摘要：為尋求能廣泛用于不同遺傳背景下高油品種選育的含油量篩選的分子標(biāo)記，利用前人研究結(jié)果，開發(fā)了油菜含油量KASP分子標(biāo)記，進(jìn)行了KASP分子標(biāo)記篩選試驗。結(jié)果表明：通過F2群體驗證，該標(biāo)記與A05染色體上含油量QTL緊密連鎖，這將助力于在長江中游地區(qū)定向選育高含油量“豐（灃）油”系列油菜品種。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；含油量；KASP標(biāo)記

中圖分類號：S565.403.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）04-0015-03

Development of a KASP Marker on Chromosome A05 for Seed Oil Content of Brassica napus

YANG Qian1，2，LI Bao1，2，GUO Yi-ming1，LIU Xin-hong1，WANG Tong-hua1

（1. Crop Research Institute of Hunan Province， Changsha 410125， PRC; 2. Yuelushan Laboratory， Changsha 410128， PRC）

Abstract： To identify the molecular markers that can be widely used in the breeding of Brassica napus cultivars with high seed oil content under different genetic backgrounds， we developed a Kompetitive Allele-Specific PCR （KASP） marker for seed oil content on the basis of the available research results. The verification with the F2 population suggested that the marker was closely linked to the quantitative trait locus conferring seed oil content on chromosome A05. The findings are conducive to the directed breeding of 'Fengyou' cultivars with high seed oil content in the middle reaches of the Yangtze River.

Key words： Brassica napus; seed oil content; KASP marker

近年來，我國食用油自給率僅30%左右，需大量依賴進(jìn)口[1]。按照70%的安全標(biāo)準(zhǔn)，我國還需要增加40%的自給率。菜籽油占我國國產(chǎn)食用植物油50%以上[2]，考慮季節(jié)、茬口矛盾等因素，提高菜籽油產(chǎn)量，是提高食用油自給率的最有效途徑。菜籽油產(chǎn)量取決于菜籽產(chǎn)量和含油量，根據(jù)2008—2019

年國家油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系農(nóng)戶固定觀察點18省份4 541個有效樣本的油菜成熟期田間測產(chǎn)數(shù)據(jù)，我國油菜生產(chǎn)經(jīng)12 a實際單產(chǎn)僅增長300 kg/hm2[3]，表明短時間內(nèi)想通過提高油菜單產(chǎn)提高產(chǎn)油量的途徑難以實現(xiàn)。我國油菜品種與歐洲品種相比含油量相差4%～6%[4]，還有較大提升空間，每提升含油量1%，相當(dāng)于產(chǎn)量提升2.2%～2.3%[5]。因此，提高種子含油量是提升產(chǎn)油量、緩解食用油進(jìn)口依賴度的最有效途徑之一。

油的本質(zhì)為甘油三酯（TAG，Triacylglycerols），合成后在植物種子或果實中積累。油合成的生化機理較為清晰，主要包括脂肪酸合成、三磷酸甘油合成、甘油三酯組裝以及脂肪酸修飾、油體的形成等過程。但是控制油份積累的遺傳機制還不明了，在擬南芥中，有700個基因與油脂代謝有關(guān)，其中有70個以上基因參與油脂形成和積累，為油菜含油量的研究提供了研究基礎(chǔ)[6-7]。油菜種子含油量是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。在近18 a的研究中（2003—2020年），通過QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析，在油菜19條染色體（或連鎖群）上共發(fā)現(xiàn)了173個含油量性狀QTL[8]，據(jù)統(tǒng)計，這些QTL可解釋超過80%的遺傳變異[9]。同時，隨著多組學(xué)技術(shù)發(fā)展，油脂合成途徑上的基因及一些核心調(diào)控作用轉(zhuǎn)錄因子被克隆，油菜種子含油量性狀的遺傳機理得到進(jìn)一步挖掘。

理論上依據(jù)已克隆的含油量相關(guān)基因和QTL連鎖標(biāo)記可以輔助油菜高含油量育種，目前中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、貴州省油菜研究中心等單位開發(fā)了OilA5、BnOCN22-1、BnOCN22-2、BrSF34-123、QTL_A02_SNP、QTL_A09_SNP等6個用于高含油量性狀篩選分子標(biāo)記[10-14]，

分布于油菜A09/C08、A05、A02染色體上。但是油菜種子含油量不僅受種子胚遺傳效應(yīng)控制，還受到母體遺傳效應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)的影響。不同含油量油菜品系間的正反交試驗證實，雜種一代（F1）種子含油量母體基因型效應(yīng)平均值高達(dá)86%[15]，但在F2代時，母體效應(yīng)顯著下降。據(jù)這些研究預(yù)示，在不同遺傳背景下，不同標(biāo)記的篩選效率不同。

由湖南省作物研究所培育的“豐（灃）油”系列油菜品種，廣適、高產(chǎn)，在全國廣泛種植，但在長江中游地區(qū)含油量優(yōu)勢不足。因此，筆者以 “豐（灃）油”系列油菜品種的核心親本為研究對象，選擇高含油量株系為供體，利用前人研究結(jié)果[7]，針對性開發(fā)高含油量性狀單株選擇效率高的競爭性等位基因特異PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）標(biāo)記，助力于利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行高含油量親本培育，為提升該系列品種含油量提供分子標(biāo)記基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

由湖南省作物研究所選育的核心親本材料湘5B（縮寫X5B，別名20B），一般配合力高，但含油量僅為39.70%[16]；由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所通過小孢子培養(yǎng)選育的油菜品種中雙11號（ZS11），含油量49.00%以上。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建遺傳群體 為了驗證與含油量性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，以X5B為母本，ZS11為父本，人工雜交獲得F1群體，F(xiàn)1群體單株自交獲得202個單株的F2群體。親本及F1、F2群體種植于湖南省作物研究所試驗基地，廂寬1.9 m，行距33 cm。

1.2.2 分子標(biāo)記開發(fā) 基于Tang等利用重測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，在多年多點試驗中，A05染色體上qOC.A05.3 QTL位點在多環(huán)境中均能被檢測到與含油量性狀高度關(guān)聯(lián)[7]，效應(yīng)最大的SNP位點為20328897，位于BnaA05g28570D（Darmor V10基因組）基因內(nèi)?；谠撐稽c上下游序列，設(shè)計KASP標(biāo)記BN900125_K02。運用該標(biāo)記檢測X5B和ZS11基因型多態(tài)性。

1.2.3 F2群體基因型鑒定 在油菜苗期5葉期時，對F2群體進(jìn)行單株吊牌標(biāo)記，取葉片于96孔深孔板，提取DNA，利用標(biāo)記BN900125_K02鑒定各單株基因型。提取親本、F1及F2群體葉片DNA和KASP標(biāo)記分型工作由華智生物有限公司完成。

1.2.4 F2群體含油量分析 在2023年4月下旬，油菜角果成熟時，單株完全成熟時，分批進(jìn)行F2群體單株收獲，經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干后，按單株收獲自由授粉種子，晾曬至種子含水量8%以下，恢復(fù)到室溫后，用FOSS DS2500F近紅外分析儀檢測種子含油量。檢測時，每單株分別取3次樣進(jìn)行檢測，取算術(shù)平均值作為該單株含油量。

2 結(jié)果與分析

2.1 含油量KASP標(biāo)記開發(fā)及親本基因型鑒定

KASP標(biāo)記BN900125_K02序列如下：Primer_

Allele X：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCAATGACGTTCGGGTCA-3'；Primer_Allele Y：5'GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCAATGACGTTCGGGTCC-3'；Primer_Common：5'-GGGATATATGTGTTCAGGG

TGGTT-3'。

檢測位點為G、T，X5B基因型為TT，ZS11基因型為GG，F(xiàn)1代基因型為TG。具體KASP分型情況如圖1，圖中紅色為高油親本單株基因分型，藍(lán)色為低油親本單株分型，紫色為雜合單株，可能為雜株，灰色為無信號單株。由圖1可知，該標(biāo)記可有效分辨高油與低油親本。

2.2 F2遺傳群體構(gòu)建

以X5B為母本，ZS11為父本，進(jìn)行雜交，收獲F1代種子，播種后，利用BN900125_K02標(biāo)記鑒定真實雜交種植株，于初花期進(jìn)行套袋自交，收獲的種子于次年播種試驗田，共獲得202個單株的

群體。

2.3 群體含油量

在角果成熟后，收獲自由授粉種子198份，經(jīng)近紅外分析含油量發(fā)現(xiàn)，群體含油量平均為40.55%，最低值為31.68%，單株含油量最高49.87%，集中分布于39%～44%區(qū)間內(nèi)。從群體頻次分布（圖2）和單株含油量分析發(fā)現(xiàn)，含油量低于親本平均值的單株占群體92%，說明群體含油量性狀出現(xiàn)明顯偏分離，受母體效應(yīng)影響顯著高于父本。

2.4 F2群體基因分析結(jié)果

為了鑒定群體含油量連鎖位點基因型，利用KASP標(biāo)記BN900125_K02對202個F2單株進(jìn)行鑒定，去除未收到種子的4個單株基因型。將F2單株按不同基因型分組（圖3）。從圖3可以看出，GG基因型（父本）單株平均含油量極顯著高于TT基因型（母本）。雜合基因型間株平均含油量位于親本中間，更偏向于母本。

3 結(jié)論與討論

高產(chǎn)高油是油菜品種選育的長期目標(biāo)。含油量性狀遺傳機制復(fù)雜，且受環(huán)境因素影響大。常規(guī)育種手段難以短時間內(nèi)獲得突破。針對“豐（灃）油”系列品種在長江中游地區(qū)低含油量的現(xiàn)狀，該研究篩選利用前人全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，開發(fā)了與含油量控制基因連鎖的KASP標(biāo)記。該標(biāo)記在核心親本與高油供體親本構(gòu)建的F2群體中與含油量性狀分離，可用于將攜帶高含油量位點的株系中有利位點，轉(zhuǎn)育至該系列品種核心親本，從而獲得高含油量品種。

研究中構(gòu)建的F2群體，含油量性狀出現(xiàn)了嚴(yán)重向低油母本方向偏分離的現(xiàn)象。Wang等[15]在大量差異含油量株系正反交的試驗中，也觀察到了這一規(guī)律。也有研究表明，含油量遺傳主要受加性效應(yīng)控制[16]，但在該研究F2群體中含油量表現(xiàn)為受顯性效應(yīng)影響更多。主要表現(xiàn)母本對父本的顯性效應(yīng)。這可能是由于該標(biāo)記位于BnaA05g28570D基因內(nèi)，功能互補試驗發(fā)現(xiàn)，該基因可能過負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子LEC1，抑制含油量積累，降低種子內(nèi)的含油量[7]。由此推測該基因在低油親本中呈顯性，在高油親本中呈隱性。

高含油量品種的選育既要提高油份積累效率，又要保證其他農(nóng)藝性狀不受影響。但是無論是單獨提高油脂合成途徑中酶基因表達(dá)量，還是提升TAG組裝過程酶基因表達(dá)量，即使提高了種子含油量，植株生物量、抗逆性、產(chǎn)量等性狀常常會顯著下降。近年來，研究者開發(fā)了一些用于含油量篩選的分子標(biāo)記，但卻不能廣泛用于不同遺傳背景下高油品種的選育，主要是因為含油量控制位點多，各位點效應(yīng)不同，還可能相互影響。例如在A05染色體是該研究開發(fā)的KASP標(biāo)記附近100 kb，存在另一個含油量QTL，該QTL在不同環(huán)境中對含油量的貢獻(xiàn)效應(yīng)相反[7]。這為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了新的挑戰(zhàn)。

綜上，該研究開發(fā)的含油量性狀連鎖KASP分子標(biāo)記，為油菜品種選育提供了標(biāo)記基礎(chǔ)。但還需要針對核心親本背景進(jìn)行進(jìn)一步分析，總結(jié)已有含油量研究結(jié)果，綜合利用，開發(fā)多位點分子標(biāo)記進(jìn)行批量高含油量前景選擇，并同時進(jìn)行其他優(yōu)異性狀的背景篩選，快速轉(zhuǎn)育高含油量親本，為油菜高油育種打牢基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）

基金項目：湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金項目（2022CX84-12、2022CX132、2023CX92）；農(nóng)業(yè)生物育種重大項目（2022ZD0401703）；湖南省科技創(chuàng)新計劃項目（2021NK1004）

作者簡介：楊倩（1987—），女，四川岳池縣人，助理研究員，博士，主要從事油菜遺傳育種。

通信作者：王同華