淡亞彬+杜德志

摘要：在油菜育種過(guò)程中往往會(huì)應(yīng)用到一些指示性狀，旨在研究甘藍(lán)型油菜心葉顏色遺傳規(guī)律、篩選擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記。通過(guò)遺傳分析可知：甘藍(lán)型油菜的紫色心葉性狀受1對(duì)顯性基因控制，心葉紫色對(duì)心葉綠色呈顯性。用心葉紫色甘藍(lán)型油菜、心葉綠色甘藍(lán)型油菜構(gòu)建F2、BC1分離群體，通過(guò)AFLP、BSA相結(jié)合的方法共從512對(duì)引物組合中篩選到6個(gè)與心葉紫色連鎖的AFLP標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；心葉紫色；遺傳規(guī)律；AFLP

中圖分類(lèi)號(hào)： S634.303.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0090-03

油菜作為世界四大油料作物之一，在我國(guó)的種植分布很廣泛，同時(shí)在人們的日常生活中擔(dān)當(dāng)很重要的角色[1]。在油菜的各個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不同的性狀遺傳，其中出現(xiàn)在苗期的有紫紅色心葉、紫色真葉、紫色幼莖、花葉、刺毛等[2]，前三者作為指示性狀最方便，于幼苗早期（即出現(xiàn)1～5張真葉時(shí)）就能判斷是否為真雜種，可在幼苗早期拔出雜株，從而大大加快選擇效率。作為具備理想指示性狀的材料還需具備1個(gè)必備條件——該性狀受環(huán)境影響小，且表現(xiàn)穩(wěn)定，群體整齊一致，不出現(xiàn)農(nóng)藝性狀和標(biāo)記性狀分離的情況[3]。目前，已有育種單位選育出雙低甘藍(lán)型紫紅葉油菜材料[4]。

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，在不同階段所合成的葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素和花青素的量是不相同的，也正是這個(gè)原因，葉綠體中色素、液泡中色素的呈比例變化給我們呈現(xiàn)出不同的顏色。在紫葉李等一些植物的葉片中，由于液泡中花青素的含量比葉綠體內(nèi)色素的含量高很多，葉片才表現(xiàn)出花青素的本色——紅色[5]。也有研究表明：花色素苷的合成對(duì)于植物葉片顏色起到至關(guān)重要的作用?；ㄉ剀掌毡榇嬖谟谥参锏母鱾€(gè)部位，如花、果實(shí)、莖、幼苗甚至根中，主要分布于表皮細(xì)胞中?；ㄉ剀諏?duì)植物適應(yīng)環(huán)境的意義主要表現(xiàn)在提高光保護(hù)能力、提高抗旱能力以及提高抗凍能力[6]。

有關(guān)油菜葉色的遺傳分析最早可以追溯到1954年，Singh研究表明，芥菜型油菜紫葉性狀是由1對(duì)顯性基因控制的，紫葉對(duì)綠葉為顯性。Dixit等于1972年發(fā)現(xiàn)，芥菜型油菜的葉緣粉紅色性狀受1對(duì)顯性基因控制。1971年，Stringam等對(duì)白菜型油菜的紅色莖稈性狀進(jìn)行研究表明，該性狀同樣受1對(duì)顯性基因控制。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)甘藍(lán)型油菜葉色的研究也較多，但大都停留在基礎(chǔ)的遺傳分析上。貴州農(nóng)學(xué)院在1978年對(duì)部分甘藍(lán)型油菜紫色心葉的材料研究發(fā)現(xiàn)，該性狀是受1對(duì)顯性基因控制的，紫色心葉對(duì)綠色心葉為顯性。吳新杰等提到，莫鑒國(guó)于1992年發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜的紫葉性狀是不完全顯性遺傳，紫葉親本和綠葉親本雜交后，F(xiàn)1代出現(xiàn)了中間類(lèi)型[7]。黃澤素等于2006年發(fā)現(xiàn)，他們所獲得的紫紅葉甘藍(lán)型油菜的紫紅色受1對(duì)顯性基因控制[8]。涂金星通過(guò)對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）分子標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，紫稈與可育基因Ms1存在連鎖關(guān)系，交換值范圍為1.95%～850%[9]。呂九龍等在研究甘藍(lán)型葉色基因時(shí)采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記與BSA相結(jié)合的方法，共找到2個(gè)與紫葉基因Pur連鎖的標(biāo)記，且位于基因兩側(cè)[10-11]。

本研究所用的具有心葉紫色甘藍(lán)型油菜材料是經(jīng)過(guò)多代自交獲得的已穩(wěn)定的材料，且該性狀只是出現(xiàn)在幼苗早期，與那些將紫葉作為標(biāo)記性狀的材料相比對(duì)產(chǎn)量的影響要小。本研究主要目的是：通過(guò)觀察田間性狀表現(xiàn)，確定心葉紫色的遺傳規(guī)律；通過(guò)采用AFLP與BSA相結(jié)合的方法找到與紫色心葉GZX基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步克隆該基因打好基礎(chǔ)，進(jìn)而能夠應(yīng)用于分子輔助選擇育種中，加快育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料與群體構(gòu)建

4351、4361為心葉綠色親本，3230為心葉紫色親本（且紫色只在幼苗早期表現(xiàn)）由青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供，2個(gè)親本均經(jīng)過(guò)多代自交（6代以上），心葉顏色穩(wěn)定遺傳。

分別用4351、4361與3230進(jìn)行雜交（同時(shí)反交）。獲得的F1代單株與心葉綠色親本進(jìn)行回交，構(gòu)建BC1分離群體。同時(shí)將F1代中的部分心葉紫色單株套袋自交，獲得F2代分離群體。

1.2 心葉顏色遺傳規(guī)律的確定

于幼苗早期（1～5張真葉）在田間調(diào)查心葉紫色、心葉綠色單株的分離比，共設(shè)2個(gè)雜交組合，用卡方測(cè)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)分離比，確定其遺傳規(guī)律。

1.3 DNA的提取及樣品池的構(gòu)建

在油菜苗期，先掛牌，后在每個(gè)單株上取2～3 cm2新鮮嫩葉，用CTAB法提取葉片總DNA[12]。DNA濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)量，然后用TE緩沖液稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

根據(jù)幼苗早期心葉顏色的鑒定結(jié)果，分別隨機(jī)選取12個(gè)紫色心葉單株、12個(gè)綠色心葉單株，將其DNA分別等量混勻，構(gòu)成2個(gè)心葉紫色基因池、2個(gè)心葉綠色基因池。

1.4 AFLP分子標(biāo)記的篩選

酶切組合為PstⅠ+MseⅠ，AFLP引物和接頭由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。預(yù)擴(kuò)增所采用的引物組合為 P0/MG、P0/MC，以稀釋30倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為選擇性擴(kuò)增的模板，隨后選擇性擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)6%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)[14]。

1.5 差異片段回收、克隆和測(cè)序

將AFLP差異性片段從6% PAGE膠板上挖出并轉(zhuǎn)入1.5 μL 離心管中，加入30～50 μL ddH2O并用一次性無(wú)菌槍頭搗碎，于沸水中煮10 min后于4 ℃離心備用。吸取2 μL上清液作為模板，用原對(duì)應(yīng)引物重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，后用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒回收主帶。用純化后的目標(biāo)片段與 pMD18-T載體（TaKaRa）連接，隨后將連接液導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)液中加入約300 μL的LB液體培養(yǎng)基（未加Amp），150 r/min溫和搖振60 min。將200 μL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，倒置過(guò)夜，挑選單克隆菌斑于500 μL LB液體培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)。隨后對(duì)菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，將得到的陽(yáng)性克隆片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。具體過(guò)程參考李霞的方法[15]。

1.6 AFLP特異片段的序列分析

將篩選得到的與心葉紫色緊密連鎖的標(biāo)記相應(yīng)的序列信息提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源比對(duì)分析。選取比對(duì)結(jié)果中一致性高且E值小于10-7的同源位點(diǎn)，比較標(biāo)記位點(diǎn)與甘藍(lán)型油菜同源位點(diǎn)間的關(guān)系。

1.7 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

將所獲得的AFLP標(biāo)記在BC1分離群體中統(tǒng)一進(jìn)行單株檢測(cè)。為了便于單株基因型的確定并找出交換單株，在進(jìn)行群體檢測(cè)時(shí)將心葉紫色的單株和心葉綠色的單株進(jìn)行分組，得到基因型數(shù)據(jù)后用JoinMap 4 軟件構(gòu)建GZX基因所在位置的遺傳連鎖圖譜，確定各個(gè)AFLP 標(biāo)記與GZX在染色體上的遺傳圖距和排列順序。

2 結(jié)果與分析

2.1 心葉紫色基因的遺傳研究結(jié)果

由表1可知，無(wú)論是用作母本還是父本，用具有心葉紫色性狀的單株進(jìn)行雜交，雜種F1代均表現(xiàn)為心葉紫色，說(shuō)明沒(méi)有胞質(zhì)效應(yīng)，紫色對(duì)綠色為顯性。從回交1代BC1、雜種F2代的表型來(lái)看：回交后代中心葉紫色與心葉綠色植株比例為1 ∶1，F(xiàn)2代心葉紫色與心葉綠色植株的比例為3 ∶1。綜上可知，我們所獲得的心葉紫色甘藍(lán)型油菜的紫色心葉受1對(duì)顯性基因控制。

2.2 AFLP標(biāo)記的篩選

根據(jù)在油菜幼苗早期所鑒定的單株性狀，對(duì)所有單株進(jìn)行性狀分組，并構(gòu)建基因池。本研究選用512對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物（ P/MC、P/MG）。先用相對(duì)性狀所構(gòu)成的基因池對(duì)512對(duì)引物進(jìn)行初步篩選，共選出能夠區(qū)分出心葉紫色單株、心葉綠色單株的引物組合20對(duì)；將這20對(duì)引物繼續(xù)在由隨機(jī)選取的6個(gè)心葉紫色單株、6 個(gè)心葉綠色單株所組成的小群體中檢測(cè)，在檢測(cè)結(jié)果中共選出符合不超過(guò)2個(gè)重組單株標(biāo)準(zhǔn)的有6對(duì)引物，可認(rèn)為是與心葉紫色基因緊密連鎖的特異性標(biāo)記，可用于BC1大群體中進(jìn)一步篩選重組單株，分別命名為ZX1～ZX6。

2.3 AFLP 特異片段序列比對(duì)結(jié)果

將得到的6個(gè)AFLP特異片段經(jīng)回收、純化、克隆、測(cè)序后，在NCBI中進(jìn)行了Blast比對(duì)，其中只有2個(gè)片段得到了一致性較高的比對(duì)結(jié)果，分別是P10MC07（比對(duì)結(jié)果表明與A05同源）、P12MG04（與A7同源），其他4個(gè)特異片段均沒(méi)有比對(duì)到染色體上。

2.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

將在BC1群體192個(gè)單株中得到的所有檢測(cè)結(jié)果（純合記為A，雜合記為H，缺失記為“-”）導(dǎo)入到JoinMap4軟件中，分析6個(gè)特異性標(biāo)記與GZX之間的相對(duì)距離和位置關(guān)系。結(jié)果表明，ZX1～ZX5位于GZX同側(cè)，ZX6位于另一側(cè)；距GZX最近的標(biāo)記為ZX5，遺傳距離為1.5 cM；距GZX最遠(yuǎn)的標(biāo)記為ZX1，遺傳距離為7.8 cM；標(biāo)記間最小圖距為0.5 cM，最大圖距為12.2 cM（圖2）。

3 結(jié)論與討論

本研究于幼苗早期（1～5張真葉）分別觀察統(tǒng)計(jì)了2個(gè)分離群體的分離比，對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)后得出了一致的結(jié)果：心葉紫色性狀是由1對(duì)顯性基因控制的，這與前人的研究結(jié)果[7]一致。但是，前人只是停留在對(duì)該性狀的遺傳研究層面上，并沒(méi)有對(duì)該性狀進(jìn)行分子水平的研究，而本研究對(duì)心葉紫色性狀采用分子標(biāo)記的方法進(jìn)行初步定位，為以后更方便地應(yīng)用該性狀奠定了良好的基礎(chǔ)。

AFLP技術(shù)是一種檢測(cè)效率高、可靠性好、重復(fù)性高、多態(tài)性高的DNA指紋技術(shù)，自1995年出現(xiàn)以來(lái)被廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究、分類(lèi)和進(jìn)化等方面[16]。本研究采用AFLP與BSA相結(jié)合的方法，共獲得6個(gè)與心葉紫色基因緊密連鎖的且分布于GZX基因兩側(cè)的AFLP標(biāo)記，這為后續(xù)遺傳圖譜的加密做好了基礎(chǔ)工作。

本研究雖獲得了6個(gè)與GZX緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，但只有其中2個(gè)特異片段的比對(duì)結(jié)果較好，這樣一來(lái)所獲得的信息不足以確定目標(biāo)基因具體在哪一條染色體上，究其原因可能是所獲得的心葉紫色甘藍(lán)型油菜的遺傳背景較為復(fù)雜。

在對(duì)GZX基因進(jìn)行定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，交換單株過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致所得到的標(biāo)記與目標(biāo)基因之間距離過(guò)遠(yuǎn)。究其原因，可能是有的心葉紫色只表現(xiàn)在葉緣，還有一些單株的紫色褪去過(guò)早，從而導(dǎo)致在苗期鑒定時(shí)誤把心葉紫色的單株鑒定為心葉綠色的單株，這樣在進(jìn)行BSA法構(gòu)建基因池時(shí)，容易將性狀表現(xiàn)模糊的單株混入，大大影響引物篩選工作的準(zhǔn)確性，甚至根本找不到能真實(shí)顯示多態(tài)性的引物。最近的研究發(fā)現(xiàn)，糖在花色素苷合成中可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式增強(qiáng)一些酶的活性，以促進(jìn)花色素苷的合成[17]；史寶勝等研究光照對(duì)紫葉李葉片顏色的影響發(fā)現(xiàn)，充足的光照可以提高葉片中的碳水化合物含量，從而可以顯著促進(jìn)花色素苷的合成，使葉片的紫色更加鮮艷[18]。因此本研究提出以下建議：最好在日照充足、心葉紫色性狀表現(xiàn)充分的時(shí)候進(jìn)行鑒定，從而為后期的性狀分組、基因定位打好基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型心葉紫色油菜作為一種特殊的資源，在應(yīng)用研究中可以將控制心葉紫色的基因?qū)氲讲挥挡牧现?，這樣在苗期就能將母本中的雜株拔出，大大提高種子的純度；在測(cè)定一些品種或品系的自然異交率時(shí)，得到的后代中凡是帶有心葉紫色性狀的單株都屬于真雜種，這樣就能比較容易且準(zhǔn)確地得到該品種的異交率；鑒于本研究的試驗(yàn)材料具有只在苗期出現(xiàn)且只有心葉為紫色的特點(diǎn)，可以將其當(dāng)作一種觀賞性的油菜，結(jié)合合理布局，能夠創(chuàng)造出一種特殊的視覺(jué)效果，從而為當(dāng)?shù)芈糜卧黾有碌膭?chuàng)收點(diǎn)。

在苗期進(jìn)行心葉顏色調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)雜交組合F1代所表現(xiàn)的紫色的程度有所不同，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的內(nèi)在原因在本研究中沒(méi)有涉及，下一步試驗(yàn)將會(huì)著重探究?？紤]到調(diào)查心葉紫色性狀分離時(shí)所遇到的困難，下一步將會(huì)重點(diǎn)研究影響心葉紫色性狀表現(xiàn)的因素，從而為提高鑒定性狀的準(zhǔn)確率提出較為合理的策略。

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