著微生物為研究對象， 在基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)上， 考察不同有機生物小分子生物刺激特性， 研究適用于實際地下水環(huán)境條件的易于攝取、 穩(wěn)定性好的靶向生物小分子刺激劑，" 分析有機小分子生物刺激劑作用下土著微生物群落的響應(yīng)關(guān)系， 研究結(jié)果可為石油烴污染地下水原位土著微生物修復(fù)技術(shù)研發(fā)和工程實施提供科學(xué)依據(jù)， 具有實際應(yīng)用意義.

1" 實" 驗

1.1" 主要儀器

紫外可見分光光度計（U-T3型， 上海屹譜公司）； 全功能酶標(biāo)儀（Synergy H1M型，"" 美國寶特公司）； 氣質(zhì)聯(lián)用儀（6890/5973型， 美國Agilent公司）； 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀 （ETC 811型， 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）.

1.2" 主要材料

甘氨酸、 谷氨酸、 丙氨酸、 卵磷脂（自大豆提取）、 甘油磷酸二鈉、 磷酸三乙脂、 葡萄糖、 蔗糖、 麥芽糖、 正己烷、 磷酸二氫鉀、 磷酸氫二銨、 七水硫酸鎂、 氯化鈉和硝酸鉀等均為國產(chǎn)分析純試劑.

石油污染地下水樣采自中國東北某石油開采區(qū)， 污染水樣石油烴質(zhì)量濃度為10.00 mg/L， 石油烴主要成分是烷烴和芳香烴， 烷烴以C10～C31為代表的正構(gòu)烷烴和帶支鏈烷烴為主， 芳香烴以萘和萘的取代物為主； 微生物為石油烴污染地下水土著微生物菌群， 未進(jìn)行富集培養(yǎng). 實驗用基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽配方： 磷酸二氫鉀50.00 mg/L， 磷酸氫二銨50.00 mg/L，" 七水硫酸鎂150.00 mg/L， 氯化鈉10.00 mg/L，" 硝酸鉀10.00 mg/L.

1.3" 方" 法

1.3.1" 高效生物小分子刺激劑識別與最佳含量優(yōu)化

1） 高效氨基酸識別與最佳含量優(yōu)化.

移取適量石油污染水樣于100 mL密閉棕色玻璃瓶中， 接種2 mL菌懸液， 用石油烴污染地下水和超純水， 復(fù)配補足為石油烴質(zhì)量濃度10.00 mg/L的100 mL水樣， 先按照無機鹽配方加入基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽， 再加入不同種類的氨基酸（甘氨酸、 谷氨酸和丙氨酸）使其質(zhì)量濃度分別為 0.10，1.00，5.00，10.00，20.00 mg/L， 同時設(shè)置不添加氨基酸的空白對照組和添加氨基酸的無菌對照組， 所有處理均設(shè)置3個平行樣， 于10 ℃黑暗環(huán)境， 120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后， 利用全功能酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計分別測定微生物DNA含量和石油烴的質(zhì)量濃度.

2） 高效生物小分子磷源識別與最佳含量優(yōu)化.

在氨基酸優(yōu)化基礎(chǔ)上， 移取適量石油污染水樣于100 mL密閉棕色玻璃瓶中， 接種2 mL菌懸液， 復(fù)配補足為石油烴質(zhì)量濃度10.00 mg/L的100 mL水樣， 先按照無機鹽配方加入基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽， 再加入不同種類生物小分子磷源（卵磷脂、 甘油磷酸二鈉和磷酸三乙脂）使其質(zhì)量濃度分別為 0.10，1.00，5.00，10.00，20.00 mg/L， 同時設(shè)置不添加小分子磷源的空白對照組和添加小分子磷源的無菌對照組， 所有處理均設(shè)置3個平行樣， 于10 ℃黑暗環(huán)境， 120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后， 利用全功能酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計分別測定微生物DNA含量和石油烴質(zhì)量濃度.

3） 高效電子供體輔助碳源識別與最佳含量優(yōu)化.

在生物小分子磷源優(yōu)化基礎(chǔ)上， 移取適量石油污染水樣于100 mL密閉棕色玻璃瓶中， 接種2 mL菌懸液， 復(fù)配補足為石油烴質(zhì)量濃度10.00 mg/L的100 mL水樣， 先按照無機鹽配方加入基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽， 再加入不同種類輔助電子供體（葡萄糖、 蔗糖和麥芽糖）使其質(zhì)量濃度分別為0.10，1.00，5.00，10.00，20.00 mg/L， 同時設(shè)置不添加小分子輔助碳源的空白對照組和添加小分子輔助碳源的無菌對照組， 所有處理均設(shè)置3個平行樣， 于10 ℃黑暗環(huán)境， 120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后， 利用全功能酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計分別測定微生物DNA含量和石油烴質(zhì)量濃度.

1.3.2" 復(fù)合生物小分子作用效果分析

移取適量石油污染地下水置于1 L密閉棕色玻璃瓶中， 接種20 mL菌懸液， 復(fù)配補足為石油烴質(zhì)量濃度10.00 mg/L的1 L水樣， 按照無機鹽配方加入基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽和生物小分子（卵磷脂10 mg、 蔗糖10 mg）， 同時設(shè)置空白對照組和無菌對照組， 所有處理均設(shè)置3個平行樣， 于10 ℃黑暗環(huán)境， 120 r/min振蕩培養(yǎng)， 每隔12 h利用全功能酶標(biāo)儀和紫外可見分光光度計分別測定微生物DNA含量和石油烴質(zhì)量濃度. 同時分別對復(fù)合生物小分子投加前和投加后7 d的地下水樣本進(jìn)行16SrRNA測序， 分析復(fù)合生物小分子投加對石油烴污染地下水中微生物群落的影響， 用熒光定量 PCR儀進(jìn)行16SrRNA 擴增， 由上海生物工程有限公司對微生物多樣性測序和宏基因組高通量測序.

2" 結(jié)果與討論

2.1" 高效生物小分子刺激劑識別與最佳含量優(yōu)化

2.1.1" 高效氨基酸識別與最佳含量優(yōu)化

氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子， 氨基酸類營養(yǎng)透過細(xì)胞膜直接被微生物吸收時必然影響蛋白質(zhì)的合成速度， 對微生物的生理活動也產(chǎn)生相應(yīng)影響， 在無機鹽基礎(chǔ)上， 添加氨基酸對土著菌生長和石油烴降解的影響如圖1所示. 由圖1（A）可見， 以石油烴為唯一碳源， 丙氨酸、 甘氨酸和谷氨酸均在一定程度上刺激微生物生長， 氨基酸添加量與微生物生物量明顯相關(guān)， 當(dāng)氨基酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時， 刺激微生物生長效果最佳， 甘氨酸、 谷氨酸和丙氨酸刺激下微生物生物量分別達(dá)到3.35，3.78，2.08 ng/μL， 推測與氨基酸組成相關(guān)， 甘氨酸、 谷氨酸、 丙氨酸成分和微生物生長相關(guān)表達(dá)蛋白的氨基酸組成相似， 菌體利用相似組分氨基酸， 刺激微生物生長， 刺激作用與相關(guān)蛋白相似度有關(guān). 由圖1（B）可見，" 添加的3種氨基酸均可抑制石油烴降解， 其中抑制能力為甘氨酸gt;谷氨酸gt;丙氨酸.nbsp; 吳仁人［13］研究表明， 添加甘氨酸會明顯促進(jìn)正十六烷降解， 排除了谷氨酸作為微量氮源促進(jìn)降解的可能性； Srensen等［14］研究表明， 當(dāng)未添加甘氨酸時， 其他氨基酸混合物不影響鞘氨醇單胞菌對異丙隆的降解， 可見不同微生物對微量生長因子需求的種類和數(shù)量不同， 推測甘氨酸、 谷氨酸和丙氨酸作為氮源滿足土著菌中非降解菌生長需求， 與降解菌產(chǎn)生營養(yǎng)競爭關(guān)系， 從而影響降解效果.

2.1.2" 高效生物小分子磷源識別與最佳含量優(yōu)化

生物小分子磷源物質(zhì)提供必需的磷元素以調(diào)節(jié)菌體內(nèi)的磷攝取平衡， 提高微生物代謝能力. 在無機鹽基礎(chǔ)上， 添加生物小分子磷源物質(zhì)對土著菌生長和石油烴降解的影響如圖2所示. 由圖2可見： 以石油烴為唯一碳源， 添加0.1～10 mg/L的甘油磷酸二鈉刺激微生物生長， 生物量為1.23～3.35 ng/μL， 僅在5 mg/L時石油烴降解率有所上升， 降解率為67.34%， 推測甘油磷酸二鈉刺激了土著微生物中與降解微生物處在營養(yǎng)競爭中的非降解菌群的生長； 當(dāng)添加0.1～20 mg/L的磷酸三乙脂刺激時， 石油烴降解率略降低； 當(dāng)添加10～20 mg/L的卵磷脂時， 可刺激微生物生長， 生物量可達(dá)3.81 ng/μL， 正向刺激石油烴降解， 降解率可達(dá)68.46%." 卵磷脂是細(xì)胞膜主要組成物質(zhì)， 細(xì)胞膜調(diào)控細(xì)胞新陳代謝過程， 推測補充卵磷脂直接提升了降解菌群的自我修復(fù)能力、 信息傳遞能力、 抵御外部侵害能力以及再生能力等， 作為兩性分子的卵磷脂在調(diào)節(jié)菌體內(nèi)磷攝取平衡的同時， 具有表面活性劑的性質(zhì)， 能改良溶解度和流動性以提高石油烴生物可利用度， 因此選用10 mg/L的卵磷脂作為最佳生物小分子磷源.

2.1.3" 高效電子供體輔助碳源識別與最佳含量優(yōu)化

部分碳源類物質(zhì)可作為電子供體， 驅(qū)動微生物代謝過程， 在卵磷脂的基礎(chǔ)上， 添加電子供體輔助碳源生物小分子物質(zhì)對土著菌生長和石油烴降解的影響如圖3所示. 由圖3可見： 在添加0.1～20 mg/L麥芽糖刺激下， 微生物迅速生長， 生物量與麥芽糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)， 在添加5～10 mg/L麥芽糖刺激下， 石油烴降解率為70.06%～72.11%； 在添加0.1～5 mg/L葡萄糖刺激下， 微生物的生長量降低， 降解效率最高上升至75.06%； 添加1～20 mg/L蔗糖刺激微生物生長， 生物量為1.23～3.35 ng/μL， 生物量與蔗糖的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)， 但僅在蔗糖質(zhì)量濃度為10 mg/L時， 石油烴降解率上升， 為77.26%." 推測在較低質(zhì)量濃度時， 蔗糖和石油烴作為競爭碳源， 抑制了微生物對石油烴的降解作用， 在10 mg/L時， 降解微生物迅速生長， 蔗糖作為電子供體驅(qū)動代謝過程，" 反應(yīng)體系主要發(fā)生蔗糖的降解作用， 微生物主要利用蔗糖作為碳源抑制石油烴降解， 因此選用10 mg/L的蔗糖作為最佳電子供體輔助碳源." Schukat等［15］研究了葡萄糖共代謝對一氯苯胺降解的影響， 發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖可促進(jìn)有關(guān)苯胺降解的酶生成." 本文研究表明， 加入共代謝基質(zhì)葡萄糖、 蔗糖和麥芽糖均可在一定程度上促進(jìn)土著微生物的降解性能.

2.2" 復(fù)合生物小分子刺激作用效果分析

在添加和未添加復(fù)合生物小分子的石油烴污染地下水中， 土著微生物狀況及石油烴降解效果如圖4所示. 由圖4（A）可見： 當(dāng)未添加復(fù)合生物小分子時， 土著微生物生長較慢， 2 d內(nèi)微生物量達(dá)到峰值0.71 ng/μL， 之后土著微生物生長處于穩(wěn)定期， 微生物量維持在0.31～0.61 ng/μL； 在添加復(fù)合生物小分子后， 土著微生物快速生長， 2 d內(nèi)地下水中土著微生物量從0.07 ng/μL增加到4.07 ng/μL， 之后保持在2.26～3.83 ng/μL， 7 d內(nèi)土著微生物量的增長量最高可達(dá)5.73倍.

由圖4（B）可見：" 由于地下水中有效碳源含量明顯降低， 因此土著微生物對石油烴的降解在3 d后趨于平緩， 土著微生物在3 d內(nèi)對添加與未添加復(fù)合生物小分子的石油烴污染地下水的降解率分別為77.26%和60.10%； 相比于未添加復(fù)合生物小分子， 土著微生物對石油烴的降解效率在3 d內(nèi)增加了17.16個百分點， 石油烴降解效果明顯提升， 之后隨著地下水中石油烴的消耗， 微生物能利用的有效碳源含量明顯降低， 導(dǎo)致地下水中土著微生物量下降， 但石油烴降解效率基本保持不變.

根據(jù)復(fù)合刺激藥劑的含氮量和含磷量， 計算出添加物質(zhì)的氮磷比（n（N）∶n（P））為3.19∶1." 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成和營養(yǎng)類型決定了細(xì)胞的營養(yǎng)需求， 石油降解菌主要是化能異養(yǎng)菌， 在異養(yǎng)菌的生長繁殖過程中， 營養(yǎng)物質(zhì)的供給平衡應(yīng)與細(xì)菌細(xì)胞的元素組成相對應(yīng)， 添加藥劑的氮磷比為3.19∶1與細(xì)胞元素組成中氮磷比約4.67∶1相近， 藥劑刺激下石油烴降解過程呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性， 與文獻(xiàn)［16］結(jié)果相符. 由于未添加有機氮源物質(zhì)刺激， 微生物對氮源供給敏感， 藥劑氮磷比可進(jìn)一步優(yōu)化， 同時受限于微生物代謝特性和適應(yīng)能力差異， 因此即使添加了磷源和碳源也未實現(xiàn)石油烴降解效率的大幅度提升.

復(fù)合刺激前后微生物降解石油烴動力學(xué)擬合結(jié)果如圖5所示， 由圖5可見， 復(fù)合刺激后二級降解動力學(xué)方程擬合效果最佳， 動力學(xué)方程為y=0.003 3x+0.016 7， R2gt;0.900 0. 在無機鹽基礎(chǔ)上， 不同生物小分子物質(zhì)促進(jìn)降解效果（以促進(jìn)降解率增長的百分?jǐn)?shù)表示促進(jìn)降解效果）如圖6所示. 由圖6可見， 按對石油烴降解刺激降解效果排列， 生物小分子磷源類物質(zhì)： 卵磷脂gt;甘油磷酸二鈉gt;磷酸三乙脂； 電子供體輔助碳源物質(zhì)： 蔗糖gt;葡萄糖gt;麥芽糖； 氨基酸物質(zhì)抑制降解效果： 甘氨酸gt;谷氨酸gt;丙氨酸. 卵磷脂滿足微生物生長所需磷元素的同時， 可促進(jìn)石油烴溶解， 改變其生物利用度， 磷素本身沒有電子移動功能， 復(fù)合蔗糖作為電子供體參與氧化還原反應(yīng)， 驅(qū)動代謝過程， 提高了石油烴降解效率， 作為磷源的卵磷脂和作為電子供體的蔗糖刺激降解效果相似， 分別刺激增長了7.91和8.03個百分點.

2.3" 復(fù)合生物小分子刺激下微生物群落響應(yīng)特征

2.3.1" 微生物群落組成變化

在復(fù)合生物小分子刺激下， 石油烴污染地下水中微生物群落組成發(fā)生了明顯變化， 結(jié)果如圖7所示. 由圖7可見：" 在微生物門水平上， 復(fù)合生物小分子投加后Proteobacteria（變形菌）相對豐度基本不發(fā)生變化， Actinobacteria（放線菌）的相對豐度降低了0.68個百分點， Bacteroidetes（擬桿菌）的相對豐度升高了5.34個百分點； 在微生物屬水平上， 優(yōu)勢菌屬Pseudomonas（假單胞菌）的相對豐度在復(fù)合生物小分子投加后由61.89%下降至55.49%， 微生物菌屬Janthinobacterium（詹森菌）、 Dyadobacter（成對桿菌）、 Rhizobium（根瘤菌）、 Caulobacter（柄桿菌）、 Brevundimonas（短波單胞菌）、 Sphingobium（鞘脂菌）和Novosphingobium（新鞘脂菌）的相對豐度有不同程度的增加； 在復(fù)合生物小分子投加后， 石油烴污染地下水中大多數(shù)優(yōu)勢微生物具有石油烴降解能力， 通過介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)而氧化有機物的微生物占比明顯提高， 如Janthinobacterium能參與無機電子供/受體的轉(zhuǎn)化過程， 具有將多種復(fù)雜有機物作為能源和碳源進(jìn)行生長的能力［17］； Rhizobium屬于固氮菌， 具有降解多種多環(huán)芳烴的能力［18］； Caulobacter具有通過介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)而氧化有機物的能力［19］； Pseudomonas能將多種類型的碳?xì)浠衔镒鳛槲ㄒ坏奶荚春湍茉矗?能高效去除石油污染環(huán)境中的飽和脂肪烴［20］." 復(fù)合生物小分子物質(zhì)提供了更多種類和量的營養(yǎng)刺激， 地下環(huán)境中石油烴降解功能微生物快速生長， 激發(fā)了優(yōu)勢菌屬的生物活性， 提高了土著微生物群落系統(tǒng)中無機電子供/受體的轉(zhuǎn)換能力， 達(dá)到高效降解石油烴的目的.

2.3.2" 微生物群落代謝功能變化

微生物群落代謝功能基因豐度變化可反映復(fù)合生物小分子投加對微生物群落的影響， 基于FAPROTAX數(shù)據(jù)庫功能預(yù)測微生物群落代謝功能如圖8所示.

由圖8可見： 復(fù)合生物小分子投加后， 微生物群落有關(guān)碳、 氮和硫循環(huán)方面的功能基因豐度分別提高了3.68，5.86和0.89個百分點， 其中微生物群落有關(guān)碳循環(huán)功能基因豐度變化主要與好氧化能異養(yǎng)和化能異養(yǎng)相關(guān)， 與氮循環(huán)功能基因豐度變化主要與硝酸還原和氮呼吸相關(guān)， 與硫循環(huán)功能基因豐度變化主要與硫化物的暗氧化相關(guān)； 地下水環(huán)境中的石油類污染物的降解主要在化能異養(yǎng)型微生物的參與下完成， 在該過程中微生物以石油烴為碳源， 通過參與硫和氮循環(huán)過程獲得電子受體， 將生物無法直接利用的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可直接利用的能量形式（即腺苷三磷酸（ATP））而氧化有機污染物［21］； 微生物群落與石油烴代謝途徑直接相關(guān)的功能基因豐度也有不同程度的提高， 微生物群落有關(guān)碳?xì)浣到狻?脂族非甲烷碳?xì)浠衔锝到狻?芳香化合物降解和芳香烴碳?xì)浣到饣虻南鄬ωS度在復(fù)合生物小分子投加后分別提高了2.50，1.49，4.76和2.66個百分點， 表明微生物對有利于石油烴降解的條件做出了積極響應(yīng)， 向地下水中投加復(fù)合生物小分子提高了微生物群落系統(tǒng)中無機電子供/受體的轉(zhuǎn)換能力， 加強了微生物菌屬間的共代謝機制， 增強了微生物群落降解石油烴效率， 達(dá)到高效降解石油烴的目的.

3" 結(jié)" 論

1） 在營養(yǎng)鹽基礎(chǔ)上， 向石油污染地下水中添加不同種類和濃度的生物小分子物質(zhì)進(jìn)行生物刺激修復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)： 添加氨基酸可抑制石油烴降解， 添加生物小分子物質(zhì)磷源和電子供體輔助碳源可刺激石油烴降解， 其中卵磷脂與蔗糖是最關(guān)鍵有效的營養(yǎng)刺激因子；

2） 研究得到一個復(fù)合生物刺激劑配方： 磷酸二氫鉀50.00 mg/L，"" 磷酸氫二銨 50.00 mg/L， 七水硫酸鎂 150.00 mg/L，" 氯化鈉10.00 mg/L， 硝酸鉀 10.00 mg/L，" 卵磷脂10.00 mg/L， 蔗糖10.00 mg/L， 刺激劑作用7 d時石油烴降解率由59.24%提升至77.26%， 微生物降解石油烴二級動力學(xué)方程為y=0.003 3x+0.016 7， R2gt;0.900 0；

3） 揭示了外加生物小分子物質(zhì)實現(xiàn)高效降解效率的原因并確認(rèn)關(guān)鍵菌屬， 外加生物小分子物質(zhì)刺激石油烴關(guān)鍵降解菌Proteobacteria豐度相對穩(wěn)定， Bacteroidetes豐度明顯提升， 改善了降解體系的微生物群落結(jié)構(gòu)， 強化了微生物相關(guān)代謝相應(yīng)功能基因的表達(dá)， 達(dá)到高效降解石油烴的目的.

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