摘要：由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的辣椒疫病是一種危害嚴(yán)重的土傳病害，為了篩選抗辣椒疫病的辣椒種質(zhì)資源，試驗(yàn)以31份辣椒種質(zhì)資源為材料，在溫室栽培條件下，采用灌根法接種辣椒疫霉菌，鑒定各材料對辣椒疫病的抗性級別，鑒定結(jié)果為：不同辣椒種質(zhì)資源材料之間的抗性有明顯差異，病情指數(shù)在0～94之間；表現(xiàn)為高抗材料7份、抗病材料2份、中抗材料9份、感病材料10份。

關(guān)鍵詞：辣椒疫霉菌；辣椒疫??；抗??；種質(zhì)資源

中圖分類號：S436.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1006-060X（2024）04-0067-05

Screening of Pepper Germplasm Resources Resistant to Phytophthora Blight

ZHANG Jing-wen1，2，ZHANG Zhuo2，ZHAO Zhi-xiang3，4，ZHANG Yu-han2，ZHOU Qian1，LIU Yong2

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Institute of Plant Protection， Changsha 410125， PRC; 3. Institute of Plant Protection， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Research Center of Quality Safety and Standards for Agro-Products， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， PRC; 4. Key Laboratory of Plant Disease and"Pest Control of Hainan Province， Haikou 571100， PRC）

Abstract： The pepper phytophthora blight caused by Phytophthora capsici is a serious soil-borne disease. In order to screen the pepper germplasm resources resistant to phytophthora blight， using 31 pepper germplasm resources as materials， the root irrigation method was adopted for the inoculation of Phytophthora capsici， and then the resistance levels of each material to pepper phytophthora blight were identified under greenhouse cultivation conditions. The results showed that there was a significant difference in resistance levels among different materials， with the disease index ranging from 0 to 94. Based on the expression of resistance， seven highly resistant materials， two resistant materials， nine moderately resistant materials， and ten susceptible materials were selected.

Key words： Phytophthora capsici; pepper phytophthora blight; disease resistance; germplasm resources

辣椒（Capsicum annuum L.）是目前我國種植范圍最廣的蔬菜[1]，也是消費(fèi)量最大的辛辣調(diào)味品加工原料，年種植面積穩(wěn)定在210萬hm2以上，其總產(chǎn)量可以達(dá)到6 400萬t，占世界辣椒總產(chǎn)量的50%[2]。但由于我國長期大面積集約化種植辣椒，并且連作的頻率高，導(dǎo)致土壤退化，辣椒土傳病害嚴(yán)重。尤其是以辣椒疫病、辣椒病毒病、辣椒細(xì)菌性瘡痂病和辣椒炭疽病等為主的辣椒病害，造成了辣椒產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降，嚴(yán)重威脅辣椒產(chǎn)業(yè)的安全與可持續(xù)發(fā)展[3]。

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的一種毀滅性土傳病害，主要危害辣椒葉片、果實(shí)和莖，一般可造成其減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上，甚至絕收，嚴(yán)重影響了辣椒的產(chǎn)量[4-7]。此外，辣椒疫霉菌的寄主十分廣泛，不僅能侵染辣椒，還能夠侵染并危害番茄、茄子、南瓜、黃瓜、葫蘆等茄科及葫蘆科和豆科等15個(gè)科的多種作物[8-9]。這種病原菌能在土壤中長期存活，侵染作物后潛育期較短，發(fā)病快，一旦傳入就難以根治，會(huì)造成作物大面積減產(chǎn)甚至死亡，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10-12]。因此，研究辣椒疫病的防控方法意義重大。

目前辣椒疫病的防治主要依靠化學(xué)防治。然而，化學(xué)防治不僅會(huì)造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，并且由于辣椒疫霉菌的高變異性使其能夠快速適應(yīng)不利條件，從而降低殺菌劑防控病害的有效性。長時(shí)間使用單一化學(xué)農(nóng)藥會(huì)誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性，且影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，造成土壤肥力下降和嚴(yán)重的環(huán)境污染[14]。

減少或取代化學(xué)藥劑是今后辣椒疫病防治的發(fā)展趨勢，選育抗疫病種質(zhì)材料是防治辣椒疫病最高效、經(jīng)濟(jì)、安全的方法之一?？共∑贩N選育的基礎(chǔ)是辣椒種質(zhì)資源的篩選、抗性鑒定以及雜交育種[15]，中國并非辣椒起源地，種質(zhì)資源較為匱乏。近年來中國辣椒進(jìn)出口規(guī)模雖在不斷擴(kuò)大，但對于種質(zhì)資源的引進(jìn)、收集以及研究深度還不夠，尤其是針對野生型和特異性資源的挖掘和利用能力的欠缺[16-17]。當(dāng)前中國市場對辣椒抗病品種的需求越來越大，抗病育種和抗病機(jī)制研究仍然是辣椒育種的重點(diǎn)和難點(diǎn)[18]。但由于中國辣椒種質(zhì)資源有限、抗病基因單一、主要病害的國內(nèi)研究較少、很多品種的抗病性利用不夠、抗病性狀難以區(qū)分，缺乏系統(tǒng)體系結(jié)構(gòu)，使得辣椒抗病育種深入研究難度加大。此外，由于前沿技術(shù)與育種實(shí)際結(jié)合不足，種源精準(zhǔn)挖掘、鑒定、評價(jià)和檢測技術(shù)相對滯后，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)種源利用率低。在雜交育種領(lǐng)域，目前雜交育種技術(shù)已相對成熟穩(wěn)定地應(yīng)用于蔬菜，一些發(fā)達(dá)國家針對辣椒分子標(biāo)記育種的研究也已應(yīng)用于抗病育種和品質(zhì)育種[19]。中國的分子標(biāo)記技術(shù)起步較晚，近年來，在辣椒遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和基因精細(xì)定位等方面雖已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍然存在標(biāo)記數(shù)量較少、種類單一、成本較高等問題[20]。另一方面由于辣椒基因組相對較大，盡管已有全基因組序列和基因組編輯工具，但由于缺乏穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，辣椒的基因編輯仍處于起步階段。

鑒于上述情況，試驗(yàn)旨在對辣椒資源進(jìn)行抗疫病鑒定，從中篩選出抗性較強(qiáng)的抗疫病資源，為辣椒疫病的防治提供可靠的抗病資源，在抗疫病種質(zhì)遺傳多樣性研究方面具有重大意義，同時(shí)為辣椒種質(zhì)創(chuàng)新和抗疫病育種打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

1.1.1 辣椒種質(zhì)資源 資源編號2021Z1—2021Z31，共31份，試驗(yàn)編號按順序編為1～31號，供試材料均由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所鄭井元研究員提供。

1.1.2 育苗基質(zhì) 由山東省農(nóng)科院園藝技術(shù)推廣中心提供。

1.1.3 病原菌 辣椒疫霉菌XY3（P. capsici strain XY3）由湖南省植物保護(hù)研究所光合細(xì)菌課題組提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮沸取汁、20 g葡萄糖、20 g瓊脂加純水定容至1 L。V8培養(yǎng)基：V8果汁100 ml、碳酸鈣1 g、過濾后加純水定容至1 L。

1.1.5 試驗(yàn)地點(diǎn) 湖南省農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)大樓負(fù)一樓溫室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒、催芽 超凈臺(tái)操作，將辣椒種子倒入無菌的三角瓶中，加入75%乙醇浸泡5～15 s，用滅菌水清洗一次10～20 s；再用1% NaCIO溶液消毒14～15 min，用滅菌水沖洗6次以上，一次10～20 s。

將消毒好的種子放在無菌濾紙上吸干水分，再轉(zhuǎn)到裝有鋪好無菌水浸濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至辣椒種子全部發(fā)芽。

1.2.2 辣椒苗培養(yǎng) 用12孔育苗盤播種育苗，每孔保1株苗。每個(gè)材料栽7盤，其中6盤接種病原菌、1盤用于對照。在26 ℃恒溫溫室中進(jìn)行育苗、接種操作，光照14 h，黑暗10 h交替進(jìn)行，待辣椒幼苗長至6片真葉時(shí)接種病原菌。

1.2.3 疫霉孢子懸浮液制備 辣椒疫霉菌培養(yǎng)及孢子懸浮液制備方法參考張卓、沼澤紅提供的方法[8]。將實(shí)驗(yàn)室保存的辣椒疫霉菌XY3菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，用打孔器在菌落邊緣打8～10塊菌絲塊，移至滅菌培養(yǎng)皿中，倒入V8液體培養(yǎng)基蓋過菌絲塊，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)2～3 d，用無菌水洗滌3次，重新倒入無菌水蓋過菌絲，再放入28 ℃培養(yǎng)箱連續(xù)光照2～3 d，至顯微鏡下觀察有大量的孢子囊形成時(shí)，將培養(yǎng)皿放入4 ℃冰箱預(yù)冷30～45 min，然后移至室溫促使游動(dòng)孢子釋放，待游動(dòng)孢子充分釋放后，將培養(yǎng)皿中液體先用3層紗布過濾，再用3層Miracloth神奇濾布過濾，得到孢子懸浮液。然后將孢子懸浮液4 ℃、3 000 r/min離心5 min棄上清液，沉淀的孢子用無菌水重懸后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，3次計(jì)數(shù)后計(jì)算平均值。根據(jù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板公式得出孢子懸浮液孢子濃度，調(diào)至濃度為1×105 CFU/mL辣椒疫霉菌XY3孢子懸浮液備用。

1.2.4 辣椒疫霉菌接種 采用灌根法對6葉期辣椒進(jìn)行辣椒疫霉接種實(shí)驗(yàn)。移液槍吸取1 mL上述辣椒疫霉菌XY3孢子懸浮液，在辣椒根部接種，用同一材料不接種辣椒疫霉菌作為對照。接種7 d后調(diào)查辣椒疫病發(fā)病情況，評價(jià)辣椒材料抗疫病等級。

1.3 病情分級及抗病等級劃分

病情分級及抗性等級劃分參照何烈干、馬輝剛、陳學(xué)軍等提供的方法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)采集

按照表1標(biāo)準(zhǔn)，對接種辣椒疫霉菌7 d后的辣椒幼苗進(jìn)行病情調(diào)查。每個(gè)辣椒資源共調(diào)查72株

幼苗。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021和IBM SPSS Statistics 26對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫病抗病資源篩選結(jié)果

由表2可得，高抗材料有7個(gè)，分別是7號、8號、14號、20號、29號、30號和31號?？共〔牧嫌?個(gè)，分別是5號和16號。中抗材料有9個(gè)，分別是1號、3號、6號、10號、11號、19號、21號、22號和25號。感病材料有10個(gè)，分別是2號、4號、9號、12號、13號、15號、17號、18號、26號和27號。

2.2 不同品種發(fā)病率和病情指數(shù)

綜合圖1、圖2的差異水平與表2結(jié)果分析可得，高抗辣椒材料7號、8號、14號、20號、29號、30號、31號之間的發(fā)病率和病情指數(shù)均無顯著差異，發(fā)病率均顯著低于其他抗性材料；除高抗7號與抗病5號的病情指數(shù)無顯著差異外，其他高抗材料的病情指數(shù)均顯著低于其他抗性材料。說明在相同侵染條件下，7號相較于其他高抗材料更容易被辣椒疫霉菌侵染?？共〔牧?號和16號，病情指數(shù)無顯著差異，但發(fā)病率差異顯著，16號的發(fā)病率顯著高于5號，即16號更易被辣椒疫霉菌侵染。9個(gè)中抗材料1號、3號、6號、10號、11號、19號、21號、22號和25號中，1號和21號的發(fā)病率無顯著差異，但與其他材料的發(fā)病率差異顯著。1號與10號的病情指數(shù)差異顯著，但與其他材料無顯著差異。10個(gè)感病材料中，4號和26號的癥狀最嚴(yán)重，4號的發(fā)病率和病情指數(shù)達(dá)到100%和93.33，26號的發(fā)病率和病情指數(shù)達(dá)到96.67%和94。中抗材料1號的發(fā)病率在90%以上，說明1號雖然對辣椒疫霉有一定抗性，但容易被辣椒疫霉菌侵染。

3 討論

1918年辣椒疫病首次在美國發(fā)現(xiàn)，并迅速傳播至全世界，其病原菌可以在土壤中長期存活，一旦傳入就難以根治，易對作物產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[22]。防治辣椒疫病最高效，經(jīng)濟(jì)安全的方法之一是選育抗疫病品種，而鑒定抗疫病的種質(zhì)資源，對抗病品種利用與選育具有重要的意義[23]。

目前，針對辣椒資源辣椒疫霉菌抗病性評價(jià)已經(jīng)有很多的報(bào)道。徐曉美等[15]用改良后的辣椒疫病灌根接種法鑒定了96份辣椒種質(zhì)材料的抗性等級，篩選出免疫材料1份，高抗材料6份，抗病材料24份，感病和高感材料分別有53份和12份。王鐸

等[24]采用人工接種方法對43個(gè)辣椒自交系進(jìn)行抗性鑒定，43個(gè)自交系材料中，高抗有20個(gè)，抗病有6個(gè)，中抗11個(gè)，感病有5個(gè)。孫平平等[25]采用灌根接種法，對28份種質(zhì)資源進(jìn)行辣椒疫霉菌抗病性評價(jià)，其中高抗6份，中抗和高感材料分別為1份和21份。李屹等[26]對63份辣椒材料及4個(gè)品種進(jìn)行疫病抗性鑒定，結(jié)果表明，67份辣椒材料中，沒有高抗品種，抗病材料11份，中抗材料35份，感病材料21份。蓬桂華等[27]在供試的貴州地方30個(gè)辣椒材料中，篩選出抗性材料1份，中抗材料9份，中感材料9份，感病材料8份和高感材料3份。

研究采用孢子懸浮液灌根接種的方法，該方法操作比較繁瑣，并且易受自然因素影響，大范圍開展較為困難，故簡單有效地對辣椒材料的抗病性進(jìn)行初步篩選顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，辣椒抗病性與其葉片中的易溶性蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)[28]，而辣椒苗期抗疫病能力與莖和根組織中可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)，與葉片中可溶性糖含量極顯著正相關(guān)[27-29]；此外，抗病及耐病辣椒幼苗葉片中Chla 含量、POD、PAL、PPO、SOD、CAT活性以及根部PAL、PPO 活性均高于感病品種，而辣椒幼苗葉片的抗疫病能力與類胡蘿卜素含量呈顯著負(fù)相關(guān)[27-30]。

因此，今后進(jìn)一步研究接種疫霉菌后辣椒植株糖及色素含量、根系活力、酶活性等指標(biāo)的穩(wěn)定性及動(dòng)態(tài)變化，為辣椒抗疫病種質(zhì)快速篩選提供判斷依據(jù)。

試驗(yàn)對31份辣椒種質(zhì)進(jìn)行抗疫病鑒定，結(jié)果顯示，不同材料之間的抗性有明顯差異，病情指數(shù)在0～94之間；表現(xiàn)為高抗材料有7份、抗病的材料2份、中抗的有9份。該結(jié)果可為辣椒種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育提供抗疫病種質(zhì)資源支持。

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（責(zé)任編輯：謝培庚）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32272517）；海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KF2022HN01）；海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果蔬重大病蟲害安全防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（HAAS2023TDYD12）

作者簡介：張婧文（1998—），女，湖南長沙市人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。

通信作者：劉勇