吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物質(zhì)活性成分研究與高附加值農(nóng)產(chǎn)品實驗室， 長春 130118）

摘要： 以大型真菌靈芝中的麥芽糖酶-葡萄糖淀粉酶（MGAM）為研究對象， 采用同源序列比對、 同源模建、 底物對接和定點突變等方法成功構(gòu)建酶活力顯著降低的突變體D246A. 酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果表明： 最適反應(yīng)溫度由野生型（wild type， WT）的65 ℃減少至60 ℃， 突變體耐熱能力下降； 最適pH值由WT的6.0升高至7.0， 有利于工程菌生長； 半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h， 酶穩(wěn)定性降低." 酶動力學(xué)結(jié)果表明： 突變體D246A酶動力學(xué)曲線符合Michaelis方程， 與WT相比， Km值變大， 表明酶與底物親和力下降； Vmax約降低至原來的1/4.

關(guān)鍵詞： 定點突變； 異源表達(dá)； 性質(zhì)表征； 麥芽糖酶-葡萄糖淀粉酶

中圖分類號： Q556" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A" 文章編號： 1671-5489（2024）03-0742-08

Heterologous Expression and Property Characterization of Maltase-Glucoamylase D246A

GAO Yuqing，" DONG Gangyin，" ZHANG Hongrui， MA Zhanshan， FANG Li，" ZHAN Dongling

（College of Food Science and Engineering，" Jilin Agricultural University，" Changchun 130118，" China;" Laboratory of Biomass Active Ingredient Research and High Value of Agricultural Products， Jilin Agricultural University，" Changchun 130118， China）

收稿日期：" 2023-07-28.

第一作者簡介：" 高雨晴（1996—）， 女， 漢族， 碩士， 從事生物大分子空間結(jié)構(gòu)改造的研究， E-mail：" 1571624810@qq.com.

通信作者簡介："" 方" 麗（1981—）， 女， 漢族， 碩士， 高級實驗師， 從事酶分子改造的研究，" E-mail： fangli1014@126.com； 詹冬玲（1977—）， 女， 漢族， 博士， 副教授，" 從事食品生物化學(xué)的研究， E-mail： "zdlgale@126.com.

基金項目："" 吉林省自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號： 20230101262JC）.

Abstract：

The" maltase-glucoamylase （MGAM） from the large fungus Ganoderma lucidum" as the research object，" and a mutant D246A with significantly reduced enzyme activity was successfully constructed by using methods such as homologous sequence alignment，" homologous modeling，" substrate docking，" and site-specific mutation. The characterization results of enzymatic properties show that" the optimal reaction temperature decreases from 65 ℃ for wild type （WT） to 60 ℃， and the heat tolerance of the mutant decreases. The optimal pH value increases from 6.0 for WT to 7.0，" which is beneficial for the growth of engineering bacteria." The half-life decreases from 2.0 h for WT to 1.5 h，" the stability of enzyme decreases. The enzyme kinetics results show that" the enzyme kinetics curve of mutant D246A conforms to the Michaelis equation， and"" compared with the WT， the Km value increases，" indicating a decrease in affinity of enzyme and substrate." Vmax decreases to 1/4 of its original value.

Keywords： site-specific mutation； heterologous expression； property characterization；" maltase-glucoamylase

0" 引" 言

麥芽糖酶-葡萄糖淀粉酶（maltase-glucoamylase，" MGAM； EC 3.2.1.20和EC 3.2.1.3）， 也稱為MG或MGA， 是一種α-葡萄糖苷水解酶消化酶， 屬于糖苷水解酶家族31的成員（GH31）［1］. MGAM是一種小腸膜結(jié)合酶， 它能水解包含α-1，4糖苷鍵的葡萄糖低聚物或糊精， 并在血液中釋放葡萄糖， 對人體內(nèi)葡萄糖的生成起關(guān)鍵作用［2-3］. 調(diào)節(jié)MGAM活性在控制餐后高血糖中起重要作用， 對2型糖尿病的治療具有深遠(yuǎn)意義［4-5］.

目前對MGAM的研究主要集中在外源化合物或植物提取物對MGAM抑制效果的影響方面." Mehrban等［6］選擇四嘧啶稠雜環(huán)化合物與MGAM-C/N結(jié)合， 對接評估表明， 這些配體與MGAM-C/N的結(jié)合特性幾乎與阿卡波糖（α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物）相似， 分別在MGAM C-末端與Tyr 1251和MGAM N-末端與Arg 526建立了氫鍵， 增強(qiáng)了配體與MGAM-C/N的親和能力. 劉偉［7］報道了雞血藤、 五倍子、 丹參和青果提取物均能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性， 抑制作用均明顯強(qiáng)于阿卡波糖. 以上研究結(jié)果為開發(fā)安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了理論依據(jù).

目前， MGAM-N和MGAM-C末端晶體結(jié)構(gòu)均已被解析（圖1）， 但對MGAM-N/C自身結(jié)構(gòu)改造的研究較少，" 且目前對MGAM的研究多集中于人和動物. 本文以大型真菌靈芝中的MGAM為研究對象， 結(jié)合生物信息學(xué)方法， 通過與底物對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）對接， 選擇關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行定點突變， 并對突變體進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征， 通過對D246位點考察底物對MGAM的影響， 研究其對酶活力的影響及在靈芝代謝中的作用， 為研制新型α-葡萄糖苷酶抑制劑提供一種新思路， 為幫助治療2型糖尿病提供理論依據(jù).

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

1.1.1" 菌株、 質(zhì)粒與培養(yǎng)基

靈芝購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工技術(shù)集成科研基地；" 重組大腸桿菌菌株（pET-15b-MGAM）、 表達(dá)宿主（Escherichia coli）BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-15b均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)活性成分研究與農(nóng)產(chǎn)品高值化實驗室保存.

LB培養(yǎng)基： 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%的酵母提取物、 1%的胰蛋白胨、 1%的氯化鈉和2%的瓊脂粉.

1.1.2" 試" 劑

Ni SepharoseTM6 Fast Flow購自美國General Electric公司； 核酸電泳Marker（DL2000，DL15000）和預(yù)染彩虹蛋白Marker （10 000～190 000）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司； 質(zhì)粒小提試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司； 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素（Amp）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

1.2"" 儀器與設(shè)備

梯度PCR儀（SureCycler 8800型， 美國Agilent公司）； 蛋白電泳儀（DYY-11型， 拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司）； 瓊脂糖凝膠呈像儀（WFH-201BJ型， 美國GE公司）； 多功能酶標(biāo)儀（FLUOstar Omega型， 德國BMG公司）； 電泳儀電源（SE260型，" 美國GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）； 蛋白印跡半干轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot SDCell型， 美國BIO-RAD公司）； 超聲波細(xì)胞破碎儀（JY88-Ⅱ型， 江蘇天翎儀器有限公司）.

1.3"" 方" 法

1.3.1"" 重要殘基位點的確定

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中Protein Blast程序進(jìn)行同源蛋白晶體搜索， 利用SWISS-MODEL在線服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/interactive#sequence）對MGAM進(jìn)行同源模建， 利用SAVES v5.0服務(wù)器（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/？job=315211）對MGAM三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評分， 利用軟件COACH-D在線服務(wù)（http：//yanglab.nankai.edu.cn/COACH-D/）對結(jié)合位點底物pNPG進(jìn)行預(yù)測， 利用Auto Dock進(jìn)行對接， 確定酶與底物結(jié)合區(qū)域的重要殘基位點， 選取密切相關(guān)的保守殘基位點進(jìn)行定點突變.

1.3.2" 突變體引物設(shè)計

利用CE Design軟件進(jìn)行D246位點引物設(shè)計， 由長春庫美生物進(jìn)行合成， 引物序列為

F： 5′-ACGAACTGGGCCCGCGCCGCCGCCGAC-3′; R： 5′-GCGCGGGCCCAGTTCGTCTGGATGGTAC-3′.

1.3.3" 突變體的構(gòu)建

以實驗室保存且構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-15b-MGAM為模板， 在D246A引物作用下進(jìn)行突變PCR， 條件為： 94 ℃預(yù)變性1 min； 94 ℃變性1 min， 56 ℃退火1 min， 72 ℃延伸10 min（以上3步循環(huán)18次）; 72 ℃保溫10 min. 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的核酸電泳驗證.

1.3.4" 目的基因誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將突變重組菌株以1%的接種量接入含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 加入終濃度1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá). 誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行高速低溫離心， 棄上清液， 菌體重懸， 經(jīng)超聲破碎后再次收集的上清液即為粗酶液. 粗酶液經(jīng)Ni-NTA親和層析， 用不同濃度咪唑進(jìn)行洗脫， 收集純化［8］.

1.3.5" SDS-PAGE電泳

按文獻(xiàn)［9］對MGAM粗酶液和純化液進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗證.

1.3.6" 酶活力測定

野生型（WT）和突變體（D246A）的酶活力測定方法參考文獻(xiàn)［10］， 每個樣品測定3次平行.

1.3.7" 酶學(xué)性質(zhì)分析

1） 最適溫度. 以濃度為0.01 mol/L硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）為底物， 分別在不同溫度（30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃）下反應(yīng)10 min， 測定酶活. 最高酶活定義為100%， 計算相對酶活， 每個溫度測定3次平行， 根據(jù)相對酶活確定重組酶的最適溫度.

2） 最適pH值. 以pNPG為底物， 加入不同pH值的緩沖液（pH=4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0）， 在最適溫度下反應(yīng)10 min， 最高酶活定義為100%， 計算相對酶活， 每個pH測定3次平行， 確定重組酶的最適pH值.

3） 穩(wěn)定性. 取適量純酶液在最適溫度、 最適反應(yīng)pH值下， 采用同樣方法測定重組酶的酶活. 將0時刻的酶活定義為100%， 之后每隔0.5 h測定一次， 計算相對酶活， 共測量8次.

1.3.8" 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)測定3次， 用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，" 用Origin 2021軟件做圖.

2" 結(jié)果與分析

2.1" 關(guān)鍵殘基位點的確定

MGAM模型的評分結(jié)果如圖2所示. 由圖2（A）可見， 經(jīng)多重序列比對，" MGAM與α-葡萄糖苷酶蛋白PBD 3W37同源性達(dá)36.44%， 同源性30%以上即可用于建模， 所以采用SWISS-MODEL進(jìn)行初始三維建模. 由圖2（B）可見， MGAM模型經(jīng)QMEAN評分為0.64， 說明模型與模板蛋白的匹配度符合標(biāo)準(zhǔn).

通過Autodock 4.2程序?qū)⒌孜飌NPG和酶進(jìn)行分子對接， 其最優(yōu)構(gòu)象能量圖如圖3所示. 由圖3可見， 得到的最優(yōu)構(gòu)象能量為-22.61 kJ/mol. 將活性中心的殘基T270，D246，S272，E728，R746，P752通過FoldX進(jìn)行丙氨酸掃描計算， 發(fā)現(xiàn)D246的能量變化最大， 推測其可能對酶的活力變化有重大作用. 圖4為酶與底物對接平面圖. 由圖4可見， 酶與底物分子對接后， 在底物結(jié)合口袋的周圍有多個重要殘基位點， 其中Ile676和Ser675與底物之間有1個氫鍵連接， Asp246與底物之間有3個氫鍵連接.

圖5為部分同源序列比對結(jié)果. 由圖5可見： Phe266，Arg267，Arg268，Ala243，Arg245，Asp246，Asp249和Pro250等殘基位點均為絕對保守位點；" 相比于突變?yōu)镾er和Lys， Asp246突變?yōu)锳la更穩(wěn)定， 能量更低. 因此， 選取絕對保守且與pNPG密切相關(guān)的關(guān)鍵殘基位點D246A進(jìn)行單一定點突變.

GB： Ganoderma boninense （100%）; LT： Lentinus tigrinus ALCF2SS-7 （49.13%）; BE： Brazilian edible mushroom （45.46%）; FA： Flammula alnicola （46.83%）; HS： Heliocybe sulcata （45.51%）.

2.2" 全質(zhì)粒PCR獲得突變體D246A

全質(zhì)粒PCR結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見， 條帶1，2，3，4在8 000～9 000 bp有明顯的條帶， WT和D246A核酸的相對分子質(zhì)量與預(yù)期一致， 經(jīng)測序表明突變成功， 證明全質(zhì)粒PCR實驗成功.

2.3" SDS-PAGE 驗證

SDS-PAGE驗證結(jié)果如圖7所示. 由圖7可見， 條帶4為粗酶液電泳結(jié)果， 條帶2，3為經(jīng)過Ni柱分離純化的純化液電泳結(jié)果. 結(jié)果表明， 在約90 000處出現(xiàn)純化酶的目的條帶， 即MGAM蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、 分離純化成功.

M： Marker； 1：" WT粗酶液； 2～4： D246A.

M： Marker； 1，4：" MGAM粗酶液； 2，3： D246A.

2.4" 野生型和突變體的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.4.1" 溫度和pH值對酶活力的影響

溫度和pH值對WT和D246A酶活力的影響如圖8所示." 由圖8（A）可見， 隨著溫度的升高， WT和D246A的空間構(gòu)象逐漸形成， 酶的活性逐漸變高. 當(dāng)溫度為60 ℃時， D246A的空間構(gòu)象達(dá)到最佳狀態(tài)， 但WT的相對酶活力未達(dá)到100%. 當(dāng)溫度為65 ℃時， WT的空間構(gòu)象達(dá)到最佳狀態(tài). 通過二者對比發(fā)現(xiàn)進(jìn)行定點突變之后酶的最適溫度沒有比WT高， 即D246A的嗜熱能力并未增強(qiáng).

由圖8（B）可見， WT的最適pH值為6.0， D246A的最適pH值為7.0， 此時酶的空間構(gòu)象達(dá)到最佳狀態(tài). 通過二者對比發(fā)現(xiàn)進(jìn)行定點突變后酶的最適pH值變大." 最適pH值增大有利于工程菌生長.

2.4.2" 酶的穩(wěn)定性

WT和D246A的穩(wěn)定性如圖9所示.

WT和D246A的穩(wěn)定性

由圖9可見，" 在最適溫度和最適pH值的條件下， 在0.5 h時， WT和D246A相對酶的活力均可達(dá)60%以上， 在1 h后， D246A的相對酶活力降到50%以下，" 但此時WT的相對酶活力仍在60%以上. 可見， D246A不如WT的熱穩(wěn)定性好.

2.4.3" 金屬離子對WT和D246A相對酶活力的影響

金屬離子對WT和D246A相對酶活力的影響分別列于表1和表2. 由表1和表2可見，" Na+和K+對WT和D246A的酶活力均有抑制作用. 中低濃度的Cu2+對WT和D246A的酶活力有明顯的激活作用， 而當(dāng)c（Cu2+）=10 mmol/L時， Cu2+對D246A呈抑制作用. Al3+和Fe3+對WT和D246A的酶活力均無激活作用， 且低濃度大于高濃度時的抑制作用.

2.4.4" 有機(jī)溶劑對WT和D246A相對酶活力的影響

有機(jī)溶劑對WT和D246A相對酶活力的影響分別列于表3和表4. 由表3和表4可見， 不同濃度有機(jī)溶劑對WT和D246A的相對酶活力產(chǎn)生不同影響. 當(dāng)甲醇濃度為5，10 mmol/L時， 對D246A呈抑制作用， 但對WT呈激活作用. 當(dāng)DMSO濃度為5，10，15 mmol/L時， 對WT和D246A均呈激活作用， 且對WT的激活作用更大. 當(dāng)乙醇濃度為5 mmol/L時， 對WT和D246A均呈抑制作用， 而濃度為10 mmol/L時， 對WT和D246A均呈激活作用. 當(dāng)丙三醇濃度為5，10 mmol/L時， 對WT呈激活作用，" 而對D246A呈抑制作用.

2.5" WT和D246A的動力學(xué)分析

WT和D246A的動力學(xué)參數(shù)列于表5. 由表5可見， 與WT相比， D246A的Km變大， 酶對底物的親和力降低， Vmax約降至其1/4.

圖10為酶與底物結(jié)合的示意圖， 其中圖10（A）為WT的第246位點Asp與底物結(jié)合位點圖， 圖10（B）為D246A的第246位點Ala與底物結(jié)合位點圖. 由圖10可見， 第246位點由極性帶負(fù)電的天冬氨酸突變?yōu)榉菢O性的丙氨酸后， 酶與底物結(jié)合緊密度發(fā)生改變. WT與底物之間由3個氫鍵連接變?yōu)?個氫鍵連接， D246A與底物結(jié)合時氫鍵數(shù)目減少. 這可能因為該點主要參與底物結(jié)合， 影響了結(jié)合口袋的形狀， 單點氨基酸的改變， 使得與底物結(jié)合不牢固， 空間構(gòu)象發(fā)生變化， 新的空間構(gòu)象不利于酶對底物的親核進(jìn)攻， 從而使酶活力下降.

綜上所述， 本文利用生物信息學(xué)方法， 確定了MGAM的重要位點D246， 并對其進(jìn)行定點突變， 獲得突變體D246A. 對野生型和突變體進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征的結(jié)果表明：" 突變體D246A較WT最適反應(yīng)溫度下降， 最適反應(yīng)pH值升高， 穩(wěn)定性下降， 酶活力下降， 即突變獲得成功； 突變體D246A比WT的Km大， Vmax約降至其1/4， 即突變體對底物的親和力下降， 可能是因為突變體與底物結(jié)合時氫鍵數(shù)目減少， 與底物結(jié)合不牢固， 新的空間構(gòu)象不利于酶對底物的親核進(jìn)攻所致. 以上研究結(jié)果為MGAM的篩選和工業(yè)化應(yīng)用提供了理論依據(jù).

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